本發(fā)明涉及核磁共振(nuclearmagneticresonance，nmr)波譜學(xué)檢測(cè)方法，尤其是涉及實(shí)時(shí)監(jiān)控乳狀液相分離過程的核磁共振空間分辨譜方法。

背景技術(shù)：

乳狀液是由兩種不混溶液體制成的亞穩(wěn)態(tài)膠體，一種液體在表面活性劑的存在下分散在另一種液體中。由于增強(qiáng)親脂性成分的溶解性和生物活性的優(yōu)點(diǎn)，o/w乳狀液已廣泛用于各種領(lǐng)域，包括食品(lobato-calleros等人，2008；relkin，shukat，peyronel，和meneau，2014)和制藥工業(yè)等(kabri，arab-tehrany，belhaj，&linder，2011；onuki，kida，funatani，hayashi，&takayama，&zhong，2015)。了解乳狀液的形成過程對(duì)于理解乳液的穩(wěn)定性和相分離進(jìn)程具有重要意義。研究乳狀液結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的傳統(tǒng)方法包括光散射(vangruijthuijsen，rufier，phou，obiols-rabasa，&stradner，2012；warisnoicharoen，lansley，&lawrence，2000)顯微鏡，(vakarelski等，2010)電導(dǎo)率測(cè)量(charin，farias，tavares，&nele，2016)和流變技術(shù)(alam&aramaki，2008)等。這些方法可提供包括乳液中液滴尺寸分布，乳液形態(tài)，乳液穩(wěn)定性及乳液流變性的相關(guān)信息。長(zhǎng)久以來，核磁共振光譜一直作為一個(gè)強(qiáng)大且通用的方法在分子水平上對(duì)化學(xué)和生物代謝各領(lǐng)域進(jìn)行分析(johns，2009)。對(duì)于乳狀液來說，nmr是一種非侵入的方法，通過脈沖梯度場(chǎng)技術(shù)(pfg)可量化分子自擴(kuò)散從而測(cè)量得到乳狀液的液滴尺寸分布，這種方法能夠處理非常高濃度的乳狀液的液滴測(cè)量問題(vermeir等人，2016)，而這種精細(xì)的測(cè)量用其他方法無法做到。除了乳液的液滴尺寸分布測(cè)量，一維氫譜(¹hnmr)也被用于鑒別和量化水包油乳液在量化過程中的氧化產(chǎn)物(jia，shin&lee，2015)。另一項(xiàng)研究也展示了包括核磁共振成像技術(shù)(mri)及定域譜技術(shù)(mrs)在內(nèi)的核磁共振技術(shù)(mr)在無損檢測(cè)水包油乳化配方配制成的乳霜時(shí)的成果(onuki等人，2014)。

近年來，一種新穎的基于體素選擇的磁共振波譜方法(magneticresonancespectroscopy,mrs)方法被用于獲得水-笨系統(tǒng)的空間分辨核磁共振一維譜(lambert，hergenroder，suter和deckert，2009)。其中，z方向上的高強(qiáng)度梯度場(chǎng)達(dá)到1特斯拉每米，所檢測(cè)的體素厚度達(dá)到1μm，步長(zhǎng)為50nm，為在液-液界面處進(jìn)行高空間分辨譜的探測(cè)提供可能性。然而，大多數(shù)液態(tài)nmr光譜儀裝配的反式或?qū)拵筋^僅具有沿著z軸的梯度場(chǎng)用于選擇相干路徑和測(cè)量自擴(kuò)散系數(shù)。因此，有研究報(bào)道了可用于常規(guī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)液體nmr設(shè)備上的空間分辨譜方法，從而確保其廣泛應(yīng)用于各種化學(xué)系統(tǒng)(mantel，bayle，hediger，berthon，&bardet，2010；martin，chingas，&mcdougal，2012)。最近，韋等人報(bào)道了一種基于稱為1dphasics(partialhomogeneityassistedinhomogeneitycorrectionspectroscopy)的局部均勻的高分辨核磁共振譜方法。(wei，lin，chen，lin，&chen，2014)。由于信號(hào)來自于一系列尺寸足夠小的小體素利用回波平面光譜成像(epsi)檢測(cè)模塊，僅僅在幾秒鐘內(nèi)1dphasics即可同時(shí)獲得沿z軸梯度場(chǎng)方向的不同小體素的高分辨率一維nmr氫譜。與單體素定域譜相比，1dphasics方法能夠利用高速率轉(zhuǎn)換下的振蕩梯度同時(shí)完成覆蓋沿著梯度方向的整個(gè)有效樣本長(zhǎng)度的多體素譜信息的采集。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供能適用于檢測(cè)乳狀液形成和穩(wěn)定過程中物質(zhì)的遷移和含量變化的實(shí)時(shí)監(jiān)控乳狀液相分離過程的核磁共振空間分辨譜方法。

