本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及酒石酸鹽作為C反應(yīng)蛋白屏蔽劑的應(yīng)用，以及一種凝血診斷試劑。

背景技術(shù)：

C反應(yīng)蛋白(C-Reactive Protein，CRP)影響凝血過(guò)程，可與血漿中的鈣離子(凝血因子IV)反應(yīng)，影響光學(xué)法凝血功能檢測(cè)，它能促進(jìn)凝血機(jī)制，加速纖維蛋白單體聚合，縮短凝血時(shí)間。研究發(fā)現(xiàn)，CRP含量越高，纖維蛋白凝塊強(qiáng)度就越大。

在凝血功能檢查中，凝固法是檢測(cè)PT、APTT、FIB、TT、內(nèi)源凝血因子(FVIII、XI、XII)以及外源凝血因子(FII、V、VII、X)的最多用方法，它是基本測(cè)試原理是光學(xué)法的散射光檢測(cè)(用660nm光電二極管檢測(cè)散射光量的變化)，還并用了百分比式的測(cè)定原理。

當(dāng)試劑加入標(biāo)本后，凝血開始啟動(dòng)，隨之光學(xué)出現(xiàn)變化，儀器把這種光學(xué)的變化描繪成凝固曲線：把開始出現(xiàn)凝集的起始點(diǎn)作為0％、把完全凝固的終點(diǎn)作為100％、把50％變化點(diǎn)處作為凝固時(shí)間(報(bào)告點(diǎn))，當(dāng)測(cè)定含有干擾物(黃疸、溶血、高脂血癥等)或低纖維蛋白原血癥的特殊樣本時(shí)，其作為起始點(diǎn)的0％的基線會(huì)隨之上移或下移，相當(dāng)于扣除本底干擾。以APTT為例，血漿樣本經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的溫育后，加入反應(yīng)試劑，儀器采用波長(zhǎng)為660nm的光照射反應(yīng)物，通過(guò)測(cè)量透射光或散射光量的改變來(lái)測(cè)定凝血過(guò)程，即纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性的纖維蛋白過(guò)程中的濁度變化，從透射光或散射光量的測(cè)定可得凝固曲線，再通過(guò)百分比原理求得凝血時(shí)間。

凝血值(即可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性纖維蛋白所需時(shí)間)是通過(guò)光量的變化來(lái)體現(xiàn)的，在此過(guò)程中，凝血時(shí)間與凝血因子有關(guān)，與CRP無(wú)關(guān)，但是，當(dāng)血漿中含有CRP時(shí)，由于CRP參與凝血過(guò)程，它會(huì)與鈣離子形成復(fù)合物并沉淀，引起光量的變化。在采用光學(xué)法測(cè)定凝血功能時(shí)，檢測(cè)設(shè)備會(huì)將該變化歸固于由凝血因子造成，從而導(dǎo)致凝血結(jié)果不準(zhǔn)確。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種酒石酸鹽作為C反應(yīng)蛋白屏蔽劑的應(yīng)用。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種測(cè)定凝血功能的方法，該方法基于酒石酸鹽對(duì)C反應(yīng)蛋白屏蔽劑的作用原理，可有效抑制C反應(yīng)蛋白在測(cè)定凝血功能時(shí)對(duì)凝血值的干擾，從而保證凝血功能檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

酒石酸鹽作為C反應(yīng)蛋白屏蔽劑的應(yīng)用。

血漿中的C反應(yīng)蛋白，會(huì)與血漿中存在的凝血因子或部分凝血凝血因子反應(yīng)，加入酒石酸鹽，可以避免某些凝血因子與C反應(yīng)蛋白之間的反應(yīng)。

