一種血栓成分的染色方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一種血栓成分的染色方法及其應(yīng)用涉及醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種涉及血栓成分的化學(xué)染色方法和血栓成分的識(shí)別及血栓性質(zhì)的鑒定方法。其公開的一種血栓成分的染色方法是：對(duì)石蠟組織切片依次經(jīng)過(guò)脫蠟、水化后，利用鐵明礬水溶液媒染、蘇木精染色、苦味酸-橙黃G溶液染色、胭脂紅-品紅溶液染色、磷鎢酸分化顏色，使血栓中不同成分呈現(xiàn)不同顏色。本發(fā)明同時(shí)公開了其方法的血栓成分的識(shí)別及血栓性質(zhì)的鑒定方法，有效的根據(jù)血栓中不同成分呈現(xiàn)不同顏色，依據(jù)這些顏色和形態(tài)學(xué)，從而識(shí)別血栓成分、鑒定血栓性質(zhì)。
【專利說(shuō)明】一種血栓成分的染色方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種涉及血栓成分的化學(xué)染色方法和血栓成分的識(shí)別及血栓性質(zhì)的鑒定方法。

【背景技術(shù)】
[0002]在醫(yī)學(xué)標(biāo)本診斷及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，經(jīng)常需要對(duì)血栓進(jìn)行鑒定，此血栓鑒定可通過(guò)病理檢測(cè)完成，即通過(guò)血栓的染色和識(shí)別而鑒定血栓的成分，包括血栓中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板及纖維素或稱纖維蛋白組織；鑒定血栓的性質(zhì)，包括紅血栓、白血栓、混合血栓。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中涉及血栓的染色及識(shí)別技術(shù)主要有:(1)蘇木精-伊紅染色法(11611181:0^71111-208111 81:81111118)，簡(jiǎn)稱冊(cè)染色法:它是病理技術(shù)中最基本最常用的染色方法，廣泛應(yīng)用于各種組織細(xì)胞的染色，也用于血栓的染色。冊(cè)染色的染液中的蘇木精為堿性染料，使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體染成紫藍(lán)色；而染液中的伊紅為酸性，使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分染成紅色，故冊(cè)染色的優(yōu)點(diǎn)是僅用蘇木精和伊紅兩種染料、染色步驟較少、染色過(guò)程較快，只需1-2小時(shí)，能使無(wú)色切片的組織和細(xì)胞清晰顯示；缺點(diǎn)是，對(duì)于血栓來(lái)說(shuō)，除白細(xì)胞胞核被染成藍(lán)色，其它成分均被染成紅色，包括血栓中的紅血球、白細(xì)胞胞漿、血小板、纖維素成分，這些成分無(wú)法確切區(qū)分；(2)磷鎢酸蘇木素染色法'八!I法):它是用高錳酸鉀和草酸分別對(duì)切片進(jìn)行氧化漂白處理后，用磷鎢酸蘇木素染料浸染標(biāo)本24小時(shí)，使血栓成分中纖維素網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)團(tuán)塊物質(zhì)染成藍(lán)紫色，有利于辨別血栓甚至微小血栓，故法的優(yōu)點(diǎn)是可通過(guò)識(shí)別纖維素以鑒定血栓特別是微小血栓，缺點(diǎn)是染色時(shí)間長(zhǎng)，不能鑒定血栓中的其它細(xì)胞成分包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板8081-161:81116 (188)染色法:纖維素138染色法分別經(jīng)過(guò)天青石藍(lán)液染、蘇木素染液染、馬休黃液染、亮結(jié)晶紫猩紅染液染、磷鎢酸、苯胺蘭液染處理，將血栓中紅細(xì)胞染成黃色、白細(xì)胞核染成藍(lán)黑色、纖維素染成金黃至鮮紅色，此種染色法存在染色步驟繁多、不易操作、染色結(jié)果色彩斑斕、對(duì)比性差的缺點(diǎn)；(4)血細(xì)胞染色:例如過(guò)氧化物酶染色使藍(lán)色定位于細(xì)胞漿、過(guò)碘酸-雪夫染色紫使紅色定位于細(xì)胞漿中的糖原類物質(zhì)，但不能識(shí)別血栓中的纖維素。因此，現(xiàn)有血栓染色技術(shù)有待進(jìn)一步改進(jìn)和發(fā)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是:提供了一種簡(jiǎn)易操作、效果明顯和效率高的血栓染色方法，通過(guò)染色使血栓不同成分呈現(xiàn)不同顏色，通過(guò)區(qū)別顏色、結(jié)合形態(tài)學(xué)改變，識(shí)別血栓成分、鑒定血栓性質(zhì)、協(xié)助血栓的臨床診斷及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷。
[0005]本發(fā)明的目的可通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0006]一種血栓成分的染色方法，對(duì)石蠟組織切片依次經(jīng)過(guò)脫蠟、水化后，利用鐵明礬水溶液媒染、蘇木精染色、苦味酸-橙黃6溶液染色、胭脂紅-品紅溶液染色、磷鎢酸分化顏色，使血栓中不同成分呈現(xiàn)不同顏色。
[0007]本發(fā)明的目的還可通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]進(jìn)一步的，所述的組織切片在脫蠟和水化前先置于50-701溫箱中加溫25-60分鐘。
[0009]進(jìn)一步的，所述的脫蠟、水化過(guò)程包括依次將切片浸泡于100%酒精2-4分鐘兩次、95%酒精2-4分鐘兩次、70%酒精2-4分鐘兩次、188(11-18堿緩沖鹽溶液，或稱三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液)溶液2-4分鐘一次。
[0010]進(jìn)一步的，所述組織切片染色及分化顏色中，鐵明礬水溶液濃度為4-6%、作用時(shí)間為4-6分鐘；蘇木精溶液染色時(shí)間為4-6分鐘；苦味酸-橙黃溶液染色時(shí)間為30-60分鐘；胭脂紅-品紅溶液染色及磷鎢酸分化染色，時(shí)間均分別為4-6分鐘，各染色步驟間均用水清洗組織切片。
[0011]進(jìn)一步的，所述苦味酸-橙黃溶液的配制方法是:量取8-121111飽和苦味酸水溶液，加35-451111飽和苦味酸異丙醇溶液，再稱取0.5-1.橘黃^將三者混和、攪拌均勻。
[0012]進(jìn)一步的，所述胭脂紅-品紅溶液的配置方法是:稱取0.15-0.358胭脂紅、0.258酸性品紅，量取0.3-0.61111冰醋酸、40-6001蒸餾水，四者混和、攪拌均勻。
[0013]進(jìn)一步的，所述183溶液的配制方法是:在80001蒸餾水中溶解徹^01^0.28 1(01和如11*18堿，加入0.0158酚并用此1調(diào)至邱值至7.4，用蒸餾水定容至1匕分裝后于高壓下蒸汽滅菌20分鐘，室溫保存。或購(gòu)買商業(yè)成品的183溶液。
