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液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定尿液中14種環(huán)境荷爾蒙含量的方法與流程

文檔序號(hào):11913075閱讀:903來源:國知局
液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定尿液中14種環(huán)境荷爾蒙含量的方法與流程

本發(fā)明屬于檢測分析技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定尿液中荷爾蒙含量的方法。



背景技術(shù):

隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展,工業(yè)化程序的提高,越來越多的工業(yè)品,化學(xué)品及添加劑的使用導(dǎo)致環(huán)境中數(shù)百中環(huán)境干擾物質(zhì)的暴露,對人體造成不同程度的損傷及影響。在日常生活中,塑料制品中的鄰苯二甲酸酯類如鄰苯二甲酸單甲基酯(MMP)、鄰苯二甲酸單乙基酯(MEP)、鄰苯二甲酸單丁基酯(MnBP)、鄰苯二甲酸單芐基酯(MBzP)、鄰苯二甲酸單乙基己基酯(MEHP),在實(shí)際應(yīng)用中因其低毒,廉價(jià),廣譜抗菌性,穩(wěn)定被廣泛使用;對羥基苯甲酸酯類如對羥基苯甲酸甲酯(MP)、對羥基苯甲酸乙酯(EP)、對羥基苯甲酸丙酯(PP)、對羥基苯甲酸丁酯(BP)因其低毒,穩(wěn)定,廣譜抗菌能力及穩(wěn)定性被廣泛用作食品,藥品,化妝品,衛(wèi)生用品行業(yè)防腐抑菌劑;酚類如壬基苯酚(NP)、辛基苯酚(4-t-OP)、丁基苯酚(2,4-di-t-BP)、雙酚A(BPA)、三氯沙(Triclosan)在清潔用品中大量使用,可在生物體內(nèi)積累,嚴(yán)重影響人體生殖能力。由于這類物質(zhì)的大量使用,目前在許多環(huán)境介質(zhì)如水體,空氣,土壤,化妝品,藥品中均能夠檢到,可通過皮膚接觸、飲食、呼吸等多種渠道進(jìn)入人體,進(jìn)而會(huì)干擾內(nèi)分泌功能,與生殖發(fā)育、不孕癥、性早熟、前列腺癌、精子數(shù)量降低等都密切相關(guān)。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢出限低、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定尿液中14種環(huán)境荷爾蒙含量的方法。

為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定尿液中14種環(huán)境荷爾蒙含量的方法,

所述14種環(huán)境荷爾蒙分別為:鄰苯二甲酸單甲基酯、鄰苯二甲酸單乙基酯、鄰苯二甲酸單丁基酯、鄰苯二甲酸單芐基酯、鄰苯二甲酸單乙基己基酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、壬基苯酚、辛基苯酚、丁 基苯酚、雙酚A、三氯沙;

采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法定量檢測尿液樣品中14種環(huán)境荷爾蒙,具體程序是先用高效液相色譜將經(jīng)過預(yù)凈化處理的尿液樣本進(jìn)行初步分離,串聯(lián)質(zhì)譜法負(fù)離子電噴霧離子化的多離子反應(yīng)監(jiān)測模式對目標(biāo)組分的母離子-子離子對進(jìn)行掃描,氘代同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行準(zhǔn)確定量,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度與內(nèi)標(biāo)品濃度比值為X軸,以標(biāo)準(zhǔn)品響應(yīng)峰面積與內(nèi)標(biāo)品響應(yīng)峰面積比值為Y軸,建立校正曲線,計(jì)算上述14種環(huán)境荷爾蒙的含量;

其中,色譜柱1和色譜柱2并聯(lián)設(shè)置,通過流動(dòng)相A1、B1與色譜柱1實(shí)現(xiàn)鄰苯二甲酸單甲基酯、鄰苯二甲酸單乙基酯、鄰苯二甲酸單丁基酯、鄰苯二甲酸單芐基酯、鄰苯二甲酸單乙基己基酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯這9種組分的定量分析,分析結(jié)束后切換至流動(dòng)相A2、B2與色譜柱2實(shí)現(xiàn)壬基苯酚、辛基苯酚、丁基苯酚、雙酚A和三氯沙這5種組分定量分析;

具體色譜條件為:

(1)高效液相色譜條件:

色譜柱1:Kinetex XB-C18 100mm*2.1mm*2.6uM;

流動(dòng)相:A1,含0.1%v/v甲酸的水溶液;

