本發(fā)明屬于藥物動力學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種LC-MS/MS(液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù))測定大鼠血漿中Ly-7u濃度的方法。

背景技術(shù)：

極光激酶(aurora kinases)是細(xì)胞有絲分裂過程中一類重要的蛋白激酶，在細(xì)胞的有絲分裂中起著重要的調(diào)控作用，近年來，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)極光激酶在腫瘤形成中具有重要功能，因此一系列激酶抑制劑被開發(fā)研究。

化合物L(fēng)y-7u為本發(fā)明人團(tuán)隊(duì)前期的研究成果，其結(jié)構(gòu)式如下所示。體外研究顯示，該化合物具有很好的抗腫瘤活性，且具有Aurora A/B激酶抑制活性和選擇性，具有很好的應(yīng)用前景，目前該化合物已處于臨床前研究研究階段。

藥代動力學(xué)評估是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律，并運(yùn)用數(shù)學(xué)原理和方法闡述血藥濃度隨時(shí)間變化的規(guī)律。隨著藥物化學(xué)的發(fā)展及人類健康水平的不斷提高，對藥物的藥代動力學(xué)性質(zhì)的要求越來越高：判斷一個(gè)藥物的應(yīng)用前景特別是市場前景，不單純是療效強(qiáng)，毒副作用?。桓邆淞己玫乃幋鷦恿W(xué)性質(zhì)。而藥物在血漿中濃度的檢測技術(shù)是藥代動力學(xué)分析評估的重要前提技術(shù)。因此，為滿足Ly-7u藥代動力學(xué)評估的需要，一種靈敏度高、穩(wěn)定可靠的Ly-7u血漿濃度檢測方法是研究其口服生物利用度的基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的是提供一種檢測大鼠血漿中Ly-7u濃度的方法，是一種快速、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度高的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，滿足Ly-7u臨床前研究的需要，可為該化合物的新藥臨床前研究提供技術(shù)支持。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種LC-MS/MS測定大鼠血漿中Ly-7u濃度的方法，包括如下步驟：

S1.配制標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密稱取Ly-7u和內(nèi)標(biāo)Ly-7z粉末，分別用甲醇水溶液溶解，并稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作液；

S2.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密量取大鼠空白血漿，加入一系列Ly-7u標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入內(nèi)標(biāo)Ly-7z標(biāo)準(zhǔn)工作液，采用液液萃取提取方法前處理，后利用LC-MS/MS進(jìn)行分析，得到各樣本色譜圖，以待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積比為橫坐標(biāo)，以待測物濃度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；

S3.待測樣本血漿處理：精密量取給藥Ly-7u后大鼠血漿，加入內(nèi)標(biāo)，采用液液萃取提取方法前處理；

S4.利用LC-MS/MS進(jìn)行分析，得到各樣品的色譜圖，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本血漿的濃度。

其中，優(yōu)選地，步驟S1所述甲醇水溶液的體積比組成為甲醇：水＝90：10。

優(yōu)選地，步驟S1所述用甲醇水溶液溶解后還需經(jīng)過超聲5～15min進(jìn)行溶解。

更優(yōu)選地，是超聲10min進(jìn)行溶解。

優(yōu)選地，步驟S2中加入Ly-7u標(biāo)準(zhǔn)工作液和加入內(nèi)標(biāo)Ly-7z標(biāo)準(zhǔn)工作液后，都需要輕渦混勻。

優(yōu)選地，步驟S2所述液液萃取選用乙酸乙酯。

更優(yōu)選地，步驟S2或S3所述液液萃取提取方法前處理為：加入1mL乙酸乙酯，渦旋2min，靜置10min，15000rpm離心10min，吸取上清液，室溫下真空揮干，加入復(fù)溶液溶解，渦旋1.5min，15000rpm離心5min；所述復(fù)溶液的體積比組成為：甲醇：0.1％甲酸水＝9：1，其中還含有5mM醋酸銨。

優(yōu)選地，步驟S2或S4所述LC-MS/MS的色譜條件設(shè)定如下：流動相為甲醇(A)/水(含0.1％甲酸和5mM的乙酸銨)(B)；梯度洗脫(0–1min,5％–90％A；1–4min,90％–90％A；4–4.1min,90％–5％A；4.1–5min,90％–90％A)；

流速0.3mL·min^-1；進(jìn)樣量2μL；柱溫25℃；MRM模式：Ly-7u：m/z 410→m/z353；Ly-7z：m/z 457→m/z 368。