[0014]一種上述血栓成分的染色方法的應(yīng)用，通過(guò)對(duì)血栓成分染色方法后的組織切片進(jìn)行血栓成分的識(shí)別，識(shí)別方法為:血栓中圓形深紅染色者為紅細(xì)胞、圓形紅色細(xì)胞漿含藍(lán)色細(xì)胞核者為白細(xì)胞、不規(guī)則點(diǎn)狀深藍(lán)色者為血小板、網(wǎng)狀或絲狀紫紅色者為纖維蛋白組織。
[0015]一種上述血栓成分的染色方法的應(yīng)用，通過(guò)對(duì)血栓成分染色方法后的組織切片進(jìn)行血栓的性質(zhì)識(shí)別，該識(shí)別方法為:紅色血栓主要由纖維網(wǎng)眼內(nèi)充滿的大量正常血液分布的血細(xì)胞構(gòu)成；白色血栓主要由許多聚集呈珊瑚狀的血小板構(gòu)成、含少量紅細(xì)胞和纖維素；透明血栓主要由纖維素即纖維蛋白構(gòu)成；混合血栓由紅色與白色交替、形成層層相間條紋。
[0016]本發(fā)明的技術(shù)的具體方案是:(1)準(zhǔn)備標(biāo)本，將石蠟組織切成5110切片；(2)配制液體，分別配制苦味酸-橙黃6溶液和胭脂紅-品紅溶液，苦味酸-橙黃6溶液的配置方法是:101111飽和苦味酸水溶液、401111飽和苦味酸異丙醇溶液和0.18橘黃匕混合均勻；胭月旨紅-品紅溶液的配置方法是:0.258胭脂紅、0.258酸性品紅、0.5^1冰醋酸和49.5^1蒸餾水，混合均勻；(3)組織染色，加溫切片組織20-60分鐘后染色步驟如下:①切片常規(guī)脫蠟至水化或復(fù)水，依次100%酒精3分鐘2次、95%酒精3分鐘2次、70%酒精3分鐘2次、丁83溶液3分鐘1次，②5%鐵明礬水溶液媒染5分鐘后水洗；③蘇木精染色5分鐘后水洗苦味酸-橙黃6溶液染色45分鐘后水洗胭脂紅-品紅溶液染色5分鐘后水洗；⑥磷鎢酸分化顏色5分鐘后水洗；(4)封片，上述最后一步水洗后，切片置于空氣中2-5分鐘，使組織稍干燥，即滴加水水溶性封片劑)、覆蓋蓋玻片；(5)顯微鏡下觀察結(jié)果。
[0017]主要步驟的目的及操作注意事項(xiàng):①加溫切片的目的是(染色前的第一個(gè)步驟)使切片上的組織更牢固的粘附于載玻片上，使組織不易脫片，也有利于組織脫蠟；②脫蠟的目的是(緊隨加溫之后)切片組織經(jīng)梯度酒精脫蠟處理后，可將二甲苯徹底消除，使組織易于水化、有利于染色5%鐵明礬處理的目的是(切片在蘇木精染色之前用5%鐵明礬處理)避免細(xì)胞胞核著色不佳而發(fā)白和染色質(zhì)顆粒糊模不清的現(xiàn)象水洗的目的是(每一步實(shí)質(zhì)性染色之后)徹底清洗干凈染料，使下一步染料能夠干凈的發(fā)揮染色效果，而不至于染料混合影響染色效果。染色的注意事項(xiàng)是:除注意實(shí)質(zhì)性染料的染色時(shí)間外，水洗切片組織后進(jìn)行下一步染色時(shí)應(yīng)保持切片組織即勿太干燥又勿太潮濕，太干，可致組織收縮、變形，影響組織形態(tài)、干擾組織觀察；太濕，會(huì)使下一步使用的染液稀釋、降低染液的濃度和值，降低染色效果、影響染色質(zhì)量。避免組織太干太濕的方法是:用自來(lái)水清洗組織切片后，輕輕甩干、空氣自然干燥或用吸管小心吸去多余水分，且忌吸管接觸組織而吸去組織或破壞組織，
[0018]本發(fā)明的有益效果
[0019]1、本發(fā)明通過(guò)對(duì)石蠟組織切片依次經(jīng)過(guò)脫蠟、水化和利用鐵明礬水溶液媒染、蘇木精染色、苦味酸-橙黃6溶液染色、胭脂紅-品紅溶液染色、磷鎢酸分化顏色，使紅細(xì)胞及白細(xì)胞漿呈深紅色、白細(xì)胞核呈藍(lán)色、血小板呈深藍(lán)色、纖維蛋白組織呈紫紅色，使血栓中不同成分呈現(xiàn)不同顏色，依據(jù)這些顏色和形態(tài)學(xué)，從而識(shí)別血栓成分、鑒定血栓性質(zhì)。