優(yōu)選的，如上所述的應(yīng)用，所述酒石酸鹽為酒石酸金屬離子鹽。

優(yōu)選的，如上所述的應(yīng)用，所述酒石酸鹽為酒石酸的堿金屬鹽或酒石酸鎂。

優(yōu)選的，如上所述的應(yīng)用，所述堿金屬鹽可選自酒石酸鉀、酒石酸鈉、酒石酸鉀鈉復(fù)合鹽等，更優(yōu)選的為酒石酸鈉。

一種凝血診斷試劑，其特征在于，包括酒石酸鈉；

所述診斷試劑作為添加劑添加于光學(xué)法檢測(cè)凝血功能的檢測(cè)反應(yīng)體系中。

C反應(yīng)蛋白(C-Reactive Protein，CRP)是一種急性時(shí)相蛋白，單條多肽鏈上含187個(gè)氨基酸，氨基端殘基為吡咯烷酮羧酸，羧基端為脯氨酸。CRP會(huì)結(jié)合在死亡細(xì)胞或微生物外膜上的磷酸膽堿(phosphocholine)，以活化補(bǔ)體系統(tǒng)。當(dāng)體內(nèi)有急性炎癥、細(xì)菌感染、組織的損傷時(shí)，CRP在數(shù)小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)，而疾病治愈后又很快就消失。CRP是急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，正常情況下含量極小，但在急性創(chuàng)傷和感染時(shí)，CRP的濃度急劇升高。

由于現(xiàn)有的凝血功能檢測(cè)多基于光學(xué)法檢測(cè)，而CRP可與血漿中的鈣離子(凝血因子IV)反應(yīng)，影響光學(xué)法凝血功能檢測(cè)，因此屏蔽CRP對(duì)提升凝血功能檢測(cè)的準(zhǔn)確性有很大幫助。

現(xiàn)有的凝血功能檢測(cè)反應(yīng)體系可選自用于測(cè)定凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)或活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)的反應(yīng)體系，這些反應(yīng)體系屬于現(xiàn)有技術(shù)，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟悉的。更優(yōu)選的，選自光學(xué)法檢測(cè)凝血功能的檢測(cè)反應(yīng)體系。

優(yōu)選的，如上所述的凝血診斷試劑，所述酒石酸鈉在所述光學(xué)法檢測(cè)凝血功能的檢測(cè)反應(yīng)體系中的終濃度為3mM～50mM。

優(yōu)選的，如上所述的凝血診斷試劑，所述酒石酸鈉在所述光學(xué)法檢測(cè)凝血功能的檢測(cè)反應(yīng)體系中的終濃度為10mM～25mM。

優(yōu)選的，如上所述的凝血診斷試劑，所述診斷試劑中還包括鈣離子。更優(yōu)選的，所述鈣離子以氯化鈣的形式加入。

優(yōu)選的，如上所述的凝血診斷試劑，所述鈣離子在所述光學(xué)法檢測(cè)凝血功能的檢測(cè)反應(yīng)體系中的終濃度為3mM～20mM。

優(yōu)選的，如上所述的凝血診斷試劑，所述鈣離子在所述光學(xué)法檢測(cè)凝血功能的檢測(cè)反應(yīng)體系中的終濃度為6mM～10mM。

在本發(fā)明的另一方面，還涉及一種用于測(cè)定凝血功能的試劑盒，所述試劑盒包含酒石酸鈉。

優(yōu)選的，所述試劑盒為用于測(cè)定凝血酶時(shí)間、凝血酶原時(shí)間或活化部分凝血活酶時(shí)間的體外診斷試劑盒。

優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述試劑盒中還包含鈣鹽。

優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述鈣鹽為氯化鈣；還可以選自硫酸鈣等可電離出二價(jià)鈣離子的鈣鹽。

優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述試劑盒為活化部分凝血活酶時(shí)間的體外診斷試劑盒；

所述試劑盒中還包括磷脂和活化劑；

優(yōu)選的，所述磷脂及活化劑組成第一試劑，所述鈣鹽及酒石酸鈉組成第二試劑。

優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述活化劑選自白陶土、鞣花酸、硅藻土中的任一種，更優(yōu)選為鞣花酸。