優(yōu)選地，步驟S2或S4所述LC-MS/MS中Ly-7u的定量子離子為353m/z，內(nèi)標(biāo)定量子離子為368m/z。

優(yōu)選地，所有用到的水均為超純水，所有有機(jī)試劑均為HPLC級。

優(yōu)選地，所述LC-MS/MS為UHPLC-MS/MS。

另外，優(yōu)選地，步驟S2中大鼠空白血漿：Ly-7u標(biāo)準(zhǔn)工作液：內(nèi)標(biāo)Ly-7z標(biāo)準(zhǔn)工作液的體積比＝9：1：4。

更優(yōu)選地，是取45μl大鼠空白血漿，加入5μL Ly-7u標(biāo)準(zhǔn)工作液和20μL內(nèi)標(biāo)溶液，所述液液萃取提取時(shí)乙酸乙酯用量為1mL。

具體優(yōu)選地，步驟S2所述液液萃取方法前處理為：

加入1mL乙酸乙酯，渦旋2min，靜置10min，15000rpm離心10min，吸取800μL上清液至另一干凈1.5mL離心管中，室溫下真空揮干，加入200μL復(fù)溶液[甲醇/0.1％甲酸水(含5mM醋酸銨)＝9:1，v/v]溶解，渦旋1.5min，15000rpm離心5min。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明首次提供了一種LC-MS/MS測定大鼠血漿中Ly-7u濃度的方法，對血漿樣本前處理方法進(jìn)行探究并優(yōu)化，使得所采用的方法操作簡便，高效穩(wěn)定，處理時(shí)間短，使用萃取溶劑安全無毒。

同時(shí)，本發(fā)明由于對色譜條件進(jìn)行合理設(shè)置，使得采用本發(fā)明的方法所得的待測物和內(nèi)標(biāo)色譜圖穩(wěn)定可靠，檢測技術(shù)靈敏度高，分析時(shí)間短，且準(zhǔn)確度和精密度高，可很好的滿足Ly-7u藥代動力學(xué)評估的需要。

本發(fā)明建立的大鼠血漿中Ly-7u的LC-MS/MS檢測方法，可應(yīng)用于研究Ly-7u大鼠口服生物利用度，達(dá)到該方法滿足Ly-7u臨床前研究的目的。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1建立的Ly-7u離子質(zhì)譜圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1建立的測定大鼠血漿中Ly-7u濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1建立的LC-MS/MS方法的樣本色譜圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2建立的LC-MS/MS方法的樣本色譜圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例3建立的測定大鼠單次口服及靜注Ly-7u制劑后藥時(shí)曲線圖；其中，縱坐標(biāo)為Ly-7u濃度(C)的對數(shù)值。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。

實(shí)施例1

1、建立測定大鼠血漿中Ly-7u濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線：

(1)標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：

精密稱取Ly-7u標(biāo)準(zhǔn)品3.00mg于10ml容量瓶中，甲醇/水(9:1)定容，超聲10min溶解，即得300μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于-20℃保存。制備濃度分別為50,000、40,000、20,000、10,000、5000、2000、500、100、20、5、2.5ng/mL的Ly-7u標(biāo)準(zhǔn)工作液。

精密稱取內(nèi)標(biāo)Ly-7z標(biāo)準(zhǔn)品5.00mg于5ml容量瓶中，甲醇/水(9:1)定容，超聲10min溶解，即得1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于-20℃保存。使用前用(甲醇/水＝50/50，v/v)稀釋成500ng/ml標(biāo)準(zhǔn)工作液。

內(nèi)標(biāo)Ly-7z的結(jié)構(gòu)式如下所示：

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：

1)取標(biāo)準(zhǔn)工作液5μl加入45μl空白大鼠血漿，輕渦混勻，加入內(nèi)標(biāo)溶液20μL，輕渦混勻，加入1mL乙酸乙酯，渦旋2min，靜置10min，15000rpm離心10min，吸取800μL上清液至另一干凈1.5mL離心管中，室溫下真空揮干，加入200μL復(fù)溶液[甲醇/0.1％甲酸水(含5mM醋酸銨)＝9:1，v/v]溶解，渦旋1.5min，15000rpm離心5min。上清120μl移入進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣2μL，進(jìn)行UHPLC-MS/MS分析。

