本發(fā)明屬于水環(huán)境中痕量fe²⁺比色檢測領域，特別涉及一種水溶性長波長吸收染料的制備及其比色法檢測水環(huán)境中痕量fe²⁺的方法。

背景技術：

鐵是地殼含量第二高的金屬元素，也是生物體主要的組成元素之一。以人體為例：成人體內約有4-5克鐵，其中72％以血紅蛋白、35％以肌紅蛋白、0.2以其它化合物形式存在，等等。fe是生物體中血紅蛋白的重要部分，是向細胞生命體提供氧氣，并將產生的二氧化碳帶出細胞的必要元素之一。鐵元素在醫(yī)藥上作抗貧血藥、局部收斂劑及補血劑，可用于子宮肌瘤引起的慢性失血；分析試劑及制鐵氧體原料；作為飼料添加劑的鐵強化劑；農業(yè)上可用作農藥，能防治小麥黑穗病，蘋果和梨的疤痂病、果樹的腐爛??；食用級用作營養(yǎng)增補劑，如鐵質強化劑、果蔬發(fā)色劑。fe²⁺與免疫的關系也比較密切，在提高機體的免疫力、增加中性白細胞和吞噬細胞的吞噬功能、和增強機體的抗感染能力的同時，亞鐵離子對呼吸道有刺激性，吸入引起咳嗽和氣短，對眼睛、皮膚和粘膜有刺激性；誤服引起虛弱、腹痛、惡心、便血、肺及肝受損、休克、昏迷等，嚴重者可致死。因此，fe²⁺含量的檢測具有重要理論和實踐意義。盡管近年來fe²⁺的分析手段取得了較大進展，設計并提出了不同的分析方法，如熒光光譜法、液相色譜法、電分析方法等。但是，這些方法中大多數測試過程復雜，包括繁瑣的實驗程序、樣品預處理難，靈敏度及選擇性不高，耗時長，所需的儀器價格昂貴等缺點，限制檢測方法的實際應用。

比色檢測的方法，以其實驗成本低，操作過程簡單，尤其是可以通過裸眼代替復雜昂貴的分析儀器進行檢測，已引起國內外越來越多的學者的關注。如寧波大學危晶等人發(fā)明的“一種快速檢測鉛離子或者亞鐵離子的電增強顯色方法及其裝置”(專利申請?zhí)枺?012102048171)；常州釔金環(huán)?？萍加邢薰痉读x春等人發(fā)明的“一種快速檢測鍍鋅液中亞鐵離子含量的比色方法”(專利申請?zhí)枺?016103018171)；laschuk等(materdesign,2016,107,18)開發(fā)了一種基于tio2的比色傳感材料，裸眼檢測fe²⁺的檢測限可達0.3ppm；等等，充分證明了比色傳感器是一類充滿希望、方便、實用的fe²⁺離子檢測方法。

為了進一步提高水相中fe²⁺比色檢測的選擇性和靈敏度，消除紫外及短波長可見光背景吸收的干擾，本發(fā)明設計了一種藍光吸收染料：3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸，將苯胺和萘生色團通過偶氮基團和氫鍵雙功能基團偶聯，集–so3h,–ohand–n＝n–和氫鍵等多種活性基團于一體，不僅穩(wěn)定性大大提高，由于共軛剛性平面的增強，光譜吸收峰明顯紅移到606nm。對其光譜性能，尤其是對亞鐵離子選擇性比色傳感性能優(yōu)化的基礎上，將所設計的一種藍光吸收染料：3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸有效地應用到環(huán)境水樣中痕量fe2+離子的比色檢測上，其他常見的共存離子對fe²⁺的比色檢測無干擾，檢測的線性范圍3.0～190×10^–7mol/l，相關系數(r)0.995，檢測限39nmol/l。

技術實現要素：

發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種水溶性長波長吸收染料的制備及其比色法檢測水環(huán)境中痕量fe²⁺的新方法，該方法具有操作簡單，選擇性好，靈敏度高等優(yōu)點，可在中性或弱堿性條件下，準確的用于環(huán)境水樣品中痕量fe2+的定量測定。

