本發(fā)明屬于超分辨領(lǐng)域，尤其涉及一種利用非線性熒光飽和原理在遠(yuǎn)場實(shí)現(xiàn)超衍射極限的分辨率的超分辨顯微方法和裝置。

背景技術(shù)：

由于具有無損傷、非接觸等優(yōu)點(diǎn)，光學(xué)顯微鏡是一種被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物、材料科學(xué)中的觀測工具。但是傳統(tǒng)的遠(yuǎn)場光學(xué)顯微鏡的分辨率受到衍射極限的限制，光束經(jīng)顯微物鏡聚焦后所成光斑的尺寸用半高全寬表示為其中λ為顯微鏡的工作波長，NA為所用顯微物鏡的數(shù)值孔徑。

為了能夠觀察到更加精細(xì)的結(jié)構(gòu)，在遠(yuǎn)場熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上，科研工作者們已經(jīng)提出了很多種實(shí)用的超分辨顯微成像方法。所有連續(xù)光照明模式的超分辨方法都可以被分為兩大類：結(jié)構(gòu)光照明，以SIM為代表；點(diǎn)掃描光照明，以STED為代表。但是這些方法都有各自的缺點(diǎn)，如點(diǎn)掃描光照明模式下需要很高的光功率，而結(jié)構(gòu)光照明模式需要多次記錄，且這些方法的系統(tǒng)都很復(fù)雜。

在線性的熒光激發(fā)過程中，樣品發(fā)射的熒光強(qiáng)度是與激發(fā)光強(qiáng)度成正比的；而當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)不斷增加，激發(fā)態(tài)的熒光分子數(shù)目就會(huì)達(dá)到飽和，正比關(guān)系不再成立且熒光的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)也會(huì)改變，可以用于得到更精細(xì)的結(jié)構(gòu)信息。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種超分辨顯微成像方法和裝置，可以利用非線性光斑調(diào)制和熒光飽和原理在遠(yuǎn)場實(shí)現(xiàn)超衍射極限的分辨率。該種方法和裝置具有成像速度快、裝置簡單、分辨率高等特點(diǎn)，可以很好地應(yīng)用于熒光樣品的檢測之中。

一種基于非線性光斑調(diào)制的超分辨顯微成像方法，包括以下步驟：

1)將激光器發(fā)出的激光光束進(jìn)行準(zhǔn)直；

2)對光束進(jìn)行調(diào)制形成非均勻光斑照明，并增大光強(qiáng)直至飽和產(chǎn)生非線性熒光輻射；

3)將調(diào)制后的光束通過二維掃描振鏡系統(tǒng)和顯微物鏡聚焦到樣品表面，實(shí)現(xiàn)對樣品的二維掃描；

4)在二維掃描過程中收集所述待測樣品各掃描點(diǎn)發(fā)出的信號(hào)光；

5)通過系統(tǒng)的光學(xué)傳遞函數(shù)和反卷積算法，根據(jù)所得到的樣品信號(hào)圖像反向計(jì)算出樣品的分布，系統(tǒng)的光學(xué)傳遞函數(shù)為點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的傅里葉變換，點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)為：

其中，為系統(tǒng)出瞳上點(diǎn)的球坐標(biāo)，i為虛數(shù)單位，為離焦面很近的點(diǎn)的柱坐標(biāo)，C是歸一化常數(shù)，Ω為出瞳，表示激發(fā)光光強(qiáng)，[p_x；p_y；p_z]是代表激發(fā)光偏振方向的單位向量，是位相板造成的相位延遲，k和n分別為自由空間中的波矢與折射率，為坐標(biāo)轉(zhuǎn)換系數(shù)。

待測樣品上的x，y軸方向由二維掃描方向決定。

本發(fā)明中，用反卷積算法恢復(fù)樣品信息得到超分辨圖像，反卷積算法可以是迭代盲反卷積算法、Lucy-Richardson反卷積算法、最大似然估計(jì)反卷積算法等常用算法。

本發(fā)明還提供了一種基于非線性光斑調(diào)制的超分辨顯微成像裝置，包括光源、承載待測樣品的樣品臺(tái)，所述光源與樣品臺(tái)之間依次設(shè)有：