[0020]2、本發(fā)明通過(guò)對(duì)石蠟組織切片依次經(jīng)過(guò)脫蠟、水化和利用鐵明礬水溶液媒染、蘇木精染色、苦味酸-橙黃6溶液染色、胭脂紅-品紅溶液染色、磷鎢酸分化顏色，使血栓中不同成分呈現(xiàn)不同顏色，與現(xiàn)有技術(shù)相比較，染色時(shí)間短，一般2-3小時(shí)即可，同時(shí)通過(guò)不同顏色和形態(tài)有效區(qū)分血栓成分、鑒定血栓性質(zhì)，有利于更好的為臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)服務(wù)。
[0021]3、本發(fā)明組織切片在脫蠟和水化前進(jìn)行溫箱加溫處理，由此使組織切片上的組織更牢固的粘附于載玻片上，使組織不易脫片，也有利于組織脫蠟。
[0022]4、本發(fā)明的切片組織經(jīng)梯度酒精脫蠟處理后，可將二甲苯徹底消除，使組織易于水化、有利于染色。
[0023]5、本發(fā)明的組織切片通過(guò)鐵明礬處理，有效的避免細(xì)胞胞核著色不佳而發(fā)白和染色質(zhì)顆粒糊模不清的現(xiàn)象。
[0024]6、本發(fā)明組織切片的各個(gè)染色步驟之間，均采用水洗，徹底清洗干凈組織切片上的染料，使下一步染料能夠干凈的發(fā)揮染色效果，而不至于染料混合影響染色效果。

【具體實(shí)施方式】
[0025]一種血栓成分的染色方法，其具體方法如下:
[0026]—、準(zhǔn)備標(biāo)本:1、取材:選擇需要檢測(cè)的病理標(biāo)本；2、固定:將標(biāo)本浸泡于10%福爾馬林液中24小時(shí)以上；3、包埋:將病理標(biāo)本包埋于石蠟塊中；4、切片:將標(biāo)本用石蠟標(biāo)本切割機(jī)切成常規(guī)切片；5、貼片:將組織切片平整的貼敷于載玻片上備用。
[0027]二、配制液體:1、188溶液的配制:在800^1蒸餾水中溶解氯化鈉財(cái):1上28氯化鉀和38 11-18堿，加入0.0158酚并用氯化氫此1調(diào)至邱值至7.4，用蒸餾水定容至1匕分裝后于高壓下蒸汽滅菌20分鐘，室溫保存?zhèn)溆?，或?gòu)買商業(yè)成品183溶液；2、苦味酸-橙黃6溶液的配制:分別量取101111飽和苦味酸水溶液及401111飽和苦味酸異丙醇溶液，稱取0.18橘黃(^，三者混和、攪拌均勻；3、胭脂紅-品紅溶液的配制:稱取0.258胭脂紅、0.258酸性品紅，量取0.51111冰醋酸、49.5^1蒸餾水，四者混和、攪拌均勻。
[0028]三、組織染色:1、將切片組織染色前先置于601溫箱中加溫20分鐘；2、脫蠟及水化:依次將切片浸泡于100%酒精各3分鐘2次、95%酒精各3分鐘2次、70%酒精各3分鐘2次、183溶液3分鐘；3、5%鐵明礬水溶液作用5分鐘后用水漂洗；4、蘇木精溶液染色5分鐘后用水漂洗；5、苦味酸-橙黃6溶液染色45分鐘后用水漂洗；6、胭脂紅-品紅溶液染色5分鐘后用水漂洗；7、磷鎢酸分化顏色5分鐘后用水漂洗，
[0029]四、封片:1、切片稍干燥:輕輕甩干、空氣自然干燥或用吸管小心吸去切片上的多余水；2、滴加1-2滴封片劑；3、覆蓋蓋玻片:切記避免蓋玻片與組織或載玻片之間出現(xiàn)空氣泡，以免影響觀察組織及影響美觀。
[0030]一種上述血栓成分的染色方法的應(yīng)用，將切片置于顯微鏡下觀察染色結(jié)果:即通過(guò)對(duì)上述染色方法后的組織切片進(jìn)行血栓成分的識(shí)別，識(shí)別方法為:血栓中圓形深紅染色者為紅細(xì)胞、圓形紅色細(xì)胞漿含藍(lán)色細(xì)胞核者為白細(xì)胞、不規(guī)則點(diǎn)狀深藍(lán)色者為血小板、網(wǎng)狀或絲狀紫紅色者為纖維蛋白組織；通過(guò)對(duì)上述染色方法后的組織切片進(jìn)行血栓的性質(zhì)識(shí)另I」，該識(shí)別方法為:紅色血栓主要由纖維網(wǎng)眼內(nèi)充滿的大量正常血液分布的血細(xì)胞構(gòu)成；白色血栓主要由許多聚集呈珊瑚狀的血小板構(gòu)成、含少量紅細(xì)胞和纖維素；透明血栓主要由纖維素即纖維蛋白構(gòu)成；混合血栓由紅色與白色交替、形成層層相間條紋。
