本發(fā)明涉及藥用植物中特定成分含量的測(cè)定方法，特別是一種杉寄生中鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸含量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

杉寄生為桑寄生科鞘花屬植物鞘花（拉丁名：Macrosolen cochinchinensis （Lour.）Van Tiegh.）的莖枝。植物鞘花，分布于華南、西南及福建、西藏等地。具有祛風(fēng)濕，補(bǔ)肝腎，活血止痛，止咳，止痢之功效。主治風(fēng)濕痹痛，腰膝酸痛，頭暈?zāi)垦?，脫發(fā)，跌打損傷，痔瘡腫痛，咳嗽，咳血，痢疾。具體的，杉寄生具有以下功效：1.杉寄生是植物福氏鞘花的全株，在夏天和秋天之中采收，性平、味甘淡，有止咳和散瘀的功效。平時(shí)多用于胃氣痛以及疝氣和內(nèi)傷咳血等多種病癥的治療；2.杉寄生可治胃氣痛：杉寄生有理氣止痛的作用，對(duì)人類的胃氣痛有很好的治療作用，可單獨(dú)食用也可以與豬瘦肉同時(shí)煎制后食用，在與豬瘦肉一起煎制食用時(shí)，治療效果會(huì)更出色。這種食用方法對(duì)人類的疝氣也同樣適合，而且治療效果比較不錯(cuò)；3.杉寄生可治苦傷和咳血：杉寄生對(duì)人類的苦傷以鼐咳血癥狀都有很好的治療效果，在治療時(shí)以內(nèi)服為主，可以取杉寄生30克用清水煎制后服用，每天服用一次連用七天，效果不錯(cuò)；4.杉寄生可治關(guān)節(jié)痛：杉寄生對(duì)人類的關(guān)節(jié)痛和風(fēng)濕病治療作用明顯，在治療既可煎制后內(nèi)服，也可用藥液清洗自己疼痛的部位，也能起到消炎止痛和消腫的作用。經(jīng)研究，杉寄生中含有多種化學(xué)成分，中國文獻(xiàn)：中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015年第21卷第3期發(fā)表《杉寄生化學(xué)成分》，作者：陸國壽、陸文杰、陳家源等；單位：廣西中醫(yī)藥研究院，作者對(duì)杉寄生化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從中分離得到并鑒定了10個(gè)化學(xué)成分，分別為羽扇豆醇（1），環(huán)桉烯醇（2），表木栓醇（3），（23Z）-9,19-cycloart-23-ene-3α，25-diol(4),木栓酮（5），正三十二烷醇（6），β-谷甾醇（7），三十二酸（8），蘆?。?）葒草苷（10）。而本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)杉寄生對(duì)腫瘤具有一定防治效果，經(jīng)對(duì)杉寄生不斷分離研究，發(fā)現(xiàn)其中含有的酚類物質(zhì)對(duì)腫瘤具有較高的活性，發(fā)明人分離提取了杉寄生中的酚類物質(zhì)鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸。

鞣花酸(2，3，7，8-tetrahydroxy benzopyrano5，4，3一cdebenzopyran-5,10一dione)是廣泛存在于各種軟果、堅(jiān)果等植物組織中的一種天然多酚組分，鞣花酸與三氯化鐵的顯色反應(yīng)呈藍(lán)色，遇硫酸呈黃色。鞣花酸表現(xiàn)出對(duì)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)癌變及其他多種癌變有明顯的抑制作用，特別是對(duì)結(jié)腸癌、食管癌、肝癌、肺癌、舌及皮膚腫瘤等有很好的抑制作用。