一種長波長吸收比色法檢測水環(huán)境中痕量fe²⁺的方法，包括以下操作步驟：

1)水溶性顯色劑3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料的制備

分別稱量取0.468g4-氨基-1-萘磺酸于50ml圓底燒瓶中，加入5ml水，10ml乙醇和2mldmf，超聲溶解后置于冰水浴中冷卻，并加入5滴濃鹽酸確保強酸性；緩慢滴加0.152g亞硝酸鈉水溶液2ml,并反應30min，冰水浴條件下，加入0.33gn-乙基-n-羥乙基苯胺水溶液5ml，并控制ph為6.6；室溫反應2h，抽濾，得粗產物，再經乙醇重結晶3次，得深藍色晶體；

2)水溶性顯色劑標準溶液的配制

稱取上述深藍色晶體0.01g，溶于100ml雙重蒸餾水中，配制成濃度為2.41×10^–4mol·l^–1的水溶性3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料的標準溶液，在4℃下避光保存?zhèn)溆茫?/p>

3)fe²⁺標準溶液的配制

稱取feso4·7h2o晶體0.0278g，溶于100ml雙重蒸餾水中，配置成濃度為1.0mmoll^–1的fe²⁺標準溶液，在4℃下保存；

4)環(huán)境水樣的制備

隨機量取三處環(huán)境的水各1000.0ml，分別依次用孔徑為4μm的微孔過濾膜過濾除去懸浮固體，再通過減壓蒸餾濃縮到10.0ml，得環(huán)境水樣后，分別標記為水樣1、水樣2和水樣3，室溫下保存?zhèn)溆茫?/p>

(5)待測樣品中fe²⁺濃度的測定

向10ml的容量瓶依次加入濃度為2.41×10^–4mol/l的水溶性3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料標準溶液1.0ml、ph值為9.0的混合磷酸鹽緩沖溶液1.0ml和待測樣品1.0ml，最后加雙重蒸餾水定容至刻度線，搖勻，試劑空白作參比，1cm比色皿，606nm波長處測定溶液的吸光度，計算得待測樣品中fe²⁺濃度。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中的水溶性顯色劑3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料系通過偶氮基團和氫鍵的雙重作用，將生色團苯胺和萘基團偶聯起來，不僅具有剛性平面結構，共軛強度大，穩(wěn)定性也大大提高。

優(yōu)選地，所述步驟1)中的顯色劑4-(4-羥基-1-萘基偶氮)苯磺酸比色染料在606nm處有強吸收，吸光系數3.92×10⁴l·mol^-1·cm^-1。

優(yōu)選地，所述步驟1)中的水溶性顯色劑3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料是在冰水浴(0～5℃)條件下，以對4-氨基-1-萘磺酸、n-乙基-n-羥乙基苯胺和亞硝酸鈉為原料，攪拌反應2h制得。

優(yōu)選地，所述步驟1)中的顯色劑4-(4-羥基-1-萘基偶氮)苯磺酸比色染料是經減壓抽濾、洗滌，得粗產品，再用乙醇重結晶2次提純。

本發(fā)明從反應原理入手，討論了體系的溶劑效應、ph值、離子強度、反應時間及共存物質的干擾等影響因素，確定了最佳測試條件：指示劑濃度為2.41×10^-5mol/l，ph值為9.0的混合磷酸鹽緩沖溶液測試的靈敏度最高。

最佳測試條件下，本方法能排除其他常見共存離子對fe²⁺比色檢測的干擾，采用uv分析儀，甚至裸眼即可對fe³⁺檢測，檢測的線性范圍3.0～190×10^–7mol/l，相關系數(r)0.9952，檢測限39nmol/l，樣品中fe²⁺回收率98.7％～101.5％之間，相對誤差(rsd)小于3.1％。

本發(fā)明的有益效果，在中性或弱堿性ph條件下即時對水環(huán)境中痕量fe²⁺的比色分析檢測，顯色劑的水溶解性好、穩(wěn)定性高，吸光系數大，因此對痕量fe²⁺的比色檢測靈敏度高，重現性好，同時該方法使用的波長為606nm長波長的可見光，可有效減少背景干擾吸收的同時，對有機體無傷害，有望用于生物免疫分析、檢測等領域。

附圖說明

圖1為水溶性3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料合成路線；

圖2為水溶性3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料與fe²⁺作用機理；

圖3為不同溶劑對痕量檢測fe²⁺體系吸收光譜的影響；

圖4為ph對痕量檢測fe²⁺體系吸收光譜的影響；

圖5為不同的共存離子對痕量檢測fe²⁺體系的影響；

圖6為水溶性3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料對痕量檢測fe²⁺選擇性比色響應；

圖7為a為吸光度隨fe²⁺濃度的變化(fromuptodown:0,3,6,12,20,30,45,60,90,110,150,190×10^-7mol·l^-1)及b)線性關系曲線。