[0031]通過(guò)上述對(duì)血栓成分和性質(zhì)的識(shí)別，結(jié)合臨床血栓的大小與形成部位做出正確診斷、指導(dǎo)臨床治療或判斷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，例如紅色血栓多發(fā)生于血流極度緩慢或停止之后；白色血栓多發(fā)生于血流速度較快的動(dòng)脈、心室部位；透明血栓多發(fā)生于微循環(huán)小血管內(nèi)，僅在顯微鏡下見到，故又稱微血栓；混合血栓常表現(xiàn)為血栓不斷形成的過(guò)程，多在二尖瓣狹窄和心房纖維顫動(dòng)時(shí)，左心房?jī)?nèi)形成的血栓。
【權(quán)利要求】
1.一種血栓成分的染色方法，其特征是:對(duì)石蠟組織切片依次經(jīng)過(guò)脫蠟、水化后，利用鐵明礬水溶液媒染、蘇木精染色、苦味酸-橙黃G溶液染色、胭脂紅-品紅溶液染色、磷鎢酸分化顏色，使血栓中不同成分呈現(xiàn)不同顏色。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述血栓成分的染色方法，其特征是:所述的組織切片在脫蠟和水化前先置于50-70°C溫箱中加溫25-60分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述血栓成分的染色方法，其特征是:所述的脫蠟、水化過(guò)程包括依次將切片浸泡于100 %酒精2-4分鐘兩次、95 %酒精2-4分鐘兩次、70 %酒精2-4分鐘兩次、TBS溶液2-4分鐘一次。(OK)
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述血栓成分的染色方法，其特征是:所述組織切片染色及分化顏色中，鐵明礬水溶液濃度為4-6%、作用時(shí)間為4-6分鐘；蘇木精溶液染色時(shí)間為4-6分鐘；苦味酸-橙黃G溶液染色時(shí)間為30-60分鐘；胭脂紅-品紅溶液染色及磷鎢酸分化染色，時(shí)間均分別為4-6分鐘，各染色步驟間均用水清洗組織切片。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述血栓成分的染色方法，其特征是:所述苦味酸-橙黃G溶液的配制方法是:量取8-12ml飽和苦味酸水溶液，加35-45ml飽和苦味酸異丙醇溶液，再稱取0.5-1.5g橘黃G，將三者混和、攪拌均勻。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述血栓成分的染色方法，其特征是:所述胭脂紅-品紅溶液的配置方法是:稱取0.15-0.35g胭脂紅、0.25g酸性品紅，量取0.3-0.6ml冰醋酸、40_60ml蒸餾水，四者混和、攪拌均勻。
7.—種血栓成分的染色方法的應(yīng)用，其特征是:通過(guò)對(duì)血栓成分染色方法后的組織切片進(jìn)行血栓成分的識(shí)別，識(shí)別方法為:血栓中圓形深紅染色者為紅細(xì)胞、圓形紅色細(xì)胞漿含藍(lán)色細(xì)胞核者為白細(xì)胞、不規(guī)則點(diǎn)狀深藍(lán)色者為血小板、網(wǎng)狀或絲狀紫紅色者為纖維蛋白組織。
【文檔編號(hào)】G01N1/30GK104458386SQ201410693206
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月25日
【發(fā)明者】李君 , 沈粵春, 陸東風(fēng), 李新春 申請(qǐng)人:廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院