用于將光源發(fā)出的光束改變?yōu)榫€偏振光的起偏器；

用于使線偏振光源變?yōu)閳A偏振光的1/4波片；

用于改變所述光源發(fā)出光束各部分相位形成空心光斑的渦旋位相板；

用于反射激發(fā)光、透射熒光信號(hào)的二色鏡；

用于對光線進(jìn)行光路偏轉(zhuǎn)的二維掃描振鏡系統(tǒng)；

依次布置的分別用于對所述掃描振鏡系統(tǒng)出射的光束進(jìn)行聚焦和準(zhǔn)直的掃描透鏡和場鏡；

用于將激發(fā)光聚焦到樣品表面上的顯微物鏡；

并設(shè)有用于控制所述掃描振鏡系統(tǒng)的控制器及收集所述待測樣品發(fā)出的信號(hào)光的探測系統(tǒng)。

本發(fā)明中通過探測系統(tǒng)接收樣品發(fā)出的信號(hào)光，該探測系統(tǒng)包括：

布置在渦旋位相板和掃描振鏡系統(tǒng)之間的二色鏡；

用于將信號(hào)光束聚焦到探測器上的聚焦透鏡；

用于對信號(hào)光進(jìn)行空間濾波的空間濾波器，位于所述顯微物鏡的焦平面附近，所述空間濾波器可以采用針孔或多模光纖，若采用針孔，所用針孔的直徑應(yīng)小于一個(gè)艾里斑直徑；

用于探測信號(hào)光的光強(qiáng)信號(hào)的點(diǎn)光源探測器雪崩二極管APD。

作為優(yōu)選，所述光源與起偏器之間依次設(shè)有用于對所述激光光束進(jìn)行濾波的單模光纖和準(zhǔn)直的準(zhǔn)直透鏡。

本發(fā)明中所述渦旋位相板具有調(diào)制函數(shù)其中，ρ為光束上某點(diǎn)與光軸的距離，為光束垂直光軸剖面內(nèi)位置極坐標(biāo)矢量與x軸的夾角。

所述顯微物鏡的數(shù)值孔徑NA＝1.4。

本發(fā)明原理如下：

顯微系統(tǒng)的分辨率受光學(xué)系統(tǒng)衍射的影響，可在空間域上和頻率域上進(jìn)行說明。在空間域上，平行入射的照明光束經(jīng)顯微物鏡聚焦后在待測樣品上所成的光斑是一個(gè)具有一定尺寸的衍射斑，在衍射斑照射范圍內(nèi)的樣品均會(huì)發(fā)出相應(yīng)的信號(hào)光，從而使得這一范圍內(nèi)樣品的細(xì)節(jié)無法被分辨，由此限制了顯微系統(tǒng)的分辨率。在頻率域上，由于整個(gè)系統(tǒng)的孔徑是有限的，因此在頻率上相當(dāng)于一個(gè)低通濾波器，承載樣品細(xì)節(jié)信息的高頻信號(hào)不能通過，由此限制了顯微系統(tǒng)的分辨率。因此，要突破光學(xué)衍射極限的限制，提高顯微系統(tǒng)的分辨率，如何使更多的高頻信號(hào)通過系統(tǒng)被探測器接收便成為了關(guān)鍵。

在本發(fā)明方法中，通過對照明光斑的調(diào)制得到非均勻點(diǎn)照明，同時(shí)調(diào)整光源輸出功率以增加光強(qiáng)非線性熒光飽和效應(yīng)，非均勻的照明光斑和非線性熒光飽和效應(yīng)共同作用使得更多樣品的高頻信息能夠被探測到。在本發(fā)明裝置中，渦旋位相板的相位調(diào)制函數(shù)為由德拜積分計(jì)算可得，調(diào)制后光束經(jīng)顯微物鏡聚焦后在樣品上所成光斑為一個(gè)面包圈型的空心光斑。增加光強(qiáng)使空心光斑飽和，照射在樣品上激發(fā)出飽和非線性的熒光，飽和光產(chǎn)生的高階非線性效應(yīng)使得激發(fā)出的熒光中的高頻成分更多。再加上空心光斑非均勻性產(chǎn)生的移頻作用，這些高頻成分被移到系統(tǒng)的截止頻率內(nèi)，能夠通過系統(tǒng)并被探測到，這是實(shí)心光斑照明不能做到的。信號(hào)中各頻率成分的相對強(qiáng)度分布由系統(tǒng)的光學(xué)傳遞函數(shù)來表示。但照明光斑是空心光斑，探測得到的圖像中的高頻信息是非可視化的，低頻信息強(qiáng)度也很強(qiáng)，不能直接反應(yīng)樣品的原始分布。此時(shí)需要通過反卷積算法，根據(jù)線性成像過程和探測到的圖像，增強(qiáng)高頻信息的強(qiáng)度同時(shí)反向推導(dǎo)出樣品的圖像。

