專利名稱：一種端基為熒光基團芘的水溶性陽離子聚電解質(zhì)及其制備方法及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光高分子聚合物及其制備方法，尤其涉及一種端基為熒光基團芘的水溶性陽離子聚電解質(zhì)及制備方法，并通過與DNA相互作用后的熒光性能變化實現(xiàn)對核酸分子堿基序列結(jié)構(gòu)的高效、穩(wěn)定、特異性識別，屬于功能高分子，材料及熒光傳感等技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
核酸分子堿基序列的定量分析和特異識別對生物醫(yī)學領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義。 核酸的檢測方法多種多樣，其中，熒光檢測系統(tǒng)因其選擇性好、靈敏度高而被廣泛應用。特別是熒光高分子在檢測生物大分子方面的研究已引起國內(nèi)外科學工作者的密切關(guān)注。芘由于能通過多種方式進行化學修飾，熒光量子產(chǎn)率較高以及其熒光強度受環(huán)境因素如溶劑，核酸堿基等影響較大而被廣泛應用到核酸檢測中。熒光基團芘以共價鍵連接的核酸分子探針由于其在與堿基序列互補的核酸分子雜化形成復鏈后熒光性能發(fā)生改變而被用于熒光探針特異性識別核酸分子。同時它也能克服一些小分子熒光染料如吖啶、菲啶類染料和菁類染料對核酸分子的序列不能特異識別的不足。比利時魯汶大學研究人員設(shè)計合成了一類新型熒光探針，芘修飾的以HNA、RNA和DNA為骨架的寡核苷酸熒光探針，探針分子與靶向分子雜化后，芘的單體態(tài)熒光(380nm)大大增強而激基復合物熒光(480nm)消失 (ChemBioChem. 2009, 10, 1175-1185)。美國Hrdlicka教授等研發(fā)的芘修飾的寡核苷酸熒光探針，可通過雜化誘導熒光增強和特異性鳥苷酸熒光淬滅機制有效地來識別單核苷酸多態(tài)性(Chem. Commun. 2010, 46，4929-4931)。日本 Yamana 等合成了一種芘修飾的 RNA 和 DNA 熒光探針，發(fā)現(xiàn)RNA探針在與靶向RNA雜化后熒光大大增強，而DNA熒光探針在與靶向DNA雜化后熒光并未有明顯的變化(Nucleic Acids Res. 2005，33，5887-5895)。還有一類發(fā)夾式熒光探針，其分子具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光功能基團A和B位于探針分子的兩端，即發(fā)夾結(jié)構(gòu)分子的莖部。美國佛羅里達大學的Tan等對發(fā)夾式分子信標檢測DNA/RNA核酸分子進行了廣 泛深入研究。但是這些標記型熒光探針需要將熒光基團通過共價鍵連結(jié)到寡聚核酸分子鏈上以實現(xiàn)特異性識別核酸分子，其中的合成與操作較繁雜，花費較高。
近年來，共軛聚電解質(zhì)作為熒光探針檢測蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的研究倍受青睞。這種共軛聚電解質(zhì)可與生物大分子形成靜電組裝體，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移等機制使其熒光性能改變，進而對生物大分子進行檢測。加州大學的Bazan教授，中國科學院化學研究所，中國科學院長春應用化學研究所的研究人員對共軛聚電解質(zhì)熒光檢測生物大分子進行了深入研究，取得了重要科研成果。Bazan等利用堿基序列互補的DNA核酸分子與固定在基片上的電中性肽核酸靶向雜化形成復鏈，陽離子共軛聚電解質(zhì)通過靜電吸附連結(jié)到核酸復鏈，從而使基片顯示共軛聚電解質(zhì)的熒光(Chem. Commun. 2004，2508-2509)。這種技術(shù)為無標記熒光探針特異性識別核酸分子開辟了新的研究方向。但這項技術(shù)的制備較復雜，且被固定的肽核酸是單分子膜，會限制雜化復鏈吸附熒光聚電解質(zhì)的數(shù)量，從而使檢測的熒光強度受限
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種端基為熒光基團芘的水溶性陽離子聚電解質(zhì)，其結(jié)構(gòu)通式如下
權(quán)利要求
1.一種端基為熒光基團芘的水溶性陽離子聚電解質(zhì)的制備方法，所述的方法步驟包括 (1)合成原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)劑的溴代反應 將芘甲醇溶于干燥THF和三乙胺，并置于反應容器中，冰水浴中冷卻到0-5攝氏度；逐滴加入1-2當量的2-溴-異丁酰溴和四氫呋喃的混合溶液，在室溫下回流反應8個小時；反應完成后，兩次抽濾掉不溶物溴胺鹽，旋蒸除去大部分的四氫呋喃溶劑，剩余物質(zhì)用二氯甲烷稀釋，并用飽和碳酸鉀溶液萃取，有機相通過無水硫酸鎂干燥過濾后旋蒸得到粗產(chǎn)物，用無水甲醇重結(jié)晶，真空干燥得淡黃色固體； (2)采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合制備端基為熒光基團芘的聚(甲基)丙烯酸二甲氨乙酯 將步驟(I)中得到的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)劑置于四氫呋喃溶劑中；再加入催化齊U，配位劑，聚合單體，在70攝氏度下進行原子轉(zhuǎn)移自由基聚合1. 5小時，用中性氧化鋁柱層析提純，旋蒸除去溶劑，并用冷正己烷沉淀，真空干燥得白色固體； (3)端基為熒光基團芘的聚(甲基)丙烯酸二甲氨乙酯的季銨鹽反應 將步驟(2)中得到的端基為芘熒光基團的聚(甲基)丙烯酸二甲氨乙酯置于乙醇溶劑中，逐滴加入6當量的季胺化小分子,在85攝氏度下回流反應24個小時；用四氫呋喃沉淀出產(chǎn)物，并索氏提取12個小時，四氫呋喃作提取劑，真空干燥得白色固體。
