本發(fā)明屬于電化學(xué)檢測領(lǐng)域，特指一種用于玉米中伏馬毒素B1靈敏檢測的免標(biāo)記電化學(xué)適配體傳感器的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

伏馬毒素(Fumonisin B，F(xiàn)B)是由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的一組重要的霉菌毒素，是一類由不同的多氫醇和丙三羧酸組成的結(jié)構(gòu)類似的雙酯化合物。伏馬毒素主要存在于谷物中，以玉米及以玉米為主的食品和飼料中居多。由于伏馬毒素的毒性具有種屬特異性和靶器官特異性，F(xiàn)B的攝入不僅會對人類和動物健康造成潛在的威脅而且會對其大腦，肝臟，肺以及腎臟造成不同程度的損害?，F(xiàn)有資料表明，F(xiàn)B可引起馬腦質(zhì)軟化癥、豬肺水腫和大鼠原發(fā)性肝癌，而且對家禽造成免疫抑制作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)FB可能誘發(fā)人類食道癌，肝癌，胃癌等疾病。鑒于以上原因，美國食品和藥物管理局公布的指導(dǎo)草案規(guī)定玉米產(chǎn)品中伏馬毒素(FB1，F(xiàn)B2，F(xiàn)B3)的標(biāo)準(zhǔn)含量應(yīng)低于2mg kg^-1。FB1是污染玉米及玉米制品的主要毒素，已成為繼黃曲霉毒素之后的又一個研究熱點，國際癌癥研究機構(gòu)將FB1定義為2B類致癌物。

FB1具有耐高溫性，在多數(shù)糧食加工處理過程中均比較穩(wěn)定，鑒于它的劇毒性和廣泛的存在性，建立一種高效快速檢測FB1的方法尤為重要?，F(xiàn)已有的檢測FB1的方法包括薄層色譜法，高效液相色譜法，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法以及免疫測定等研究方法，雖然這些方法能夠滿足靈敏度與特異性檢測的要求，但是在實際應(yīng)用方面存在一定的局限性。色譜法能夠用于定性、定量檢測，且檢測結(jié)果相對準(zhǔn)確、可靠，靈敏度高，重現(xiàn)性好，但是所用儀器設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，需要專業(yè)的技術(shù)人員，因而不適合大批量樣品的處理和分析以及現(xiàn)場的快速檢測。酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)可用于現(xiàn)場快速檢測，基于抗原與抗體反應(yīng)后物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生的變化，實現(xiàn)對抗原與抗體形成的免疫復(fù)合物進行測定分析。該方法以抗體作為識別元素，但抗體制備需經(jīng)過動物實驗或者細(xì)胞實驗，繁瑣耗時，制備成本高，且所得抗體易受到外界環(huán)境干擾，不易存儲等，這些不足限制了該方法的推廣應(yīng)用。核酸適配體(aptamer)是通過指數(shù)富集配體進化技術(shù)篩選出來的一段寡核苷酸序列，它可以折疊成三維結(jié)構(gòu)并通過空間構(gòu)型互補與靶分子高親和性、高特異性結(jié)合。作為可替代抗體的一種新型識別元件，核酸適配體合成簡單，易于儲存和運輸，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，方便再生。除此之外，核酸適配體可被巰基，氨基，熒光團，生物素和酶等功能化，使得傳感平臺的構(gòu)建更加靈活。

本發(fā)明以金納米粒子(AuNPs)修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極(SPCE)為載體，以核酸適配體為識別元件用于玉米中FB1的電化學(xué)阻抗法檢測，構(gòu)建了一種快速、靈敏檢測FB1的電化學(xué)適配體傳感器，建立了FB1標(biāo)準(zhǔn)品濃度與電化學(xué)阻抗值之間的對應(yīng)關(guān)系，實現(xiàn)了簡單、靈敏、快速檢測FB1的目的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種免標(biāo)記、高靈敏度、高選擇性、寬測量范圍等優(yōu)點為一體的電化學(xué)適配體傳感器。該傳感器制備工藝簡單，成本低，實現(xiàn)了快速定量檢測FB1的目的。