2)精密吸取供試品溶液120μL進(jìn)樣，采用以下色譜條件進(jìn)行洗脫：

色譜柱hypersil gold C18色譜柱(2.1mm×100mm,1.9μm；Thremo,USA)；

流動相為甲醇(A)/水(含0.1％甲酸和5mM的乙酸銨)(B)，梯度洗脫(0–1min,5％–90％A；1–4min,90％–90％A；4–4.1min,90％–5％A；4.1–5min,90％–90％A)；

流速0.3mL·min^-1；進(jìn)樣量2μL；柱溫25℃；MRM模式：Ly-7u：m/z 410→m/z353；Ly-7z：m/z 457→m/z 368。結(jié)果如圖1所示。

3)進(jìn)行LC-MS/MS分析，以不同濃度的Ly-7u的峰面積與內(nèi)標(biāo)Ly-7z的峰面積之比Y為縱坐標(biāo)，以Ly-7u的血藥濃度C為橫坐標(biāo)進(jìn)行直線回歸，得回歸方程及R²。以信噪比S/N＝3計(jì)，得該方法的最低檢測濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如圖2所示。

2、建立的LC-MS/MS方法的樣本色譜圖

大鼠血漿樣品50μL，置于1.5mL EP管中，加入相應(yīng)內(nèi)標(biāo)溶液20μL，加入1mL乙酸乙酯，渦旋2min，靜置10min，15000rpm離心10min，吸取800μL上清液至另一干凈1.5mL離心管中，室溫下真空揮干，加入200μL復(fù)溶液[甲醇/0.1％/甲酸水(含5mM醋酸銨)＝9:1，v/v]溶解，渦旋1.5min，15000rpm離心5min，上清120μl移入進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣2μL，進(jìn)行UHPLC-MS/MS分析。

以Ly-7u的峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比Y代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Ly-7u的血藥濃度C。

2、樣本色譜圖結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，色譜圖中待測物和內(nèi)標(biāo)峰形平滑對稱，無干擾峰，色譜圖穩(wěn)定可靠，出峰時(shí)間分別為2.94min和2.99min，分析時(shí)間短。表明本測定方法高效、穩(wěn)定，可很好的滿足Ly-7u藥代動力學(xué)評估的需要。

實(shí)施例2加標(biāo)樣本檢測

1、加標(biāo)血漿樣本前處理

(1)從空白大鼠眼眶靜脈叢采血約300μL。血樣品置于肝素化EP管中，全血經(jīng)4000rpm離心5min吸取上層血漿，即空白大鼠血漿，按100μL分裝后于-80℃貯存。

將Ly-7u外加入空白大鼠血漿，得到Ly-7u濃度為0.5、50、500、4000ng/mL的加標(biāo)血漿樣品。

(2)取加標(biāo)血漿樣品100μL，按照實(shí)施例1的樣本前處理進(jìn)行處理后，取上清80μL移入進(jìn)樣瓶中。

2、加標(biāo)血漿樣本檢測

進(jìn)樣10μL進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，條件同實(shí)施例1。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿樣本濃度0.4±0.05、49.1±1.4、505.0±11.2、3923.3±158.7ng/mL，其中Ly-7u濃度為50ng/mL的樣本色譜圖如圖4所示。

表明本測定方法可以很準(zhǔn)確的測定分析血漿中Ly-7u的濃度，且色譜圖中待測物和內(nèi)標(biāo)峰形平滑對稱，無干擾峰，色譜圖穩(wěn)定可靠，方法高效、穩(wěn)定，可很好的滿足Ly-7u藥代動力學(xué)評估的需要。

實(shí)施例3樣本檢測

1、SD大鼠單次灌胃口服Ly-7u制劑的絕對生物利用度研究血漿樣本前處理

(1)SD大鼠單次灌胃、靜脈注射給藥后，依照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采樣時(shí)間方案，從眼眶靜脈叢采血約300μL。血樣品置于肝素化EP管中，全血經(jīng)4000rpm離心5min吸取上層血漿，按100μL分裝后于-80℃貯存至測定。

(2)大鼠血漿樣品100μL，同實(shí)施例1所述的樣本前處理方法進(jìn)行前處理，取上清80μL移入進(jìn)樣瓶中。

2、SD大鼠單次灌胃口服Ly-7u制劑的絕對生物利用度研究血漿樣本檢測

進(jìn)樣10μL進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，條件同實(shí)施例1，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿樣本濃度。

結(jié)果顯示，口服、靜注組SD大鼠血漿中各時(shí)間點(diǎn)Ly-7u的濃度如圖5所示。