本發(fā)明涉及用于去除蘇木精沉淀物的方法和試劑系統(tǒng)，并且特別是涉及使用所述試劑系統(tǒng)從自動染色設備中去除蘇木精沉淀物的自動方法。

背景技術：

包括蘇木精和曙紅(H&E)染色以及巴氏(PAP)染色的數(shù)種組織化學染色方案依賴于染料蘇木精對細胞和組織樣品的染色。特別地，細胞核的蘇木精染色被病理學家用于檢測腫瘤活檢組織樣品中惡性和/或轉(zhuǎn)移細胞的存在。

蘇木精是蘇木屬樹木的紅心材中發(fā)現(xiàn)的天然生成的化合物。蘇木精自身在水性溶液中是無色的，并且對組織組分的染色是非活性成分。但是，蘇木精的氧化產(chǎn)物，蘇木因，特別是在與媒染劑形成絡合物時，成為蘇木精染料溶液的活性染色組分。蘇木因通過暴露于空氣和陽光天然地生成。這種天然的過程稱為“熟成”，并且可以經(jīng)歷3個或更多個月以提供適用于細胞染色的溶掖。

自動染色程序和系統(tǒng)使用機械系統(tǒng)將染色溶液遞送至生物學樣品。標準蘇木因染色程序使用含有蘇木精-蘇木因和媒染劑的預混合原液。在這些預混合原液中形成沉淀物。這對于手動染色程序通常不是問題，其中載玻片在容器(諸如玻璃容器)中使用蘇木精染色溶液處理。然而，沉淀物對于自動染色系統(tǒng)來說是成問題的，其中沉淀物可以污染或者阻塞遞送管線，并使得清潔或者清洗遞送管線變得困難。這些蘇木精的變化以及染色溶液中的沉淀物可以導致染色不一致。例如，含有媒染劑的蘇木精染色原液通常會被允許熟化延長的時間段，以允許發(fā)展蘇木因-媒染劑絡合物。雖然這種方法可以允許良好的染色結(jié)果，但是其也導致不期望的沉淀物的形成。

自動H&E染色裝置由很多具有相當成本的部分組成。在管道、閥、分配歧管等的表面上積累的蘇木因沉淀物會對從載玻片沉淀物到干擾或阻塞蘇木精分配都產(chǎn)生影響。沉淀還通過與金屬的接觸而被加重。這對于含有金屬部件諸如具有非常小直徑開口的噴嘴和噴頭的自動系統(tǒng)來說是特別成問題的，其可由沉淀物阻塞。在載玻片沉淀物的情況中，所述影響低至對病理學家讀取載玻片產(chǎn)生妨礙，高至影響診斷應用。在染色模塊中大量積累的沉淀物可能需要替換部件，或者在最壞的情況中，替換整個染色模塊來修復這種問題。

沉淀物的問題可以通過使用某種溶解所述沉淀物的清潔溶液來解決。清潔溶液的化學品組成和物理性能必須要經(jīng)調(diào)整以適應染色模塊的設計，使得所述溶液可以與包括多個模塊部分的材料相容。其它的考慮因素例如腐蝕性和健康/安全性危害必須要從制造和客戶使用的角度牢牢記住。

用于去除蘇木精沉淀物的傳統(tǒng)清潔溶液通常會基于“酸醇(acid alcohol)”來建模，其組成包括在乙醇-水混合物(通常地，70％乙醇，30％水)中的低百分比的鹽酸(1-2％)。發(fā)現(xiàn)在丙二醇和水的混合物中包含鹽酸(約1％)的溶液溶解由蘇木精形成的沉淀物。沉淀物在該溶液中的溶解性被確定為約15毫克/毫升，并且在不存在主動混合時的溶解速率是相當?shù)偷?經(jīng)驗觀察)。在使用該清潔劑的實際實驗中，清潔劑與染色模塊的內(nèi)部部件的接觸時間可能是需要以天來計算的，從而有效地全部去除沉淀物。作為用于染色裝置或模塊的預防性維護清潔溶液，通過該傳統(tǒng)清潔劑來溶解沉淀物的緩慢速率長的不可接受。更高濃度的鹽酸將改善溶解速率以及總?cè)芙庑裕且愿鼜姷母g性和有害物質(zhì)為代價。

使用氯漂白劑(次氯酸鈉)從受影響的表面去除蘇木精染料也是已知的。然而，這些漂白劑溶液為腐蝕性的，并且對它們的操作可以是麻煩的并具有潛在安全危害，因為它們經(jīng)常會使衣物和其它紡織品褪色。另外，許多人對于從這些溶液放出的氯煙是敏感的。

對于該問題的更好的解決方案是使用更加有效的配方，其能夠以更大程度和更快的速率溶解沉淀物。因此，存在開發(fā)蘇木精/蘇木因沉淀物清潔系統(tǒng)和程序的需求，其與自動樣品處理裝置的內(nèi)部存儲容器、遞送線路和噴嘴相容。

