本發(fā)明涉及添加劑的分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于電化學(xué)發(fā)光法檢測萊克多巴胺的方法。

背景技術(shù)：

萊克多巴胺(Ractopamine)是常見的一種瘦肉精添加藥物，添加于飼料中，可以增加動物的瘦肉量、減少飼料使用、使肉品提早上市、降低成本。但人們食用含“瘦肉精”豬肉過量后易引發(fā)心慌、肌肉震顫、頭痛以及臉部潮紅等癥狀，對心率失常、高血壓、青光眼、糖尿病、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)等疾病的患者有較大危害。2000年，F(xiàn)DA(美國食品與藥品監(jiān)督管理局)批準(zhǔn)萊克多巴胺在養(yǎng)豬業(yè)中使用，它是美國唯一允許添加的β腎上腺激動劑，美國、加拿大、澳大利亞等24個國家和地區(qū)均秉持這一做法。但是2002年，我國農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部、國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布公告《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》，其中規(guī)定：萊克多巴胺與鹽酸克侖特羅、沙丁胺醇、西巴特羅等β腎上腺受體激動劑一起被禁用。

嚴(yán)格控制肉類尤其是豬肉中萊克多巴胺的含量不超標(biāo)是保證消費(fèi)者健康的主要關(guān)卡。對于萊克多巴胺的檢測，目前應(yīng)用比較成熟的方法和技術(shù)，例如質(zhì)譜分析、色譜法、光譜和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，能夠達(dá)到高準(zhǔn)確度、靈敏度定量檢測，但是這些方法大都需要精細(xì)的操作，前期準(zhǔn)備工作較為繁瑣，操作繁瑣，不能滿足快速檢測的要求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于一種基于電化學(xué)發(fā)光法檢測萊克多巴胺的方法，通過構(gòu)建噴射式Ru(bpy)₃^2+/N丁基二乙醇胺(BDEA)電化學(xué)發(fā)光體系，能夠用淬滅法測定豬尿中萊克多巴胺殘留。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種基于電化學(xué)發(fā)光法檢測萊克多巴胺的方法，包括以下步驟：

1)將三聯(lián)吡啶釕和二羥乙基N-丁基二乙醇胺在溶液中進(jìn)行反應(yīng)，檢測所述反應(yīng)產(chǎn)物的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度，記為I₀；所述三聯(lián)吡啶釕溶液與二羥乙基N-丁基二乙醇胺摩爾比為1：1～100；

2)將待測樣品與三聯(lián)吡啶釕溶液和二羥乙基N-丁基二乙醇胺溶液進(jìn)行共反應(yīng)，檢測所述共反應(yīng)產(chǎn)物的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度，記為I_t；

3)根據(jù)預(yù)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線與電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度差值，得到待測樣品中萊克多巴胺的濃度；所述標(biāo)準(zhǔn)曲線為萊克多巴胺濃度與電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度差之間的線性曲線，所述電化學(xué)發(fā)光信號差值為ΔI＝I₀-I_t。

優(yōu)選的，所述步驟1)或步驟2)中所述三聯(lián)吡啶釕溶液或二羥乙基N-丁基二乙醇胺溶液的溶劑為磷酸緩沖液；所述磷酸緩沖液的pH值為7.5～9.0。

優(yōu)選的，所述步驟1)或步驟2)中二羥乙基N-丁基二乙醇胺以二羥乙基N-丁基二乙醇胺溶液形式存在；所述二羥乙基N-丁基二乙醇胺溶液的摩爾濃度為10^-7～10^-9mol/L。

優(yōu)選的，所述步驟2)中所述三聯(lián)吡啶釕溶液和二羥乙基N-丁基二乙醇胺溶液的摩爾比為1:1～100；所述待測樣品添加的體積為12～180μL。

優(yōu)選的，所述步驟2)中所述共反應(yīng)的溫度為23～27℃。

優(yōu)選的，所述步驟3)中電化學(xué)檢測用工作電極為1.25～1.45V。

優(yōu)選的，所述步驟3)中在檢測時采用噴射式電化學(xué)發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測產(chǎn)物；所述反應(yīng)產(chǎn)物的噴射速率為2～6mL/min。