流動(dòng)相:B1,乙腈;

洗脫梯度見表1;

柱溫:35℃;

流速:0.4mL/min;

進(jìn)樣量:20μL;

色譜柱2:BEH C18 50mm*2.1mm*1.7uM;

流動(dòng)相A2,含0.1%v/v氨水的水溶液;

流動(dòng)相B2,甲醇;

洗脫梯度見表2;

柱溫:50℃;

流速:0.2mL/min;

進(jìn)樣量:20μL;

表1 色譜柱1的梯度洗脫參數(shù)

表2 色譜柱2的梯度洗脫參數(shù)

(2)質(zhì)譜條件:

離子源:電噴霧Turbo Spray,負(fù)離子掃描;離子源溫度550.00℃;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測;碰撞氣5.00Psi;氣簾氣40.00Psi;霧化氣55.00Psi;輔助氣55.00Psi;電噴霧電壓-4500.00V;采集離子對見表3;

表3 十四個(gè)環(huán)境荷爾蒙組分及內(nèi)標(biāo)對應(yīng)采集離子對及質(zhì)譜參數(shù)

其中,所述的經(jīng)過預(yù)凈化處理的尿液樣本按如下方法制備得到:準(zhǔn)備200uL尿液樣本,向其中加入10μL β-葡萄糖甘酸酶,加入20μL混合氘代內(nèi)標(biāo)液,在37℃水浴鍋中充分酶解2h,待酶解結(jié)束之后向其中加入400μL甲酸和甲醇的混合水溶液,充分渦旋均勻,待SPE上樣凈化即得。

其中,所述標(biāo)準(zhǔn)品按如下方法制備得到:分別稱取14種標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定容,分別得到14種2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液,然后用甲醇分級(jí)稀釋得到1μg/mL(每一種標(biāo)準(zhǔn)品的濃度都是1μg/mL)混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液待用,從工作液中分別移取適量標(biāo)液,用尿液基質(zhì)稀釋液定容得到不同濃度標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL各1mL,待用。

其中,所述的尿液基質(zhì)稀釋液按如下方法配制得到:準(zhǔn)確稱取二水合氯化鈣0.0559g、六水合氯化鎂0.0610g、氯化鈉0.4208g、硫酸鈉0.2060g、檸檬酸鈉二水合物0.0647g、草酸鈉0.0020g、磷酸二氫鉀0.2545g、氯化鉀0.1439g、氯化銨0.0920g、尿素0.2498g和肌酐0.1052g定容至100mL,充分混勻,放置4℃待用。

其中,所述的內(nèi)標(biāo)品按如下方法制備得到:分別移取內(nèi)標(biāo)品用甲醇定容至2mg/mL,然后分級(jí)稀釋得到0.5μg/mL混合氘代內(nèi)標(biāo)工作液待用;分別準(zhǔn)備200μL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn),向其中加入10μL β-葡萄糖甘酸酶,加入20μL混合氘代內(nèi)標(biāo)工作液,在37℃水浴中充分酶解2h,待酶解結(jié)束之后向其中加入400μL甲酸和甲醇的混合水溶液進(jìn)行稀釋,充分渦旋均勻,待SPE上樣凈化。

其中,甲酸和甲醇的混合水溶液中,甲酸、甲醇和水的體積比為5:10:85。其中,β-葡萄糖甘酸酶,其酶活100000units/mL以上。

其中,所述的SPE上樣凈化,過程如下:依次用1ml甲醇、1ml水進(jìn)行活化SPE小柱;上樣,移取預(yù)處理過的尿液樣本或內(nèi)標(biāo)品300uL進(jìn)行上樣,自然滴落,流出液棄去;淋洗,依次用1ml水、1ml 10%v/v甲醇水溶液淋洗小柱,淋洗液棄去,以真空泵抽干柱子約1min至近干;洗脫,1ml甲醇進(jìn)行洗脫,收集洗脫液;將洗脫液氮吹至近干,用100μL含0.1%v/v甲酸的甲醇水溶液復(fù)溶。其中,所述的含0.1%v/v甲酸的甲醇水溶液,甲醇和水體積比是1∶1。