優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述磷脂為合成磷脂；

優(yōu)選的，所述合成磷脂包括質(zhì)量比為(25～35)：70的磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿，可選地，還包括磷脂酰乙醇胺或磷脂酰甘油中的一種。

優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，在所述第一試劑中，所述磷脂的濃度為50～600μg/mL，優(yōu)選為100～200μg/mL；磷脂的濃度還可以選自120～180μg/mL；140～160μg/mL；

所述活化劑的濃度按磷脂與活化劑的濃度比1000：1～50：1加入，優(yōu)選為100：1～50：1。

優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，所述第一試劑中還包括緩沖液、穩(wěn)定劑以及調(diào)節(jié)劑中的一種或多種；

優(yōu)選的，所述緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷、4-羥乙基哌嗪乙磺酸和3-(N-嗎啉)丙磺酸中的一種或多種；更優(yōu)選的，所述緩沖液的濃度為20～100mM；pH為6～8。

優(yōu)選的，為了避免APTT測(cè)定試劑中的磷脂氧化，同時(shí)也為了制備穩(wěn)定性較好的APTT測(cè)定試劑，包括避免試劑中微生物和細(xì)菌的繁衍，試劑盒中還需要添加穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑選自氯化鈉、苯酚以及甘氨酸中的一種或多種；所述氯化鈉的濃度為20～150mM；所述苯酚的濃度為0.5～3mg/L；所述甘氨酸的濃度為質(zhì)量體積百分比1～3％；

優(yōu)選的，所述調(diào)節(jié)劑為二價(jià)金屬離子的鹽類和/或胍化合物；

更優(yōu)選的，所述二價(jià)金屬離子的鹽類選自硫酸銅、硫酸鎳、硫酸鎂和氯化鎂中的一種或多種；最優(yōu)選的為氯化鎂；所述氯化鎂的濃度為0.1～2mM；

更優(yōu)選的，所述胍化合物選自氨基胍鹽酸鹽，濃度為50～200mM，更優(yōu)選為80～150mM。

優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，在所述第二試劑中，所述鈣鹽的濃度為10mM～50mM，更優(yōu)選為20～30mM；所述酒石酸鈉的濃度為15～150mM，更優(yōu)選為30mM～70mM。

優(yōu)選的，如上所述的試劑盒，在所述第二試劑中還包括丁基羥基茴香醚、苯酚和緩沖液中的一種或多種；

優(yōu)選的，所述丁基羥基茴香醚的濃度為質(zhì)量體積百分比0.01～0.1％；

優(yōu)選的，所述苯酚的濃度為0.5～3mg/L；

優(yōu)選的，所述緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷、4-羥乙基哌嗪乙磺酸和3-(N-嗎啉)丙磺酸中的一種或多種；更優(yōu)選的，所述緩沖液的濃度為20～100mM；pH為6～8。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

當(dāng)采用凝固法測(cè)定血漿的APTT值，血漿中C反應(yīng)蛋白的存在，會(huì)影響APTT值，因?yàn)樵谀谭y(cè)定APTT時(shí)，APTT的值是通過(guò)透射光量變化(δD值)來(lái)確定的，而C反應(yīng)蛋白會(huì)導(dǎo)致透射光量變化(δD值)發(fā)生變化，特別是在測(cè)定過(guò)程的初期，由C反應(yīng)蛋白與血漿中含有的成份發(fā)生反應(yīng)而引起的透射光量變化(δD值)，會(huì)使凝血分析儀誤以為是由血漿中的凝血因子引起，從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)誤差。

加入酒石酸鹽后，可屏蔽血漿中C反應(yīng)蛋白對(duì)APTT結(jié)果的影響，提升光學(xué)法(凝固法)檢測(cè)APTT的準(zhǔn)確度，從而更好地反映臨床病人的凝血功能。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例3的結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例4的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