本發(fā)明包括以下步驟：

1)制備待測(cè)樣品，通過混合等體積的有機(jī)相和乳化劑水溶液制備乳狀液，震蕩后，轉(zhuǎn)移到nmr管中，再置于nmr波譜儀中；

在步驟1)中，所述有機(jī)相可采用芝麻油；所述乳化劑水溶液的制備方法是：先將乳化劑分散在水相中并在室溫下用渦流旋轉(zhuǎn)直至完全溶解，即得乳化劑水溶液。實(shí)驗(yàn)中可改變?nèi)榛瘎┍壤?，以研究不同含量的乳化劑?duì)乳狀液系統(tǒng)形成的影響。為了避免潛在的輻射阻尼效應(yīng)，樣品的水相由h2o和d2o組成，h2o與d2o的體積比可為10％︰90％；樣品的水油體積比按照1︰1配制，乳化劑的相對(duì)含量較低，不足以使水油完全乳化；所述震蕩可用渦旋器震蕩5min；所述nmr管可采用5mm的標(biāo)準(zhǔn)nmr管。

2)將參考樣品置于核磁共振譜儀中，勻場(chǎng)后用常規(guī)一維脈沖序列采樣一張一維譜，獲得譜線的線寬，線寬值反映了磁場(chǎng)環(huán)境均勻性情況；

在步驟2)中，所述核磁共振譜儀可采用500mhzvariannmr核磁共振譜儀；所述將參考樣品置于核磁共振譜儀中之前先用常規(guī)溶液樣品勻場(chǎng)，使磁場(chǎng)盡量均勻。

3)在核磁共振波譜儀上導(dǎo)入事先編譯好的1dphasics序列，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，設(shè)置實(shí)驗(yàn)參數(shù)以達(dá)到兼顧分辨率和信噪比的最佳效果；

在步驟3)中，所述1dphasics序列按時(shí)序包括一個(gè)激發(fā)脈沖和一個(gè)回波平面譜成像模塊，所述回波平面譜成像模塊可以單次掃描下獲得整個(gè)梯度覆蓋下采樣區(qū)間內(nèi)的完整空間信息，所以1dphasics序列能夠提供樣品不同空間位置的譜峰信息，回波平面譜成像模塊前的補(bǔ)償梯度gs起移動(dòng)回波中心的作用；

所述實(shí)驗(yàn)參數(shù)包括直接維譜寬sw、頻率編碼強(qiáng)度ga、單一正或負(fù)頻率編碼梯度下的采樣時(shí)間ta、重復(fù)采樣次數(shù)na、間接維采樣點(diǎn)數(shù)np1；ga可控制采樣區(qū)域的范圍，重復(fù)采樣次數(shù)na可控制實(shí)驗(yàn)結(jié)果的靈敏度，改變間接維采樣點(diǎn)數(shù)可改變一維譜的表觀空間分辨率。實(shí)驗(yàn)中，樣品的有效采樣長(zhǎng)度l＝sw/γga；表觀空間分辨率δz＝l/np1，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需，調(diào)整上述參數(shù)。

4)替換樣品為震蕩后的乳狀液樣品，進(jìn)行數(shù)據(jù)采樣；

在步驟4)中，所述數(shù)據(jù)采樣時(shí)，采集單次所有層面空間分辨譜的時(shí)間需要1min左右。

5)重復(fù)步驟4)，直到乳狀液系統(tǒng)分層過程穩(wěn)定；

在步驟5)中，所述直到乳狀液系統(tǒng)分層過程穩(wěn)定的時(shí)間可為120min；所述重復(fù)步驟4)是指1dphasics序列的單次采樣為1min，實(shí)驗(yàn)中可每min都進(jìn)行采樣，以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)乳化層形成后到系統(tǒng)分層穩(wěn)定的整個(gè)過程。