有益效果:目前文獻(xiàn)僅針對此類其中一種或幾種物質(zhì)進(jìn)行分析檢測,但針對此類14種環(huán)境荷爾蒙類物質(zhì)進(jìn)行精確定量分析尚未見報(bào)道。本發(fā)明利用液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)結(jié)合多年應(yīng)用經(jīng)驗(yàn),綜合固相萃取技術(shù)及柱切換功能實(shí)現(xiàn)尿液樣本中14種環(huán)境荷爾蒙定量準(zhǔn)確檢測,10min可實(shí)現(xiàn)14個(gè)目標(biāo)物質(zhì)的定量分析。本發(fā)明方法檢出限低,重現(xiàn)性好,準(zhǔn)確度高,可以實(shí)現(xiàn)真實(shí)監(jiān)測人體內(nèi)這些有毒,有害物質(zhì)的暴露情況,進(jìn)而采取適當(dāng)預(yù)防與防護(hù)措施。本研究的實(shí)現(xiàn)應(yīng)用于臨床,可有效干預(yù)人體因環(huán)境荷爾蒙在人體內(nèi)暴露引起的生殖發(fā)育、不孕癥、性早熟、前列腺癌、精子數(shù)量降低等疾病,可有效提高人民生活質(zhì)量,提升新生兒健康率,有效監(jiān)控污染源排放等等。

附圖說明

圖1為9個(gè)組分(鄰苯二甲酸單甲基酯、鄰苯二甲酸單乙基酯、鄰苯二甲酸單丁基酯、鄰苯二甲酸單芐基酯、鄰苯二甲酸單乙基己基酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯)的標(biāo)準(zhǔn)譜圖;

圖2為5個(gè)組分(壬基苯酚、辛基苯酚、丁基苯酚、雙酚A和三氯沙)標(biāo)準(zhǔn)品譜圖;

圖3為尿液樣本中9個(gè)組分(鄰苯二甲酸單甲基酯、鄰苯二甲酸單乙基酯、鄰苯二甲酸單丁基酯、鄰苯二甲酸單芐基酯、鄰苯二甲酸單乙基己基酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯)的圖譜;

圖4為尿液樣本中5個(gè)組分(壬基苯酚、辛基苯酚、丁基苯酚、雙酚A和三氯沙)的譜圖。

圖5為試劑盒模擬包裝圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例,可以更好地理解本發(fā)明。然而,本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解,實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明,而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例1:

一、材料

1.儀器 AB SCIEX API 4000+TM LC-MS/MS系統(tǒng)、醫(yī)用高速離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)、多管渦旋混合儀(杭州奧盛儀器有限公司)、快速混勻器(姜堰市康泰醫(yī)療器材廠)、可調(diào)移液器(Thermo Scientific公司)、優(yōu)普超純水儀(成都超純科技有限公司)等。

2.試劑 甲醇(色譜級(jí))、乙腈(色譜級(jí))均購自美國Tedia High Purity Solvent公司,乙酸乙酸(色譜級(jí))購自Adamas Reagent,Ltd,甲酸購自天津致遠(yuǎn)化學(xué)制劑有限公司,氨水,二水合氯化鈣、六水合氯化鎂、氯化鈉、硫酸鈉、檸檬酸鈉二水合物、草酸鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化銨、尿素、肌酐、重鉻酸鉀、濃硫酸等均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,超純水為自制。

3.標(biāo)準(zhǔn)品 鄰苯二甲酸單甲基酯(MMP)、鄰苯二甲酸單乙基酯(MEP)、鄰苯二甲酸單丁基酯(MnBP)、鄰苯二甲酸單芐基酯(MBzP)、鄰苯二甲酸單乙基己基酯(MEHP)、對羥基苯甲酸甲酯(MP)、對羥基苯甲酸乙酯(EP)、對羥基苯甲酸丙酯(PP)、對羥基苯甲酸丁酯(BP)、壬基苯酚(NP)、辛基苯酚(4-t-OP)、丁基苯酚(2,4-di-t-BP)、雙酚A(BPA)、三氯沙(Triclosan)均購自加拿大Toronto Research Chemical公司及德國Dr.Ehrenstorfer公司;

4.內(nèi)標(biāo)品 對羥基苯甲酸丙酯-d4(PP-D4)鄰苯二甲酸單正丁基酯-同位素-d4(MnBP-D4)、4-壬基苯酚-d8(NP-D8)(CDN ISOTOPES INC,德國Dr.Ehrenstorfer公司)