因此，與常規(guī)光學(xué)顯微方法相比，本發(fā)明使更多高頻樣品信號(hào)通過系統(tǒng)被探測到，結(jié)合反卷積算法，從而可以實(shí)現(xiàn)超衍射極限的分辨率，得到高分辨率的圖像。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

(1)首次提出了通過非線性光斑調(diào)制增加高頻信息的顯微方法；

(2)提出了探測到的混亂含高頻信息的圖像可以通過反卷積算法推導(dǎo)出樣品的原始分布；

(3)裝置簡單，操作方便。

附圖說明

圖1為本實(shí)施例的超分辨顯微裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本實(shí)施例中普通實(shí)心光斑、飽和實(shí)心光斑、普通空心光斑、飽和空心光斑激發(fā)熒光信號(hào)的頻譜歸一化分布曲線；

圖3為本實(shí)施例中普通實(shí)心光斑、飽和實(shí)心光斑、普通空心光斑、飽和空心光斑激發(fā)熒光信號(hào)經(jīng)過濾波后被探測器接收到的信號(hào)頻譜歸一化分布曲線，即各情況下系統(tǒng)的光學(xué)傳遞函數(shù)。

圖4為本實(shí)施例中樣品為熒光生物樣品時(shí)飽和空心光斑激發(fā)后反卷積得到的圖像與相同條件下共聚焦顯微鏡得到的圖像的對比。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于此。

如圖1所示，本實(shí)施例的超分辨顯微裝置，包括：激光器1，單模光纖2，準(zhǔn)直透鏡3，起偏器4，1/4波片5，渦旋位相板6，二色鏡7，掃描振鏡8，掃描透鏡9，場鏡10，顯微物鏡11，樣品臺(tái)12，聚焦透鏡13，針孔14，探測器雪崩二極管APD15。

其中，單模光纖2、準(zhǔn)直透鏡3、起偏器4，1/4波片5，渦旋位相板6，二色鏡7依次位于激光器1出射光束的光軸之上。

其中，掃描振鏡8位于經(jīng)二色鏡7反射后光束的光軸之上。

其中，掃描透鏡9，場鏡10，顯微物鏡11，樣品臺(tái)12依次位于掃描振鏡8出射光束的光軸之上。

其中，聚焦透鏡13、針孔14、探測器雪崩二極管APD15依次位于經(jīng)二色鏡7后透射光束的光軸之上；所述針孔14位于聚焦透鏡13的焦平面處。

其中，控制器與掃描振鏡8相連，用于掃描振鏡系統(tǒng)的掃描。

上述裝置中，顯微物鏡11的數(shù)值孔徑NA＝1.4；所用針孔14的直徑為0.6個(gè)艾里斑直徑。

采用圖1所示的裝置進(jìn)行超分辨顯微的方法如下：

從激光器1發(fā)出的激光光束，首先被導(dǎo)入單模光纖2，從單模光纖2出射的激光光束，經(jīng)過準(zhǔn)直透鏡3完成準(zhǔn)直。經(jīng)過準(zhǔn)直后的光束入射到起偏器4變?yōu)榫€偏振光，經(jīng)過1/4波片5變?yōu)閳A偏振光，再通過渦旋位相板6變?yōu)榭招墓獍摺?/p>

渦旋位相板6的相位調(diào)制函數(shù)為：其中，ρ為光束上某點(diǎn)與光軸的距離，為光束垂直光軸剖面內(nèi)位置極坐標(biāo)矢量與x軸的夾角。