優(yōu)選的，所述步驟4)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的為y＝-0.6836x+0.1816，相關(guān)系數(shù)r＝0.9989，x代表萊克多巴胺的質(zhì)量濃度，y代表電化學(xué)發(fā)光信號差值。

優(yōu)選的，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線在萊克多巴胺質(zhì)量濃度為10^-9～10^-5g/mL范圍內(nèi)具有線性關(guān)系。

本發(fā)明提供的一種基于電化學(xué)發(fā)光法檢測萊克多巴胺的方法，基于萊克多巴胺對Ru(bpy)3²⁺-N丁基二乙醇胺(BDEA)發(fā)光體系的強(qiáng)烈淬滅效應(yīng)，建立了一種能夠快速、靈敏地檢測豬尿中萊克多巴胺殘留的方法。本發(fā)明提供的方法方法具有較寬的定量檢測范圍，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與Ru(bpy)3²⁺濃度在10^-9～10^-5g/mL范圍內(nèi)呈良好的線性相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r＝0.9989)；具有較高的檢測靈敏度，對萊克多巴胺的最低檢測限為5×10^-10g/mL。

進(jìn)一步的，通過控制影響Ru(bpy)₃²⁺/N丁基二乙醇胺體系發(fā)光的主要參數(shù)，結(jié)合所構(gòu)建的噴射式電化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)，建立了一種能夠快速、靈敏地檢測豬尿中萊克多巴胺殘留的方法。

附圖說明

圖1為實施例1中萊克多巴胺(RAC)對Ru(bpy)₃²⁺/BDEA體系發(fā)光強(qiáng)度的湮滅效應(yīng)；

圖2為實施例2中Ru(bpy)₃²⁺/BDEA發(fā)光體系對不同濃度RAC的發(fā)光強(qiáng)度的響應(yīng)情況；

圖3為實施例2中Ru(bpy)₃²⁺/BDEA發(fā)光體系對不同濃度RAC的響應(yīng)曲線；

圖4為實施例1中Ru(bpy)₃²⁺/BDEA-RAC發(fā)光體系的穩(wěn)定性測試結(jié)果。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種基于電化學(xué)發(fā)光法檢測萊克多巴胺的方法，包括以下步驟：

1)將三聯(lián)吡啶釕和二羥乙基N-丁基二乙醇胺在溶液中進(jìn)行反應(yīng)，檢測所述反應(yīng)產(chǎn)物的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度I₀；所述三聯(lián)吡啶釕溶液與二羥乙基N-丁基二乙醇胺摩爾比為1：1～100；

2)將待測樣品與三聯(lián)吡啶釕溶液和二羥乙基N-丁基二乙醇胺溶液進(jìn)行共反應(yīng)，檢測所述共反應(yīng)產(chǎn)物的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度I_t；

3)根據(jù)預(yù)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線與電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度差值，得到待測樣品中萊克多巴胺的濃度；所述標(biāo)準(zhǔn)曲線為萊克多巴胺濃度與電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度差之間的線性曲線。

本發(fā)明將三聯(lián)吡啶釕和二羥乙基N-丁基二乙醇胺在溶液中進(jìn)行反應(yīng)，檢測所述反應(yīng)產(chǎn)物的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度，記為I₀；所述三聯(lián)吡啶釕溶液與二羥乙基N-丁基二乙醇胺摩爾比為1：1～100。

具體的，本發(fā)明優(yōu)選將三聯(lián)吡啶釕溶液與二羥乙基N-丁基二乙醇胺溶液混合，進(jìn)行反應(yīng)。所述三聯(lián)吡啶釕溶液的摩爾濃度優(yōu)選為10^-7mol/L，所述二羥乙基N-丁基二乙醇胺溶液的摩爾濃度為10^-7～10^-9mol/L，更優(yōu)選為10^-8mol/L。本發(fā)明中，所述三聯(lián)吡啶釕溶液或二羥乙基N-丁基二乙醇胺溶液的溶劑優(yōu)選為磷酸緩沖液；所述磷酸緩沖液的pH值優(yōu)選為7.5～9.0，更優(yōu)選為8.5。在本發(fā)明中，所述磷酸緩沖液的摩爾濃度優(yōu)選為0.08～0.12mol/L，更優(yōu)選為0.1mol/L。