二、方法

先用高效液相色譜將經(jīng)過預(yù)凈化處理的尿液樣本進(jìn)行初步分離,串聯(lián)質(zhì)譜法負(fù)離子電噴霧離子化的多離子反應(yīng)監(jiān)測模式對目標(biāo)組分的母離子-子離子對進(jìn)行掃描,氘代同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行準(zhǔn)確定量,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度與內(nèi)標(biāo)品濃度比值為X軸,以標(biāo)準(zhǔn)品響應(yīng)峰面積與內(nèi)標(biāo)品響應(yīng)峰面積比值為Y軸,建立校正曲線,計(jì)算上述14種環(huán)境荷爾蒙的含量;

其中,色譜柱1和色譜柱2并聯(lián)設(shè)置,通過流動(dòng)相A1、B1與色譜柱1實(shí)現(xiàn)鄰苯二 甲酸單甲基酯、鄰苯二甲酸單乙基酯、鄰苯二甲酸單丁基酯、鄰苯二甲酸單芐基酯、鄰苯二甲酸單乙基己基酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯這9種組分的定量分析,分析結(jié)束后切換至流動(dòng)相A2、B2與色譜柱2實(shí)現(xiàn)壬基苯酚、辛基苯酚、丁基苯酚、雙酚A和三氯沙這5種組分定量分析;

具體色譜條件為:

(1)高效液相色譜條件:

色譜柱1:Kinetex XB-C18 100mm*2.1mm*2.6uM;

流動(dòng)相:A1,含0.1%v/v甲酸的水溶液;

流動(dòng)相:B1,乙腈;

洗脫梯度見表1;

柱溫:35℃;

流速:0.4mL/min;

進(jìn)樣量:20μL;

色譜柱2:BEH C18 50mm*2.1mm*1.7uM;

流動(dòng)相A2,含0.1%v/v氨水的水溶液;

流動(dòng)相B2,甲醇;

洗脫梯度見表2;

柱溫:50℃;

流速:0.2mL/min;

進(jìn)樣量:20μL;

(2)質(zhì)譜條件:

離子源:電噴霧Turbo Spray(ESI),負(fù)離子掃描;離子源溫度(TEM):550.00℃;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);碰撞氣:5.00Psi;氣簾氣(CUR):40.00Psi;霧化氣(GS1):55.00Psi;輔助氣(GS2):55.00Psi;電噴霧電壓(IS):-4500.00V。

電噴霧離子源(Negative Electro-spray ionization-,ESI-),多反應(yīng)監(jiān)測模式(Multiple reaction monitor,MRM);采集離子對見表3。

3.尿液基質(zhì)稀釋液準(zhǔn)備 準(zhǔn)確稱取二水合氯化鈣0.0559g、六水合氯化鎂0.0610g、氯化鈉0.4208g、硫酸鈉0.2060g、檸檬酸鈉二水合物0.0647g、草酸鈉0.0020g、磷酸二氫鉀0.2545g、氯化鉀0.1439g、氯化銨0.0920g、尿素0.2498g和肌酐0.1052g定容 至100mL,充分混勻,放置4℃待用。

4.玻璃器皿處理 在實(shí)驗(yàn)之前將所用玻璃離心管及移液管分別用重鉻酸鉀-濃硫酸洗液浸泡過液,然后用超純水充分清洗,自然晾干。

5.標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備與處理 分別稱取14種標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定容,分別得到14種2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液,然后用甲醇分級(jí)稀釋得到1μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液(其中單一標(biāo)準(zhǔn)品的濃度都是1μg/mL)待用,從工作液中分別移取適量標(biāo)液,用尿液基質(zhì)稀釋液定容得到不同濃度標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL各1mL,待用。分別移取內(nèi)標(biāo)品用甲醇定容至2mg/mL,然后分級(jí)稀釋得到0.5μg/mL混合氘代內(nèi)標(biāo)工作液待用(其中單一內(nèi)標(biāo)品的濃度都是0.5μg/mL);分別準(zhǔn)備200μL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn),向其中加入10μL β-葡萄糖甘酸酶,加入20μL混合氘代內(nèi)標(biāo)工作液,在37℃水浴中充分酶解2h,待酶解結(jié)束之后向其中加入400μL甲酸和甲醇的混合水溶液進(jìn)行稀釋,充分渦旋均勻,待SPE上樣凈化。其中,甲酸和甲醇的混合水溶液中,甲酸、甲醇和水的體積比為5∶10∶85。