具體實施方式

實施例一

(1)水溶性顯色劑3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料的制備

分別稱取0.468g4-氨基-1-萘磺酸于50ml圓底燒瓶中，加入5ml水，10ml乙醇和2mldmf，超聲溶解后置于冰水浴中冷卻，并加入5滴濃鹽酸確保強酸性；緩慢滴加0.152g亞硝酸鈉水溶液2ml,并反應30min。冰水浴條件下，加入0.33gn-乙基-n-羥乙基苯胺水溶液5ml，并控制ph為6.6；室溫反應2h，抽濾，得粗產物，再經乙醇重結晶3次，得深藍色晶體，產率86.4％。

ir(kbr),υ(cm^-1):3430-3320(-oh),1624,1578,1526(ar),1376(ar-n(r1r)),1209(s＝o),1120(c-o)；1h-nmr(dmso-d6,500hz)δ(ppm):8.05(s,1h,ar-h),7.74(t,j＝7.5hz,1h,ar-h),7.63(t,j＝7.4hz,1h,ar-h),7.39(d,j＝7.8hz,1h,ar-h),7.30(d,j＝7.7hz,1h,ar-h),6.8(d,j＝6.7hz,1h,ar-h),6.31(d,j＝6.6hz,1h,ar-h),4.79(s,1h,ar-oh),3.6(m,j＝4.9hz,2h,-ch2oh),3.46(m,j＝4.8hz,2h,-ch2),2.09(m,j＝4.9hz,2h,-ch2),1.13(m,j＝4.8hz,3h,-ch3)；元素分析理論值(％)：c62.8,h5.27,n10.99,o20.92；實測值：c62.5,h5.35,n10.87,o21.67。

2)水溶性比色染料標準溶液的配制

稱取上述深藍色晶體0.01g，溶于100ml雙重蒸餾水中，配制成濃度為2.41×10^–4mol·l^–1的水溶性3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料的標準溶液，在4℃下避光保存?zhèn)溆茫?/p>

3)fe³⁺標準溶液的配制

稱取feso4·7h2o晶體0.0278g，溶于100ml雙重蒸餾水中，配置成濃度為1.0mmoll^–1的fe²⁺標準溶液，在4℃下保存，使用時稀釋到所需濃度；

4)環(huán)境水樣的制備

隨機量取三處環(huán)境的水各1000.0ml，分別依次用孔徑為4μm的微孔過濾膜過濾除去懸浮固體，再通過減壓蒸餾濃縮到10.0ml，得環(huán)境水樣分別標記為水樣1、水樣2和水樣3，室溫下保存，備用；

5)檢測條件的優(yōu)化

從反應原理入手，討論了溶劑效應體系的ph值、及共存物質的干擾等影響因素，確定了最佳測試條件：指示劑濃度為2.41×10^–5mol/l，ph值為9.0的混合磷酸鹽緩沖溶液測試的靈敏度最高，環(huán)境中常見的共存金屬離子對檢測的影響均在誤差范圍內。即最佳測試條件下，fe2+檢測的線性回歸方程為△a＝5.89×10^–3+1.31×10^–3c(10^–7mol/l)，檢測的線性范圍3.0～190×10^–7mol/l，相關系數(r)0.9952，檢測限39nmol/l，樣品中fe3+回收率98.7％～101.5％％之間，相對誤差(rsd)小于3.1％。

(6)待測樣品中fe2+濃度的測定

向10ml的容量瓶依次加入經稀釋濃度為2.41×10^–4mol/l水溶性3-羥基-4-(n-乙基-n-羥乙基苯基偶氮)萘磺酸染料的標準溶液1.0ml、ph值為9.0的混合磷酸鹽緩沖溶液1.0ml和待測樣品1.0ml，最后加水定容至刻度線，搖勻，試劑空白作參比，1cm比色皿，606nm波長處測定溶液的吸光度，吸光度差值△a＝a0-a，其中a0為標準溶液吸光度值，通過回歸方程為△a＝5.89×10^–3+1.31×10^–3c(10^–7mol/l)，計算得待測樣品中fe²⁺濃度。

該方法成功的用于對上述三類環(huán)境樣品中fe2+含量的檢測，結果見表1。樣品中fe2+回收率98.7％～101.5％之間，相對誤差(rsd)小于3.1％。

表1體系對環(huán)境樣品的檢測結果(n＝5)