本發(fā)明中，所述三聯(lián)吡啶釕與二羥乙基N-丁基二乙醇胺摩爾比優(yōu)選為1：1～10。所述三聯(lián)吡啶釕溶液與二羥乙基N-丁基二乙醇胺的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的三聯(lián)吡啶釕與二羥乙基N-丁基二乙醇胺即可。

三聯(lián)吡啶釕與二羥乙基N-丁基二乙醇胺反應(yīng)后，本發(fā)明對得到的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測，得到初始電化學(xué)發(fā)光信號，即為I₀。

本發(fā)明將待測樣品與三聯(lián)吡啶釕和二羥乙基N-丁基二乙醇胺在溶液體系中進(jìn)行共反應(yīng)，檢測所述共反應(yīng)產(chǎn)物的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度，記為It。

本發(fā)明中，將待測樣品與三聯(lián)吡啶釕溶液和二羥乙基N-丁基二乙醇胺溶液混合進(jìn)行共反應(yīng)。

本發(fā)明中，所述待測樣品沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的含有萊克多巴胺的樣品即可，例如豬尿。

本發(fā)明中，所述豬尿優(yōu)選進(jìn)行前處理。所述前處理的方法具有為樣品經(jīng)轉(zhuǎn)速為5000～6000rpm條件下進(jìn)行離心3～7min，取上清液。

本發(fā)明中，所述三聯(lián)吡啶釕和二羥乙基N-丁基二乙醇胺的摩爾比與上步的三聯(lián)吡啶釕和二羥乙基N-丁基二乙醇胺的摩爾比相同。

本發(fā)明中，所述待測樣品添加的體積優(yōu)選為120～180μL。

本發(fā)明中，所述共反應(yīng)的溫度優(yōu)選為23～27℃，更優(yōu)選為25℃。

得到共反應(yīng)產(chǎn)物后，本發(fā)明對所述共反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測，得到淬滅電化學(xué)發(fā)光信號，記為It。本發(fā)明中，電化學(xué)檢測優(yōu)選采用噴射式電化學(xué)發(fā)光流動檢測系統(tǒng)完成。本發(fā)明中，所述反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)入檢測時噴射速率為2～6mL/min，更優(yōu)選為4mL/min。

本發(fā)明中，所述電化學(xué)檢測檢測系統(tǒng)的工作電極優(yōu)選為1.25～1.45V，更優(yōu)選1.35～1.40V。

得到初始電化學(xué)發(fā)光信號和淬滅電化學(xué)發(fā)光信號后，本發(fā)明根據(jù)預(yù)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線與電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度差值，得到待測樣品中萊克多巴胺的濃度；所述標(biāo)準(zhǔn)曲線為萊克多巴胺濃度與電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度差之間的線性曲線。

在本發(fā)明中，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法與待測樣品的檢測方法的不同之處是用萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液代替待測樣品溶液。

本發(fā)明中，所述萊克多巴胺的標(biāo)準(zhǔn)品來源購自Sigma公司。

本發(fā)明中，所述萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度分別為10^-5g/mL，10^-6g/mL，10^-7g/mL，10^-8g/mL，10^-9g/mL；所述萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備方法是將萊克多巴胺粉末溶解于水中，制成1g/mL的溶液，依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別得到10^-5g/mL，10^-6g/mL，10^-7g/mL，10^-8g/mL，10^-9g/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

本發(fā)明中，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝-0.6836x+0.1816，相關(guān)系數(shù)r＝0.9989，x代表萊克多巴胺的質(zhì)量濃度，y代表電化學(xué)發(fā)光信號差值。