為了進(jìn)一步明確杉寄生的化學(xué)組成，我們對(duì)其進(jìn)行了化學(xué)成分的研究并從中分離鑒定得到兩個(gè)酚性化合物，分別為鞣花酸及3,3'-二甲氧基鞣花酸。鞣花酸及3,3'-二甲氧基鞣花酸均為首次從杉寄生中分得，同時(shí)也首次建立了它化合物的HPLC含量測(cè)定方法，并初步比較了它們?cè)诓煌a(chǎn)地杉寄生中的含量變化。鞣花酸不僅具有明顯的抗氧化作用，還對(duì)多種癌變有一定的抑制作用，甚至能引起癌細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的研究，為開發(fā)以杉寄生為原料的藥品、保健品、天然抗氧化劑提供理一定的論依據(jù)，使杉寄生在醫(yī)療、保健甚至化妝品領(lǐng)域起到更廣泛的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好的杉寄生中鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸含量的測(cè)定方法。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明杉寄生中鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸含量檢測(cè)方法，包括如下步驟：

（A）對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備：精密稱取鞣花酸對(duì)照品和3,3'-二甲氧基鞣花酸對(duì)照品，置同一250mL量瓶中，加入30-50ml甲醇，超聲溶解15-20min至完全透明，并用甲醇稀釋至刻度，即為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

（B）供試品溶液的制備:取杉寄生藥材，預(yù)先粉碎至40-80目，精密稱定其重量，精密加入60%的乙醇（g/g），稱定重量，放水浴上回流40-70 min，優(yōu)選55-65min，放冷，再稱定重量，用60%乙醇(g/g)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

(C)取制備好的對(duì)照品及供試品樣品注入液相色譜儀，進(jìn)樣，檢測(cè)，即得；色譜條件：色譜柱為Eclipse XDB-C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.2 %磷酸水溶液，體積比為47:53；流速為0.8 mL·min^-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為10μL；在此條件下鞣花酸的理論塔板數(shù)不低于3000；3,3'-二甲氧基鞣花酸的理論塔板數(shù)不低于5000。

按照上述條件要求對(duì)檢測(cè)方法的重復(fù)性、精密度等進(jìn)行了試驗(yàn)，具體過程為：

一、對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精密稱取鞣花酸對(duì)照品15.31 mg，3,3'-二甲氧基鞣花酸對(duì)照品9.43 mg，置同一250 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解并用甲醇稀釋至刻度，即為對(duì)照品儲(chǔ)備液。鞣花酸的濃度為61.24 μg·mL^-1，3,3'-二甲氧基鞣花酸的濃度為37.72 μg·mL^-1。

二、供試品溶液的制備

取經(jīng)粉碎的藥材約0.5 g，精密稱定其重量，精密加入60 %乙醇，稱定重量，放水浴上回流60 min，放冷，再稱定重量，用60 %乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

三、線性關(guān)系的考察

分別從對(duì)照品儲(chǔ)備液中精密移取0.5，1，3，5，7，9 mL，分別置10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得系列濃度的混合對(duì)照品溶液。分別取上述6個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液10 μL按權(quán)利要求下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果得出鞣花酸的線性方程：Y = 27856X + 3884.5，r= 0.9998；3,3'-二甲氧基鞣花酸的線性方程：Y = 39151X - 4588.1，r = 0.9998。結(jié)果表明鞣花酸對(duì)照品溶液在進(jìn)樣量為0.0306 μg～0.5512 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，3,3'-二甲氧基鞣花酸對(duì)照品溶液在進(jìn)樣量為0.0189 μg～0.3395 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

四、精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取鞣花酸濃度為18.372 μg·mL^-1和3,3'-二甲氧基鞣花酸濃度為11.316 μg·mL^-1的對(duì)照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，按權(quán)利要求色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果鞣花酸峰面積RSD值為0.17 %，3,3'-二甲基鞣花酸峰面積RSD值為0.26 %，表明所用高效液相色譜儀精密度非常好。

五、穩(wěn)定性試驗(yàn)

取杉寄生藥材（產(chǎn)地：廣西上林）粗粉約0.5 g，精密稱定，按供試品制備方法制備，室溫保存，分別在0，2，4，8，12，24 h精密吸取供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，按權(quán)利要求規(guī)定色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果樣品中鞣花酸峰面積的RSD值為0.46 %，3,3'-二甲氧基鞣花酸峰面積的RSD值為1.01%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