6)將采集到的原始fid數(shù)據(jù)用matlab軟件(versionr2014a)對(duì)fid進(jìn)行數(shù)據(jù)重排、傅里葉變換，得到高分辨的二維譜圖；

在步驟6)中，所述二維譜圖由一系列來自不同體素的一維譜信號(hào)堆疊而成。

7)提取出二維譜中每一層的一維譜，對(duì)每條一維譜進(jìn)行分峰擬合和積分，得到積分?jǐn)?shù)據(jù)，再將積分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入origin軟件(versionpro8)，按照時(shí)間空間規(guī)律對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類整理；

在步驟7)中，所述每條一維譜來源于層厚為δz的體素內(nèi)的物質(zhì)；由于1dphasics序列包含回波平面譜成像模塊，其獲得的光譜不能通過相位調(diào)制進(jìn)行調(diào)整，必須以絕對(duì)值模式顯示；所述分峰擬合是為了克服1dphasics以絕對(duì)值模式顯示的一維譜在定量分析上存在的不準(zhǔn)確性，需要對(duì)譜峰進(jìn)行峰型擬合之后再進(jìn)行積分；選擇高斯函數(shù)作為適當(dāng)?shù)臄M合函數(shù)，通過選擇合適的參數(shù)對(duì)來自油的亞甲基基團(tuán)(1.30ppm處)的譜峰進(jìn)行高斯擬合，獲得高斯線型的單峰曲線；

所述按照時(shí)間空間規(guī)律對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類整理，是將獲得的積分?jǐn)?shù)據(jù)作為定量分析的依據(jù)導(dǎo)入origin軟件(versionpro8)，將數(shù)據(jù)點(diǎn)畫在橫坐標(biāo)為時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度(即積分值)的坐標(biāo)軸上；將同一層面上不同時(shí)間的積分點(diǎn)連接成一條曲線，即可得到該層面上油物質(zhì)隨時(shí)間變化的規(guī)律以及在空間上的變化規(guī)律。

8)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。

在步驟8)中，所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析的具體方法可為：分析不同空間位置上信號(hào)強(qiáng)度的演化規(guī)律，得到系統(tǒng)的分層相對(duì)穩(wěn)定時(shí)間和乳化層厚度，其中分層相對(duì)穩(wěn)定時(shí)間可以由趨勢(shì)圖直觀讀取出，而由于每條曲線所代表的譜圖信息來自空間位置一個(gè)體素內(nèi)，乳化層厚度可通過乳化層區(qū)域的曲線條數(shù)與空間分辨率計(jì)算得出。

在本發(fā)明中，通過研究在乳化劑存在下水油乳狀液的形成和穩(wěn)定分層過程，探索了利用高分辨率的空間分辨譜方法——1dphasics脈沖序列在分子水平上研究不均勻的多相乳狀液系統(tǒng)的可行性。因此本發(fā)明可獲得以下有益效果：

1)與傳統(tǒng)的研究乳狀液性質(zhì)的方法相比，本發(fā)明的nmr方法具有可重復(fù)性、非侵入性等優(yōu)點(diǎn)，得到的結(jié)果展示了乳狀液分層相對(duì)穩(wěn)定時(shí)間和在空間上的物質(zhì)變化趨勢(shì)，我們可以從中得到乳狀液達(dá)到分層穩(wěn)定狀態(tài)所需的時(shí)間和穩(wěn)定后乳化層的厚度。

2)通過對(duì)不同乳化劑含量的樣品進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，我們可以得到乳化劑濃度對(duì)于乳化過程的影響。通過對(duì)不同水油體系樣品進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，我們可以得到不同種類的油在乳化性質(zhì)上的異同。

3)本發(fā)明所采用的核磁共振脈沖序列為1dphasics序列，該序列可以在僅配備有z軸梯度探頭的高分辨nmr譜儀上實(shí)施。不同于依賴選擇性激發(fā)的方法，1dphasics方法通過加入epsi快速采樣模塊，實(shí)現(xiàn)單次采樣即可獲得全部空間信息。采樣時(shí)間短，適合對(duì)動(dòng)態(tài)過程或化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行研究。