本發(fā)明中，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線在萊克多巴胺質(zhì)量濃度優(yōu)選為10^-9～10^-5g/mL范圍內(nèi)具有線性關(guān)系。

本發(fā)明中，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，同待測樣品的檢測方法，將標(biāo)準(zhǔn)品萊克多巴胺進(jìn)行梯度稀釋，用不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品代替待檢樣品進(jìn)行檢測，得到的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度差值與梯度濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種基于電化學(xué)發(fā)光法檢測萊克多巴胺的方法進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實施例1

將三聯(lián)吡啶釕和二羥乙基N-丁基二乙醇胺在溶液中進(jìn)行反應(yīng)，檢測所述反應(yīng)產(chǎn)物的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度I₀；所述三聯(lián)吡啶釕溶液的摩爾濃度為10^-7mol/L，二羥乙基N-丁基二乙醇胺摩爾濃度為10^-5mol/L，調(diào)整三聯(lián)吡啶釕溶液和二羥乙基N-丁基二乙醇胺的pH值為7.5；

將萊克多巴胺溶液與摩爾濃度為10^-7mol/L的三聯(lián)吡啶釕溶液和摩爾濃度為10^-5mol/L二羥乙基N-丁基二乙醇胺溶液進(jìn)行共反應(yīng)，進(jìn)入噴射式電化學(xué)發(fā)光流動檢測系統(tǒng)檢測，獲得電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度I_t；進(jìn)樣流速設(shè)置為3mL/min；進(jìn)樣量為150μL，設(shè)置工作電極為1.35V；

結(jié)果如圖1所示，圖1為萊克多巴胺(RAC)對Ru(bpy)₃²⁺/BDEA體系發(fā)光強(qiáng)度的湮滅效應(yīng)。從附圖1中可以看出，在達(dá)到峰a時，萊克多巴胺濃度為0g/mL；達(dá)到峰b時，萊克多巴胺濃度為1.0×10^-7g/mL；在達(dá)到峰c時，萊克多巴胺的濃度為1.0×10^-6g/mL；達(dá)到峰d時，萊克多巴胺的濃度為1.0×10^-5g/mL?？梢钥闯觯S著萊克多巴胺的濃度逐漸升高，代表發(fā)光信號強(qiáng)度的峰值逐漸下降，說明萊克多巴胺對Ru(bpy)₃²⁺/BDEA體系發(fā)光強(qiáng)度有湮滅效應(yīng)，并且隨著萊克多巴胺的濃度增強(qiáng)，湮滅效應(yīng)越明顯。

實施例2

將三聯(lián)吡啶釕和二羥乙基N-丁基二乙醇胺在溶液中進(jìn)行反應(yīng)，檢測所述反應(yīng)產(chǎn)物的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度I₀；所述三聯(lián)吡啶釕溶液的摩爾濃度為10^-7mol/L，二羥乙基N-丁基二乙醇胺摩爾濃度為10^-8mol/L，調(diào)整三聯(lián)吡啶釕溶液和二羥乙基N-丁基二乙醇胺的pH值為8.5；

將萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品溶解于水制成1g/mL的溶液，分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別得到10^-5g/mL，10^-6g/mL，10^-7g/mL，10^-8g/mL，10^-9g/mL的萊克多巴胺溶液；

分別將上述梯度的萊克多巴胺溶液與摩爾濃度為10^-7mol/L的三聯(lián)吡啶釕溶液和摩爾濃度為10^-8mol/L二羥乙基N-丁基二乙醇胺溶液進(jìn)行共反應(yīng)，進(jìn)入噴射式電化學(xué)發(fā)光流動檢測系統(tǒng)檢測，獲得電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度It；進(jìn)樣流速設(shè)置為4mL/min；進(jìn)樣量為150μL，設(shè)置工作電極為1.45V；

結(jié)果如圖2所示，圖2為Ru(bpy)₃²⁺/BDEA發(fā)光體系對不同濃度RAC的發(fā)光強(qiáng)度的響應(yīng)情況；從附圖2中可以看出，隨著時間延長，Ru(bpy)3²⁺/BDEA發(fā)光體系光強(qiáng)度逐漸減弱；