6.SPE上樣凈化 活化 依次用1ml甲醇、1ml水進(jìn)行活化SPE小柱;上樣,移取預(yù)處理過的尿液樣本或標(biāo)準(zhǔn)品300uL進(jìn)行上樣,自然滴落,流出液棄去;淋洗,依次用1ml水、1ml 10%v/v甲醇水溶液淋洗小柱,淋洗液棄去,以真空泵抽干柱子約1min至近干;洗脫,1ml甲醇進(jìn)行洗脫,收集洗脫液;將洗脫液氮吹至近干,用100μL含0.1%v/v甲酸的甲醇水溶液復(fù)溶,其中,所述的含0.1%v/v甲酸的甲醇水溶液,甲醇和水體積比是1∶1。

7.尿液樣本的處理 準(zhǔn)備200uL 尿液樣本,向其中加入10μLβ-葡萄糖甘酸酶,加入20μL混合氘代內(nèi)標(biāo)液,在37℃水浴鍋中充分酶解2h,待酶解結(jié)束之后向其中加入400μL甲酸和甲醇的混合水溶液,充分渦旋均勻,待SPE上樣凈化即得。凈化程序同標(biāo)準(zhǔn)品6。

三、方法學(xué)評價(jià)

1.線性 分別將準(zhǔn)備好的混合標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1、2、5、10、20、50、100、200ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)按照正常樣本處理程序進(jìn)行處理然后進(jìn)樣分析,計(jì)算含量,考察各目標(biāo)物質(zhì)的線性關(guān)系。

2.精密度 分別準(zhǔn)備低、中、高三個(gè)具有代表性尿液樣本進(jìn)行六次重復(fù)處理,檢測各個(gè)組分含量,考察批內(nèi)重復(fù)性;準(zhǔn)備低、中、高三個(gè)具有代表性尿液樣本分三批進(jìn)行六 次重復(fù)處理,檢測各目標(biāo)組分含量,考察批間重復(fù)性。

3.添加回收考察 按照尿液樣品同樣處理方法處理分別處理同一尿液樣本,并在些尿液樣本基礎(chǔ)上分別添加兩個(gè)濃度L1和L2,分別進(jìn)行處理并測試結(jié)果,驗(yàn)證其添加回收效果。

四、結(jié)果

1、線性及保留時(shí)間考察

14種環(huán)境荷爾蒙在1~200ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(線性相關(guān)系數(shù)分別為0.9906~0.9999),保留時(shí)間參表4,10min可完成十四個(gè)目標(biāo)組分分析,各組分及對應(yīng)內(nèi)標(biāo)總離子流色譜圖參附圖1~2。

表4 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù),保留時(shí)間

2、精密度驗(yàn)證

采用本方法對低、中、高三個(gè)濃度代表性樣本進(jìn)行重復(fù)處理測試,各對應(yīng)目標(biāo)物質(zhì)批內(nèi)精密度(CV%)范圍為2.43%~12.85%,批間精密度(CV%)范圍為3.34%~14.30%,參表5。

表5 14個(gè)目標(biāo)組分批內(nèi)批間精密度

備注:L,M,H分別表示低,中,高三個(gè)濃度

3、正確度驗(yàn)證

按照正常尿液樣品進(jìn)行提取處理,多次測試求得L0,L1,L2平均值,求得對應(yīng)回收率,在低、高兩個(gè)濃度添加范圍內(nèi),回收率81.1%~116.3%,滿足100±20%要求,參表6。

表6 14個(gè)目標(biāo)組分添加回收數(shù)據(jù)

備注:L1、L2分別表示兩個(gè)濃度級(jí)別,單位:ng/mL

五、討論

環(huán)境荷爾蒙做為一種潛在的對人體有害的物質(zhì),隨著檢測技術(shù)的發(fā)展及相關(guān)研究的關(guān)注越來越多被人重視,也相繼有多種研究報(bào)告指出其在人體內(nèi)的存在會(huì)嚴(yán)重影響身體健康,造成男性不育、新生兒畸形、內(nèi)分泌紊亂等.目前檢測此類環(huán)境干擾物質(zhì)的常見方法有氣相色譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等,本研究采用目前國內(nèi)外公認(rèn)精準(zhǔn)度最高的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測。