2.按照權(quán)利要求1所述端基為芘熒光基團的新型水溶性陽離子聚電解質(zhì)的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中，所用的聚合單體為丙烯酸芘甲酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯或它們的任意混合物。
3.按照權(quán)利要求1所述端基為芘熒光基團的新型水溶性陽離子聚電解質(zhì)的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中，聚合所用的催化劑為氯化亞銅、溴化亞銅或是碘化亞銅；所用的配位劑為1，1,4, 7，10，10-六甲基三亞乙基四胺或是N，N，N，N，N-五甲基二亞乙基三胺。
4.按照權(quán)利要求1所述端基為芘熒光基團的新型水溶性陽離子聚電解質(zhì)的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中，所用的季胺化小分子為鹵代烷烴包括溴代丁烷、碘甲烷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法制備的一種端基為熒光基團芘的水溶性陽離子聚電解質(zhì)，其結(jié)構(gòu)通式如下
6.利用權(quán)利要求5所述的端基為芘熒光基團的新型水溶性陽離子聚電解質(zhì)的特異性識別核酸分子堿基序列結(jié)構(gòu)的應用方法，所述方法步驟如下 (I)用磷酸鹽緩沖溶液將端基為熒光基團芘的水溶性陽離子聚電解質(zhì)配置成ιοΛιο /L的稀溶液； (2)將冷凍儲存的不同種類的DNA引物離心后溶解在適量磷酸鹽緩沖溶液配置成DNA稀溶液。所述的DNA引物種類及堿基序列如下 DNAl—發(fā)夾結(jié)構(gòu) DNAO^CA CAA ACA AGT AGA ATG TAT GTG C)； DNA2—與 DNA I 互補的直鏈 DNA (GCA CAT ACA TTC TAC TTG)； DNA3—與 DNA 2 互補的直鏈 DNA (GCA CAT ACA TTC TAC TTG)； DNAa—堿基全是 A 的直鏈 DNA (AAA AAA AAA AAA AAA AAA)； DNAc—堿基全是 C 的直鏈 DNA (CCC CCC CCC CCC CCC CCC)； DNAt—堿基全是 T 的直鏈 DNA (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)； (3)取適量聚電解質(zhì)溶液、適量不同類型的DNA引物溶液和磷酸鹽緩沖液混配成樣品溶液。所述的樣品溶液可分為兩個系列 系列a (聚電解質(zhì)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA)聚電解質(zhì)、聚電解質(zhì)+DNA1、聚電解質(zhì)+DNA1+DNA2、聚電解質(zhì)+DNAI+DNAa、聚電解質(zhì)+DNAI+DNAc和聚電解質(zhì)+DNAI+DNAt樣品溶液； 系列b (聚電解質(zhì)和直鏈結(jié)構(gòu)DNA)聚電解質(zhì)、聚電解質(zhì)+DNA2、聚電解質(zhì)+DNA2+DNA3、聚電解質(zhì)+DNA2+DNAa、聚電解質(zhì)+DNA2+DNAc和聚電解質(zhì)+DNA2+DNAt樣品溶液； (4)對樣品溶液進行加熱處理80攝氏度下加熱10分鐘后自然冷卻到室溫，測定樣品溶液的熒光發(fā)射光譜。根據(jù)熒光強度變化來識別靶向DNA的堿基序列。其中所用到的狹縫寬度是2. 5nm，激發(fā)波長是344nm ； (5)將DNAl和DNA2互補的DNA雙鏈溶液1、DNA2和DNA3互補的DNA雙鏈溶液2和聚電解質(zhì)分別與DNAl和DNA2互補的DNA雙鏈及DNA2和DNA3互補的DNA雙鏈混配得到混合溶液3和4進行如步驟(4)所屬的加熱處理，然后測定4種溶液的圓二色譜； (6)向步驟(3)混配得到的系列a和系列b樣品溶液中分別加入適量碘化鉀溶液，并在波長為344nm的光激發(fā)下，測得各混合溶液的熒光發(fā)射光譜，得到不同樣品溶液的熒光淬滅效率。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種熒光高分子聚合物及其制備方法，尤其涉及一種端基為熒光基團芘的水溶性陽離子聚電解質(zhì)及制備方法，并應用于檢測核酸分子堿基序列。這種端基為熒光基團芘的水溶性陽離子聚電解質(zhì)和單鏈寡聚核酸分子(發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA和直鏈結(jié)構(gòu)DNA)之間的靜電吸附和疏水作用使其形成一個新型復鏈熒光探針。當遇到與之堿基序列結(jié)構(gòu)互補的核酸分子時，通過Watson-Crick堿基配對原則雜化，由于端基熒光基團芘插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，使得堿基對芘熒光的淬滅能力增強，導致其熒光強度相比于與非靶向核酸分子作用顯著降低；從而通過芘熒光聚電解質(zhì)的熒光性能差異實現(xiàn)對核酸分子堿基序列結(jié)構(gòu)的特異性識別。
文檔編號C12Q1/68GK103012639SQ201210245819
公開日2013年4月3日 申請日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者王國杰, 趙敏, 楊領(lǐng)葉, 張瑞辰 申請人:北京科技大學