根據(jù)圖2得到的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度差值，與萊克多巴胺濃度進(jìn)行線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式為y＝-0.6836x+0.1816，相關(guān)系數(shù)r＝0.9989，在萊克多巴胺濃度為10^-5～10^-9g/mL范圍內(nèi)，具有較高的線性關(guān)系。

實施例3

將三聯(lián)吡啶釕和二羥乙基N-丁基二乙醇胺在溶液中進(jìn)行反應(yīng)，檢測所述反應(yīng)產(chǎn)物的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度I₀；所述三聯(lián)吡啶釕溶液的摩爾濃度為10^-7mol/L，二羥乙基N-丁基二乙醇胺摩爾濃度為10^-8mol/L，調(diào)整三聯(lián)吡啶釕溶液和二羥乙基N-丁基二乙醇胺的pH值為8.5；

將10^-8g/mL的萊克多巴胺溶液與摩爾濃度為10^-7mol/L的三聯(lián)吡啶釕溶液和摩爾濃度為10^-8mol/L二羥乙基N-丁基二乙醇胺溶液進(jìn)行共反應(yīng)，進(jìn)入噴射式電化學(xué)發(fā)光流動檢測系統(tǒng)檢測，獲得電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度I_t；進(jìn)樣流速設(shè)置為4mL/min；進(jìn)樣量為150μL，設(shè)置工作電極為1.45V；經(jīng)過連續(xù)11次測定，得到Ru(bpy)32+/BDEA-RAC發(fā)光體系的重復(fù)性，如圖4所示，所得相對標(biāo)準(zhǔn)差為1.23％(n＝11)，表明該檢測體系具有良好的重復(fù)性。

實施例4

將三聯(lián)吡啶釕和二羥乙基N-丁基二乙醇胺在溶液中進(jìn)行反應(yīng)，檢測所述反應(yīng)產(chǎn)物的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度I₀；所述三聯(lián)吡啶釕溶液的摩爾濃度為10^-7mol/L，二羥乙基N-丁基二乙醇胺摩爾濃度為10^-8mol/L，調(diào)整三聯(lián)吡啶釕溶液和二羥乙基N-丁基二乙醇胺的pH值為8.5；

將萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品溶解于處理的豬尿樣中(處理方法：豬尿樣品經(jīng)5000rpm離心5min，取上清)，并用經(jīng)離心的豬尿樣進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到5×10^-10g/mL，的萊克多巴胺豬尿樣溶液；將5×10^-10g/mL的萊克多巴胺豬尿樣溶液與摩爾濃度為10^-7mol/L的三聯(lián)吡啶釕溶液和摩爾濃度為10^-8mol/L二羥乙基N-丁基二乙醇胺溶液進(jìn)行共反應(yīng)，進(jìn)入噴射式電化學(xué)發(fā)光流動檢測系統(tǒng)檢測，獲得電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度It；進(jìn)樣流速設(shè)置為4mL/min；進(jìn)樣量為150μL，設(shè)置工作電極為1.35V；

得到電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度差值，定義信噪比＞4:1時RAC的最低檢測限為5×10^-10g/mL，檢測結(jié)果為陽性；信噪比＜4:1時，檢測結(jié)果為陰性。

由以上實施例可知，本發(fā)明提供的一種基于電化學(xué)發(fā)光法檢測萊克多巴胺的方法，首先萊克多巴胺對Ru(bpy)₃²⁺/BDEA體系發(fā)光強(qiáng)度有湮滅效應(yīng)，并且隨著萊克多巴胺的濃度增強(qiáng)，湮滅效應(yīng)越明顯。通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)萊克多巴胺在質(zhì)量濃度為10^-5～10^-9g/mL范圍內(nèi)，具有較高的線性關(guān)系。同時通過重復(fù)試驗表明該檢測體系具有良好的穩(wěn)定性。經(jīng)過檢測RAC的最低檢測限為5×10^-10g/mL。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。