六、重復(fù)性試驗(yàn)

取杉寄生藥材（產(chǎn)地：廣西上林）粗粉約0.5 g，精密稱定重量，共取6份，按要求供試品溶液的制備方法制備。精密吸取供試品溶液10 μL，按權(quán)利要求規(guī)定下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算鞣花酸含量為0.738 mg·g^-1，其RSD值為1.64 %；3,3'-二甲氧基鞣花酸的含量為0.443 mg·g^-1，其RSD值為2.45 %。

七、加樣回收試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液3 mL至100 mL圓底燒瓶中，水浴上揮干溶劑，平行制備6份，再在每一份中加入已知含量的杉寄生藥材（產(chǎn)地：廣西上林）粗粉約0.25 g，按要求供試品溶液的制備方法制備。精密吸取供試品溶液10 μL，按要求色譜條件分別測(cè)定各樣品中鞣花酸、3,3'-二甲氧基鞣花酸的含量，計(jì)算回收率（杉寄生藥材中鞣花酸含量以0.738 mg·g^-1計(jì)，3,3'-二甲氧基鞣花酸的含量以0.443 mg·g^-1計(jì)），結(jié)果見表1。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明對(duì)杉寄生中鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸含量的檢測(cè)方法，分別對(duì)對(duì)照品溶液及供試品溶液在本發(fā)明色譜條件下進(jìn)行測(cè)定鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸的色譜分析圖，并通過對(duì)鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸的峰面積響應(yīng)值的線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率等方面的測(cè)定，從而掌握杉寄生中鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸含量的測(cè)定方法。本測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，值得在杉寄生鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸含量測(cè)定方面推廣應(yīng)用。

附圖說明：

圖1：3,3'-二甲氧基鞣花酸結(jié)構(gòu)式；

圖2：鞣花酸結(jié)構(gòu)式；

圖3：鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸標(biāo)樣及杉寄生藥材中鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一

發(fā)明人分別在廣西金秀、廣西南寧和廣西上林取杉寄生藥材，并對(duì)杉寄生中的鞣花酸和3,3'-二甲氧基鞣花酸進(jìn)行含量測(cè)定，步驟如下：

（A）對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精密稱取鞣花酸對(duì)照品15.31 mg，3,3'-二甲氧基鞣花酸對(duì)照品9.43 mg，置同一250 mL量瓶中，加甲醇30-50ml，超聲溶解15-20min，并用甲醇稀釋至刻度，即為對(duì)照品儲(chǔ)備液。鞣花酸的濃度為61.24 μg·mL^-1，3,3'-二甲氧基鞣花酸的濃度為37.72 μg·mL^-1。

（B）供試品溶液的制備

取經(jīng)粉碎的藥材約0.5 g，精密稱定其重量，精密加入60 %乙醇（g/g），稱定重量，放水浴上回流60 min，放冷，再稱定重量，用60 %乙醇（g/g），補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

(C)取制備好的對(duì)照品及供試品樣品注入液相色譜儀，進(jìn)樣，檢測(cè)，即得；色譜條件：色譜柱為Eclipse XDB-C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.2 %磷酸水溶液，體積比為47:53；流速為0.8 mL·min^-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為10μL；在此條件下鞣花酸的理論塔板數(shù)不低于3000；3,3'-二甲氧基鞣花酸的理論塔板數(shù)不低于5000。

檢測(cè)結(jié)果見表3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)采用的HPLC法測(cè)定杉寄生藥材中鞣花酸及3,3'-二甲氧基鞣花酸的含量，方法簡(jiǎn)單方便，操作性強(qiáng)，具有較好的穩(wěn)定性重現(xiàn)性，為杉寄生藥材質(zhì)量控制方法提供了參考，為鞣花酸及3,3'-二甲氧基鞣花酸含量測(cè)定方法的研究提供了重要依據(jù)。