已知過氧化氫為紡織品中氣味產(chǎn)生分子的強氧化劑。在處理受影響的具有氣味的紡織品過程中，過氧化氫將有氣味的沉淀物分子氧化為非沉淀化合物(non-malprecipitateous)。例如，寵物尿液沉淀物分子可被氧化并致使非沉淀化。處理方法通常會與清潔設備相組合，例如真空清潔器。因為過氧化氫的水性溶液在室溫下相對穩(wěn)定，并且過氧化氫除非被活化，否則基本上不會分解為氧氣和水，紡織品氣味去除方法提供了緩沖劑，在兩種試劑混合時活化過氧化氫。在已知的紡織品氣味去除處理中，液體緩沖劑通常為碳酸鈉。

發(fā)明概述

一種實施方式是從自動蘇木精染色裝置的內(nèi)部存儲容器、遞送線路、噴嘴和其它試劑遞送組件去除蘇木因沉淀物的方法。這可以通過在容器中將包含過氧化物和水的液體氧化組分和堿性組分的組合以形成蘇木因沉淀物去除溶液來實現(xiàn)，其具有pH為約8.9至10.5范圍。即，在容器中使液體氧化組分和堿性組分組合之前，它們以分開的組分提供。隨后將所述容器置于恰當?shù)奈恢?，以能夠使自動蘇木精染色系統(tǒng)的蘇木精分配組件接收溶液，并使其移動經(jīng)過那些分配組件的內(nèi)表面。自動染色系統(tǒng)被激活以將沉淀物去除溶液移至自動染色系統(tǒng)的蘇木精分配組件的內(nèi)表面，使所述內(nèi)表面與沉淀物去除系統(tǒng)接觸至少30分鐘。

另一種實施方式涉及沉淀物去除系統(tǒng)，其包括：包含過氧化物和水的液體氧化組分；和包含檸檬酸鈉和水的液體堿性組分，其中，液體氧化組分和液體堿性組分在與蘇木因沉淀物接觸之前，可組合以形成具有一定pH的溶液。

發(fā)明詳述

自動載玻片染色裝置提高組織學處理樣本的特定屬性(例如染色強度)的一致性和可控性。處理時間(即給定的組織學處理的持續(xù)時間)和處理溫度(即實施給定的組織學處理的溫度)為影響這些屬性的絕大多數(shù)(如果不是全部)的兩個變量。自動組織學系統(tǒng)通常包括促進處理時間和/或處理溫度一致性和/或可控性的特征。例如，這些系統(tǒng)中的至少某些包括具有能夠精確執(zhí)行受控液體分配和去除操作的處理頭的染色器裝置。這些染色器還可以具有可在提高的基線溫度下維持的內(nèi)部環(huán)境。如此構(gòu)建的這些和其它自動系統(tǒng)的性能(例如相對于質(zhì)量和/或多功能性)遠超過常規(guī)的自動“浸和泡(dip and dunk)”裝置的性能。

用于診斷組織進行染色的蘇木精溶液通常會遭受著所不期望沉淀物的形成。在執(zhí)行自動線性(浸泡)或手動染色的解剖病理學實驗室中，可以通過簡單地將沉淀物從溶液過濾出沉淀物并再次使用濾液進行染色或者使用新溶液替換舊溶液來干涉染色過程而控制沉淀物。用于容納溶液的容器表面上的任意沉淀物都可以通過化學清潔或者簡單地通過使用新的容器替換舊的容器來實現(xiàn)。

在自動H&E染色裝置中存在多個部件。多個部件可以具有相當?shù)某杀尽Ｔ诠艿?、閥、分配歧管等的表面上積累的蘇木精沉淀物可以對從載玻片沉淀物至干擾或阻塞蘇木精分配具有影響。在載玻片沉淀物的情況中，所述影響可以是低至產(chǎn)生妨礙，并高至影響診斷應用。在染色模塊中大量積累的沉淀物可能需要替換部件，或者在最壞的情況中，替換整個模塊來修復該問題。該問題可以通過使用某種溶解所述沉淀物的清潔溶液來解決。

該清潔溶液的化學品組成和物理性能必須要經(jīng)調(diào)整以適應染色模塊的設計，使得所述溶液可以與包括多個模塊部分的材料相容。其它的考慮因素例如腐蝕性和健康/安全性危害必須要從制造和客戶使用的角度牢牢記住。