本研究通過一次SPE固相萃取小柱凈化處理尿液樣本,可有效消除尿液中復(fù)基質(zhì)的干擾,保留時(shí)間穩(wěn)定,回收率高;兩次進(jìn)樣分析,在10min內(nèi)實(shí)現(xiàn)三類14種環(huán)境荷爾蒙的定量分析,提高分析效率。為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,分別考察了14種目標(biāo)組分不同濃度標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)線性范圍,在2~200ng/mL范圍內(nèi)線性良好,線性相關(guān)系數(shù)0.9906~0.9999;三個(gè)不同濃度代表性樣品批內(nèi)精密度(CV)為2.43%~12.85%,批間精密度:3.34%~14.30%,添加回收率81.1%~116.3%。綜上所述,本研究應(yīng)用LC-MS/MS檢測人體尿液中14種環(huán)境荷爾蒙含量靈敏度高,結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好,可以保證尿液樣本內(nèi)環(huán)境荷爾蒙含量測試的準(zhǔn)確性,可應(yīng)用于人體內(nèi)環(huán)境荷爾蒙暴露監(jiān)測分析。

五、分析試劑盒

分析試劑盒各組分見表7。

表7 分析試劑盒中各組分配制

上述試劑盒的制備方法:

,包括

(1)洗脫液

流動(dòng)相:A1,含0.1%v/v甲酸的水溶液;

流動(dòng)相:B1,乙腈;

流動(dòng)相:A2,含0.1%v/v氨水的水溶液;

流動(dòng)相:B2,甲醇。

(2)混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液

分別稱取鄰苯二甲酸單甲基酯、鄰苯二甲酸單乙基酯、鄰苯二甲酸單丁基酯、鄰苯二甲酸單芐基酯、鄰苯二甲酸單乙基己基酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、壬基苯酚、辛基苯酚、丁基苯酚、雙酚A、三氯沙各10mg用甲醇定容至5mL,得到14種2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液,然后用甲醇分級(jí)稀釋得到1μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

(3)混合氘代內(nèi)標(biāo)工作液

分別移取對羥基苯甲酸丙酯-d4鄰苯二甲酸單正丁基酯-同位素-d4、4-壬基苯酚-d8各10mg用甲醇定容至5mL,得到3種2mg/mL內(nèi)標(biāo)品溶液,然后用甲醇分級(jí)稀釋得到0.5μg/mL混合氘代內(nèi)標(biāo)工作液。

(4)稀釋液

尿液基質(zhì)稀釋液a:準(zhǔn)確稱取二水合氯化鈣0.0559g、六水合氯化鎂0.0610g、氯化鈉0.4208g、硫酸鈉0.2060g、檸檬酸鈉二水合物0.0647g、草酸鈉0.0020g、磷酸二氫鉀0.2545g、氯化鉀0.1439g、氯化銨0.0920g、尿素0.2498g和肌酐0.1052g用水定容 至100mL。

尿液前處理稀釋液b:分別移取甲酸5mL,甲醇10mL,用水定容至100mL。

(5)淋洗液/活化液:超純水200mL;10%甲醇水溶液:移取10mL甲醇用水定容至100mL。

(6)洗脫液/活化液:甲醇:色譜純。

(7)復(fù)溶液:0.1%甲酸甲醇水:分別移取甲醇水各499.5mL,然后加入1mL甲酸,定容至1L,得到0.1%v/v甲酸的甲醇水溶液,甲醇和水體積比是1∶1。

(8)質(zhì)控品:

QC(L):準(zhǔn)確移取1μg/mL含有14個(gè)目標(biāo)組分的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液5μL用尿液基質(zhì)稀釋液稀釋至1mL,得到濃度為5ng/mL QC(L)。

QC(M):準(zhǔn)確移取1μg/mL含有14個(gè)目標(biāo)組分的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液20μL用尿液基質(zhì)稀釋液稀釋至1mL,得到濃度為20ng/mL QC(M)。

QC(H):準(zhǔn)確移取1μg/mL含有14個(gè)目標(biāo)組分的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液100μL用尿液基質(zhì)稀釋液稀釋至1mL,得到濃度為100ng/mL QC(H)。

試劑盒內(nèi)部的模擬包裝參考圖5。試劑盒上下四周加膜,防震保溫,從左至右分為A,B,C,D四個(gè)部分,A部分放置4瓶洗脫液,B部分放置150mL及250mL4瓶溶液C部分放置另外7瓶小包裝溶液,D部分放置SPE小柱。

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