除非另有限定，本發(fā)明使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與所公開的實(shí)施方案所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。雖然與本發(fā)明所述的方法和材料類似或等同的方法和材料可用于本實(shí)施方式的實(shí)踐或測(cè)試中，但下文仍然描述了合適的方法和材料。本發(fā)明提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利以及其他參考文獻(xiàn)通過(guò)引用全部?jī)?nèi)容結(jié)合于本文中。在沖突的情況下，本說(shuō)明書(包括定義)將起支配作用。此外，材料、方法以及實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的，而不旨在限制。實(shí)施方式的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將從以下詳細(xì)的說(shuō)明書和權(quán)利要求中變得明顯。

為了促進(jìn)理解本文描述的實(shí)施方式這一目的，將參考某些實(shí)施方式，并且將使用特定語(yǔ)言來(lái)描述這些實(shí)施方式。本文所使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述具體實(shí)施方式目的，而不旨在限制本公開的范圍。

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

一種測(cè)定凝血功能的試劑盒，其包括第一試劑和第二試劑。

第一試劑主要由磷脂及活化劑配置而成，配置方法為常規(guī)方法，各組份之間的關(guān)系和終濃度為；

磷脂選自質(zhì)量比為25：70：20的磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺；磷脂在第一試劑中的終濃度為50μg/mL。

活化劑選自硅藻土；硅藻土的濃度按磷脂與活化劑的濃度比1000：1加入。

第一試劑中還包括穩(wěn)定劑以及調(diào)節(jié)劑。

穩(wěn)定劑選自甘氨酸；在第一試劑中的終濃度為質(zhì)量體積百分比2％；

調(diào)節(jié)劑選自硫酸銅；在第一試劑中的終濃度為2mM；

第二試劑主要由磷脂及活化劑配置而成；

在第二試劑中，鈣鹽的濃度為10mM；所述酒石酸鈉的濃度為150mM。

第二試劑中還包括丁基羥基茴香醚，丁基羥基茴香醚的濃度為質(zhì)量體積百分比0.1％；調(diào)節(jié)第二試劑pH為7.4。

實(shí)驗(yàn)例2

一種測(cè)定凝血功能的試劑盒，其包括第一試劑和第二試劑。

第一試劑主要由磷脂及活化劑配置而成，配置方法為常規(guī)方法，各組份之間的關(guān)系和終濃度為；

磷脂包括質(zhì)量比為35：70的磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿，磷脂的濃度為200μg/mL。

活化劑選自白陶土；白陶土的濃度按磷脂與活化劑的濃度比50：1加入。

第一試劑中還包括緩沖液、穩(wěn)定劑以及調(diào)節(jié)劑；

緩沖液選自4-羥乙基哌嗪乙磺酸，濃度為100mM；pH為7。

穩(wěn)定劑選自苯酚；濃度為2mg/L.

調(diào)節(jié)劑為硫酸鎂和氨基胍鹽酸鹽；

硫酸鎂的濃度為1.2mM；氨基胍鹽酸鹽濃度為150mM。

第二試劑主要由鈣鹽及酒石酸鈉組成；

在第二試劑中，鈣鹽的濃度為50mM；酒石酸鈉的濃度為15mM。

第二試劑中還包括苯酚和緩沖液；

苯酚的濃度為2mg/L；

沖液選自3-(N-嗎啉)丙磺酸；緩沖液的濃度為70mM；pH為7。

實(shí)施例3

酒石酸鈉與氯化鈣共同作用抑制C反應(yīng)蛋白對(duì)凝血檢測(cè)過(guò)程中透射光量的影響。

稱取1.5g三羥甲基氨基甲烷和5.8g氯化鈉，加入500mL純化水中，混勻，加入10％鹽酸1mL，攪拌溶解，測(cè)定混合液的pH，如果混合液的pH值不為7.3，用稀鹽酸或稀氫氧化鈉調(diào)整至pH值7.3，定容至900mL，加入100mg的合成磷脂和0.5的丁基羥基茴香醚，所述合成磷脂包括質(zhì)量比為25：70的磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿，攪拌30min，加入2mg鞣花酸、0.05g氯化鎂、5.5g氨基胍鹽酸鹽、15g甘氨酸、1mg苯酚，加入純化水至1升，繼續(xù)攪拌30min，用濾膜過(guò)濾，得濾液為第一試劑。