附圖說明

圖1為1dphasics脈沖序列。在圖1中，rf軸上的脈沖是非選擇性90°脈沖；ga為頻率編碼強(qiáng)度；ta為單一正或負(fù)頻率編碼梯度下的采樣時(shí)間；na為采樣重復(fù)次數(shù)；gz軸上的補(bǔ)償梯度gs用于移動(dòng)回波中心。

圖2為120min時(shí)，泊洛沙姆188含量為0.35g/l的芝麻油-水體系乳狀液在相對(duì)穩(wěn)定的分層狀態(tài)下的二維譜圖。

圖3為120min時(shí)，泊洛沙姆188含量為0.35g/l的芝麻油-水體系乳狀液樣品從二維譜中逐層提取出的部分一維譜，根據(jù)不同的空間位置從上而下排列。

圖4為泊洛沙姆188含量為0.35g/l的芝麻油樣品在整個(gè)檢測(cè)過程中各個(gè)層面的油含量的變化趨勢(shì)，其中，油含量曲線根據(jù)空間位置的不同，從上往下編號(hào)為1至40，空間分辨率為0.40mm。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

本實(shí)施例適用于使用快速核磁共振空間分辨方法監(jiān)控油-水體系的乳狀液形成到油、水及乳化層分層穩(wěn)定的過程，檢測(cè)這一過程中物質(zhì)的變化：

(1)本實(shí)驗(yàn)所用的芝麻油均購自當(dāng)?shù)爻胁⑶抑苯邮褂梦唇?jīng)任何預(yù)處理。泊洛沙姆188和丙酮(99.5％純度)購自當(dāng)?shù)鼗瘜W(xué)產(chǎn)品零售商(jilingmbh，xiamen，china)并直接使用而無需進(jìn)一步純化。d2o(99.8％)是norell(usa)的產(chǎn)品。d2o和蒸餾水制備乳液。200μl的d2o和1800μl的蒸餾水配置成為水相，將泊洛沙姆188按0.35g/l的比例分散在水相中并在室溫下用渦流旋轉(zhuǎn)以確保完全溶解。取2000μl芝麻油，與水相混合，在室溫下用渦旋旋轉(zhuǎn)5min，使樣品充分震蕩成為乳狀液。取550μl充分震蕩，后轉(zhuǎn)移到5mm的標(biāo)準(zhǔn)nmr管中，放入nmr譜儀之前再次振動(dòng)。

(2)樣品檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)使用的儀器為500mhzvariannmr核磁共振譜儀，脈沖序列為1dphasics序列，采樣溫度為298k，直接維采樣點(diǎn)數(shù)為600，間接維采樣點(diǎn)數(shù)為80。

在正式實(shí)驗(yàn)之前，使用穩(wěn)定的參考樣品進(jìn)行勻場(chǎng)以提供相對(duì)均勻的場(chǎng)。將已經(jīng)制備好的溶液樣品核磁管置于500mhzvariannmr核磁共振譜儀用常規(guī)一維脈沖序列采樣一張一維譜，獲得譜線的線寬，為譜寬參數(shù)設(shè)置提供依據(jù)，同時(shí)線寬值反映了磁場(chǎng)環(huán)境均勻性情況。

打開1dphasics序列，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，設(shè)置實(shí)驗(yàn)參數(shù)。對(duì)本實(shí)驗(yàn)來說，實(shí)驗(yàn)參數(shù)包括直接維譜寬sw＝500khz，頻率編碼強(qiáng)度ga＝36.6g/cm，單一正或負(fù)頻率編碼梯度下的采樣時(shí)間ta＝320μs，重復(fù)采樣次數(shù)(直接維采樣點(diǎn)數(shù))na＝600，間接維采樣點(diǎn)數(shù)np1＝80。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)參數(shù)，可以計(jì)算出樣品有效長(zhǎng)度l＝32mm；表觀空間分辨率δz＝0.40mm。