本發(fā)明的沉淀物去除處理系統(tǒng)包括：包含過氧化物和水的液體氧化組分；以及堿性組分，其中，液體氧化組分相對于絡合組分分別地存儲。在與蘇木因沉淀物接觸之前，使沉淀物去除系統(tǒng)的每個組分組合以形成具有pH 9.5至10的溶液。通常地，液體氧化和堿性組分在容器中組合/混合以形成沉淀物去除溶液。沉淀物去除溶液容器可以是裝配至自動染色器的試劑接收位置的容器，或者所述容器可以是獨立的容器。如果所述容器為獨立容器，那么將需要軟管、管道或其它流體輸送方式以允許沉淀物去除溶液到達染色器流體分配裝置的內(nèi)表面。一旦沉淀物去除溶液已被制備，其將替代蘇木精試劑遍及自動染色器流體分配裝置，并隨后允許保持與試劑遞送組件的內(nèi)部流體通道接觸至少30分鐘。所述沉淀物去除溶液還可以被泵送(加壓)或抽吸(真空)以遍及自動染色系統(tǒng)的試劑分配裝置的內(nèi)表面，直至溶液容器已被清空。染色分配裝置隨后使用沉淀物去除溶液凈化和再填充，或者使用自動系統(tǒng)的標準染色試劑進行準備。

實施例

點樣測試實驗

獲得六個月的未開啟的蘇木精溶液瓶(＜1％蘇木精染料，＜4％硫酸鋁，＜0.1％碘酸鈉，＜1％對苯二酚，以及＜2％β-環(huán)糊精的二乙醇穩(wěn)定溶液)。將溶液由瓶中流出，并使用去離子水沖洗所述瓶三次。在所述瓶的內(nèi)部存在明顯的沉淀物殘留(在此蘇木精溶液與所述瓶的內(nèi)部接觸)。切開所述瓶并允許蒸發(fā)去離子水殘留物。獲得含有沉淀物殘留的瓶部分，并用于點樣測試。

將切開的瓶的部分放置于試驗臺上，使瓶部分的內(nèi)側(cè)向上。所述內(nèi)側(cè)為所述瓶部分的覆有沉淀物殘留的側(cè)面。將一滴測試清潔溶液置于所述瓶部分上，并保持15秒。15秒后，使用去離子水沖掉測試清潔溶液，并目視檢查測定點位，用于沉淀物去除的證明。

管道回路實驗

12英寸的全氟烷氧基聚合物(PFA)管部分填充有水性蘇木精溶液[25％乙二醇(v/v)，20mM蘇木精，3.3mM碘酸鈉，20mM十八水合硫酸鋁，85mM對苯二酚和10mM六十水合β-環(huán)糊精，pH為約2.5]。管道在其兩端連接有連接器以形成回路。管道回路被置于保持在60℃下的烘箱中，持續(xù)約14天。在這期間，熱量致使蘇木因沉淀并覆于管道回路的內(nèi)部。在加熱溫育期后，管道回路被移除，排干，并使用去離子水沖洗。隨后，使所述回路保持開啟并允許干燥。這在管道上留下了在所述管道內(nèi)壁覆有蘇木因沉淀物的深色涂層。

為了測試清潔溶液，使用測試清潔溶液填充預沉淀的管道回路，使之閉合以形成回路，并允許在室溫下靜置約1分鐘。隨后排干所述溶液，并使用去離子水沖洗所述管道。隨后，目視檢查所述管道，用于沉淀物去除的證明。

實驗1：

使用1∶1的3％過氧化氫溶液與0.5M碳酸鈉溶液的混合物的點樣測試實驗顯示出極佳的清潔結(jié)果。

實驗2：

執(zhí)行管道回路實驗，對比0.125M氯化鐵(III)溶液、1M磷酸鹽緩沖液(pH＝2)、0.64M磷酸溶液、0.1M鹽酸的50％丙二醇溶液、和3％過氧化氫-50g/L碳酸鈉溶液。3％過氧化氫-50g/L碳酸鈉溶液完全清潔試管。其它溶液均在管壁上留有沉淀物殘留。

實驗3：

執(zhí)行的點樣測試實驗，對比不同的雙組份過氧化物溶液。實驗設置和結(jié)果在表1中示出。

表1

實驗4：

執(zhí)行點樣測試實驗，對比0.2M草酸溶液、0.2M亞硫酸鈉溶液、0.2M焦亞硫酸鉀溶掖、和1M過硫酸鈉-10g/L碳酸鈉溶液。1M過硫酸鈉-10g/L碳酸鈉溶液和0.2M草酸溶液表現(xiàn)出極佳的清潔結(jié)果。其它溶液未顯示出清潔能力。

實驗5：

使用不同強度的過硫酸鈉和碳酸鈉溶液以1∶1混合來執(zhí)行改進的管道回路實驗(60分鐘清潔浸泡)。實驗設置和結(jié)果在表2中示出。

表2

實驗6：

使用用于提高過氧化氫溶液pH的不同堿來執(zhí)行管道回路實驗。實驗設置和結(jié)果在表3中示出。碳酸鹽和磷酸鹽的混合物作為堿與僅使用碳酸鹽相比似乎執(zhí)行的更好。

表3