稱取1.5g三羥甲基氨基甲烷和5.8g氯化鈉，加入500mL純化水中，混勻，加入10％鹽酸1mL，攪拌溶解，測(cè)定混合液的pH，如果混合液的pH值不為7.3，用稀鹽酸或稀氫氧化鈉調(diào)整至pH值7.3，定容至900mL，加入2.77g氯化鈣、1mg苯酚、9.7g酒石酸鈉(購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京公司)，攪拌30min，過(guò)濾得第二試劑。

作為對(duì)比的方式，將待測(cè)樣本分為兩組：

待測(cè)樣本為在正常血漿中添加不同濃度的C反應(yīng)蛋白(Randox Laboratories)，C反應(yīng)蛋白的濃度從2.65mg/L～3.15mg/L的范圍內(nèi)梯度分布(圖1橫坐標(biāo)所示)。

第一組：50μL待測(cè)樣本與50μL的上述第一試劑混合及50μL的上述第二試劑混合孵育，測(cè)定第二試劑加入前與加入3min后的透射光量變化δD。δD的值越大，說(shuō)明待測(cè)樣本中C反應(yīng)蛋白的干擾能力越強(qiáng)。其中，C反應(yīng)蛋白對(duì)凝血功能的檢測(cè)影響是通過(guò)對(duì)比得出的。

第二組與第一組的區(qū)別僅在于第二組所用的第二試劑中并未添加酒石酸鈉。

結(jié)果如圖1所示，從圖1可知，單獨(dú)添加氯化鈣并不能有效抑制C反應(yīng)蛋白對(duì)檢測(cè)結(jié)果中透射光量的影響；而氯化鈣和酒石酸鈉的組合則可以有效抑制C反應(yīng)蛋白。

實(shí)施例4

酒石酸加入量對(duì)凝血檢測(cè)過(guò)程中透射光量的影響。

稱取1.5g三羥甲基氨基甲烷和5.8g氯化鈉，加入500mL純化水中，混勻，加入10％鹽酸1mL，攪拌溶解，測(cè)定混合液的pH，如果混合液的pH值不為7.3，用稀鹽酸或稀氫氧化鈉調(diào)整至pH值7.3，定容至900mL，加入100mg的合成磷脂和0.5的丁基羥基茴香醚，所述合成磷脂包括質(zhì)量比為30：70的磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿，攪拌30min，加入2mg鞣花酸、0.05g氯化鎂、5.5g氨基胍鹽酸鹽、15g甘氨酸、1mg苯酚，加入純化水至1升，繼續(xù)攪拌30min，用濾膜過(guò)濾，得濾液為第一試劑。

稱取1.5g三羥甲基氨基甲烷和5.8g氯化鈉，加入500mL純化水中，混勻，加入10％鹽酸1mL，攪拌溶解，測(cè)定混合液的pH，如果混合液的pH值不為7.3，用稀鹽酸或稀氫氧化鈉調(diào)整至pH值7.3，定容至900mL，加入2.77g氯化鈣、1mg苯酚、酒石酸鈉，攪拌30min，過(guò)濾得第二試劑。

作為對(duì)比的方式，將50μL的第二試劑中酒石酸鈉的添加量按不同濃度配制。酒石酸鈉的加入量為0～200mM，對(duì)應(yīng)的δD變化如圖2所示。δD的值越大，說(shuō)明待測(cè)樣本中C反應(yīng)蛋白的干擾能力越強(qiáng)。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。