所采用的方案概括為：以氯金酸為起始原料，以SPCE為載體，利用電化學(xué)沉積法實現(xiàn)金納米粒子在工作電極表面的沉積，創(chuàng)建超靈敏的電化學(xué)傳感平臺。首先，利用電極表面沉積的金納米粒子優(yōu)良的導(dǎo)電性能和較大的比表面積等性質(zhì)，對檢測系統(tǒng)起到一個信號放大的作用。然后在金納米粒子修飾的電極表面偶聯(lián)巰基修飾的FB1適配體(基于Au-S的共價鍵合)。當(dāng)加入目標(biāo)物FB1標(biāo)準(zhǔn)品，aptamer與FB1特異性結(jié)合，對其進行阻抗掃描，建立阻抗值與FB1濃度之間的關(guān)系，以達(dá)到對含F(xiàn)B1的實際樣品進行定量檢測的目的。

本發(fā)明是通過如下具體技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種檢測伏馬毒素B1的電化學(xué)適配體傳感器的制備方法，包括如下步驟：

步驟1、絲網(wǎng)印刷碳電極SPCE的預(yù)處理；

步驟2、活化的FB1核酸適配體溶液的制備：用50mM Tris-HCl緩沖溶液溶解FB1核酸適配體，使FB1核酸適配體的濃度為100μM，得到溶液A；取20μL溶液A加入到5μL含有三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽的50mM Tris-HCl緩沖溶液B中，得到混合液C；然后，將混合液C放置在往復(fù)式震蕩儀上室溫條件下反應(yīng)1h；最后，離心移去多余的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽，重新分散在2mL 50mM Tris-HCl緩沖溶液D中，得到活化的FB1核酸適配體溶液，備用；

步驟3、金納米粒子修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極的制備：將步驟1中預(yù)處理過的SPCE浸入5mL 2mM HAuCl₄溶液進行金納米粒子的表面電沉積，得到金納米粒子修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極，記為AuNPs-SPCE，二次蒸餾水淋洗，氮氣吹干，備用；

步驟4、FB1核酸適配體修飾的AuNPs-SPCE電極的制備：首先取10μL的步驟2中活化的FB1核酸適配體溶液滴涂在步驟1中預(yù)處理的工作電極表面，4℃條件下反應(yīng)6h，得到FB1核酸適配體修飾的AuNPs-SPCE電極，記為aptamer-AuNPs-SPCE，用50mM Tris-HCl緩沖溶液淋洗，氮氣吹干；

步驟5、電極表面多余活性位點的封閉：將步驟4中aptamer-AuNPs-SPCE表面滴涂10μL1mM 6-巰基己醇的溶液，室溫條件下反應(yīng)1h，得到6-巰基己醇封閉的電極，之后用50mM Tris-HCl緩沖液淋洗，氮氣吹干，得到可用于伏馬毒素B1檢測的免標(biāo)記電化學(xué)適配體傳感器，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟1中，SPCE預(yù)處理方法為：在5mL含有0.5M H₂SO₄和0.1M KCl的溶液中對SPCE進行循環(huán)伏安掃描，掃描范圍設(shè)定為-0.2～1.5V，掃描速率為100mV s^-1，直到掃描得到重疊的循環(huán)伏安曲線，用二次水淋洗，氮氣吹干，備用。

步驟2中，所使用的Tris-HCl緩沖溶液B中含有的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽的濃度為100mM；所使用的Tris-HCl緩沖溶液D中含有0.1M NaCl，0.2M KCl，5.0mM MgCl₂和1.0mM EDTA。

步驟3中，所述電沉積的電壓為0.5V，沉積時間為1200s。

步驟2、4、5中，所使用的Tris-HCl緩沖溶液pH均為7.4。

所用的FB1核酸適配體序列為：5’-SH-(CH₂)₆-ATA CCA GCT TAT TCA ATT AAT CGC ATT ACC TTA TAC CAG CTT ATT CAA TTA CGT CTG CAC ATA CCA GCT TAT TCA ATT AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3’。