因此，經(jīng)渦旋位相板6進(jìn)行相位調(diào)制之后，出射光束的電矢量強(qiáng)度可由下式表示：

其中，為入射到渦旋位相板6上的光束在處的電矢量強(qiáng)度，為經(jīng)過渦旋位相板6相位調(diào)制后的出射光束在處的電矢量強(qiáng)度，i為虛數(shù)單位。

調(diào)制后的光經(jīng)二色鏡7反射后入射到掃描振鏡8上，經(jīng)掃描振鏡8出射的光束依次被掃描透鏡9聚焦、場鏡10準(zhǔn)直，之后經(jīng)顯微物鏡11投射到位于樣品臺(tái)12上的待測樣品之上。

入射光在顯微物鏡11的焦點(diǎn)附近所成的光場分布可由德拜積分確定，具體如下：

式中，是以顯微物鏡11的焦點(diǎn)位置為原點(diǎn)的柱坐標(biāo)系下的坐標(biāo)，代表了處的電矢量強(qiáng)度，i為虛數(shù)單位，C為歸一化常數(shù)，θ為光束孔徑角，φ為光束垂直Z軸剖面內(nèi)位置極坐標(biāo)矢量與x軸的夾角，A₁(θ,φ)是入射光的振幅分布，A₂(θ,φ)表征了顯微物鏡15的結(jié)構(gòu)，[p_x；p_y；p_z]則表示了入射光的偏振信息，k＝2π/λ，n為介質(zhì)折射率。

由上式計(jì)算可以發(fā)現(xiàn)，此時(shí)入射光經(jīng)顯微物鏡11聚焦之后在待測樣品上所成光斑為一個(gè)面包圈型空心光斑。

待測樣品被激發(fā)出的信號(hào)光被顯微物鏡11收集，之后依次通過場鏡10、掃描透鏡9、掃描振鏡8，通過二色鏡透射7。之后信號(hào)光經(jīng)聚焦透鏡13聚焦并通過針孔14進(jìn)行空間濾波，最終被探測器15接收。

通過控制器調(diào)節(jié)掃描振鏡8，實(shí)現(xiàn)對于待測樣品的二維掃描。

普通實(shí)心光斑、飽和實(shí)心光斑、普通空心光斑與飽和空心光斑激發(fā)出的熒光信號(hào)頻譜分布如圖2所示，插入圖為局部放大圖，kc為普通實(shí)心光斑照明時(shí)系統(tǒng)的截止頻率。當(dāng)光強(qiáng)增大到飽和后非線性熒光效應(yīng)產(chǎn)生后，實(shí)心光斑能夠激發(fā)出超過截止頻率的高頻信號(hào)。相比于實(shí)心光斑，飽和空心光斑中高頻信號(hào)成分的相對強(qiáng)度增強(qiáng)了更多，但相對強(qiáng)度降低了。

而激發(fā)出的熒光信號(hào)只有能被探測器接收的部分才是有效信號(hào)，普通實(shí)心光斑、飽和實(shí)心光斑、普通空心光斑、飽和空心光斑激發(fā)熒光信號(hào)經(jīng)過濾波后被探測器接收到的信號(hào)頻譜歸一化分布曲線，即系統(tǒng)的光學(xué)傳遞函數(shù)如圖3所示。圖2中由實(shí)心光斑飽和效應(yīng)激發(fā)的高頻率旁瓣在圖3中被針孔濾除，而由空心光斑飽和效應(yīng)激發(fā)的高頻率旁瓣不會(huì)被針孔濾除，能夠被探測器接受到。顯然該方法使探測器能夠接收到的高頻信息增加了，再通過反卷積算法提高高頻信號(hào)的相對強(qiáng)度恢復(fù)圖像，由此可以得到超衍射極限的超分辨顯微圖像。

圖4為相同實(shí)驗(yàn)條件下用飽和空心光斑加反卷積和用共聚焦方法對熒光生物樣品成像得到的對比圖像。圖a中樣品為Vero PFA，圖b中樣品為VeroMeOH，兩圖中圖片的上半部分是光強(qiáng)為1.2μW時(shí)共聚焦方法得到的圖像，下半部分是光強(qiáng)為30μW時(shí)本方法得到的圖像。通過對比可以看出在共聚焦方法下模糊的顆粒狀和線狀的細(xì)節(jié)在本方法中變清晰了，證明本方法對分辨率有明顯的提高。