從2d圖提取的每個(gè)1dnmr光譜包含厚度為0.40mm的每個(gè)體素內(nèi)樣品的信息。單次1dphasics采樣為1min，每一分鐘都進(jìn)行采集，以監(jiān)測(cè)乳化層形成后到系統(tǒng)分層穩(wěn)定的整個(gè)過程。

(3)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采集到的原始數(shù)據(jù)用matlab軟件(versionr2014a)對(duì)譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)重排、傅里葉變換，得到高分辨的二維譜圖，如圖2。二維圖由一系列來自不同體素的一維譜信號(hào)堆疊而成，將部分一維譜逐條提取出來，如圖3，每條一維譜包含了層厚為δz的體素內(nèi)的物質(zhì)。通過選擇合適的參數(shù)對(duì)來自油的亞甲基基團(tuán)(1.30ppm處)的譜峰進(jìn)行高斯擬合，可以繪制出其單峰曲線。然后通過對(duì)擬合曲線進(jìn)行積分獲得定量分析的數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入origin軟件(versionpro8)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類整理，將數(shù)據(jù)點(diǎn)畫在橫坐標(biāo)為時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度(即積分值)的坐標(biāo)軸上。將同一層面上不同時(shí)間的積分點(diǎn)連接成一條曲線，如圖4，即可得到該層面上油物質(zhì)隨時(shí)間變化的規(guī)律，同時(shí)，這些曲線代表著不同層面，還可得到油物質(zhì)在空間上的變化規(guī)律。

(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理分析

圖2為120min時(shí)樣品的二維譜圖，從二維圖中可以發(fā)現(xiàn)，芝麻油樣品的二維譜的下半部分顯示水信號(hào)，上半部分顯示油信號(hào)，在界面處，水油信號(hào)同時(shí)存在。將二維譜圖與120min時(shí)樣品實(shí)物進(jìn)行對(duì)比，可知當(dāng)樣品處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)時(shí)，分成了三個(gè)不同的相，包括頂部的油相，中間的乳化層，底部的水相。這表明穩(wěn)定的過程中過量的油和水已經(jīng)從乳狀液中分離出來。圖3中，從二維譜中提取的幾個(gè)1dnmr譜也體現(xiàn)了油物質(zhì)的峰強(qiáng)度的在空間上自上往下呈減少的趨勢(shì)，水峰強(qiáng)度呈遞增的趨勢(shì)。然而，由于三相之間的模糊邊界，乳化層的精確厚度不能從樣品外觀或二維譜中直接獲得。

而通過對(duì)積分?jǐn)?shù)據(jù)的收集，分析不同空間位置上信號(hào)強(qiáng)度的演化規(guī)律，可得到系統(tǒng)的的相對(duì)分層穩(wěn)定時(shí)間和乳化層厚度。其中相對(duì)分層穩(wěn)定可以由趨勢(shì)圖直觀的讀取出，樣品在40min左右達(dá)到較穩(wěn)定的相分離狀態(tài)。從曲線圖(圖4)中可以發(fā)現(xiàn)分層穩(wěn)定后，曲線分別在上部、中部和下部三個(gè)區(qū)域各自重疊通過分析可得，分別對(duì)應(yīng)油相，乳化層，水相。而由于每條曲線所代表的空間位置信息來自一個(gè)體素內(nèi)，乳化層厚度可通過乳化層區(qū)域的曲線條數(shù)與表觀空間分辨率計(jì)算得出。經(jīng)過計(jì)算，樣品的乳化層厚度約為3.2mm。

綜上所述，利用1dphasics序列可以對(duì)乳狀液系統(tǒng)從形成到穩(wěn)定分層過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。得到的高分辨的核磁共振空間分辨譜，為研究乳化劑含量對(duì)乳狀液系統(tǒng)從形成到穩(wěn)定分層的影響提供了依據(jù)，除了上述實(shí)例外，該方法也可用于研究不同水油體系形成的乳狀液的乳化性質(zhì)，得到不同油類的乳化性能的相關(guān)結(jié)論。

本發(fā)明例舉的實(shí)施例旨在更進(jìn)一步闡述這種應(yīng)用核磁共振空間分辨譜技術(shù)監(jiān)控乳狀液系統(tǒng)從形成到穩(wěn)定分層過程的具體操作，而不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。