所述檢測伏馬毒素B1的電化學(xué)適配體傳感器檢測伏馬毒素B1的步驟如下：

分別取10μL不同濃度的FB1標(biāo)準(zhǔn)溶液滴涂在所述檢測伏馬毒素B1的電化學(xué)適配體傳感器的界面上，得到修飾電極；在37℃條件下孵化30min，之后將修飾電極電極用50mM pH＝7.4的Tris-HCl緩沖液淋洗，氮氣吹干；將修飾電極置于5mL阻抗液中，掃描電化學(xué)阻抗圖譜，根據(jù)阻抗值與對應(yīng)的FB1標(biāo)準(zhǔn)樣濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

所述FB1標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度依次是0，0.005，0.01，0.05，0.25，1，2，5，10，50，100ng mL^-1；所述阻抗液包括：a.0.1M磷酸鹽緩沖溶液，pH＝7.4；b.5mM[Fe(CN)₆]^3-/4-；c.0.1M KCl。

有益效果：

本發(fā)明利用電化學(xué)沉積法以及自組裝法構(gòu)建了aptamer-AuNPs-SPCE免標(biāo)記電化學(xué)適配體傳感平臺，運用核酸適配體對目標(biāo)物的特異性識別作用，實現(xiàn)了FB1的靈敏檢測，其特色和優(yōu)點表述如下：

(1)本發(fā)明采用一次性的SPCE作為基體來構(gòu)建傳感器，避免了電極表面繁瑣的預(yù)處理程序；SPCE表面的多孔結(jié)構(gòu)也為金納米粒子提供了更多的負(fù)載空間。

(2)本發(fā)明采用金納米粒子對電極表面進行修飾，一方面，大量的金納米粒子負(fù)載在電極表面為免標(biāo)記阻抗法檢測起到信號放大的作用；另一方面，利用Au-S鍵固定更多的巰基化的適配體在電極表面，使得檢測方法具有更高的靈敏度。

(3)本發(fā)明利用核酸適配體作為信號指示劑，通過適配體與目標(biāo)分子的特異性識別來檢測FB1。

(4)本發(fā)明所提出的信號放大方法和檢測模式實現(xiàn)了對FB1的超靈敏檢測，在10pg mL^-1～50ng mL^-1的濃度區(qū)間內(nèi)，F(xiàn)B1濃度的對數(shù)值(lgc_FB1)與R_et的增加值(△R_et)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限可達(dá)3.4pg mL^-1。

(5)與傳統(tǒng)檢測方法相比，本發(fā)明中所提出的FB1的阻抗檢測方法具有操作更簡便靈活，儀器設(shè)備更簡單，試劑用量少，檢測成本低廉等特點。

附圖說明

圖1中，A為在不同F(xiàn)B1濃度下的阻抗圖譜；B為FB1濃度與△R_et值的對應(yīng)關(guān)系圖，插圖為標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實施方式

實施例1：

SPCE預(yù)處理

(1)對SPCE進行清洗：處理方法是在5mL H₂SO₄(0.5M)含0.1M KCl的溶液中對SPCE進行循環(huán)伏安掃描，掃描范圍設(shè)定為-0.2～1.5V，掃描速率為100mV s^-1，直到掃描得到重疊的循環(huán)伏安曲線，二次水淋洗，氮氣吹干，備用。

實施例2：

適配體的活化

(2)活化的FB1核酸適配體溶液的制備：用50mM Tris-HCl緩沖溶液溶解FB1核酸適配體，使FB1核酸適配體的濃度為100μM，得到溶液A；取20μL溶液A加入到5μL含有100mM三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)的50mM Tris-HCl緩沖溶液B(pH＝7.4)中，得到混合液C；然后，將混合液C放置在往復(fù)式震蕩儀上室溫條件下反應(yīng)1h；最后，離心移去多余的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽，重新分散在2mL 50mM Tris-HCl緩沖溶液D(pH＝7.4，含有0.1M NaCl，0.2M KCl，5.0mM MgCl₂和1.0mM EDTA)中，得到活化的FB1核酸適配體溶液，備用。

實施例3：

免標(biāo)記電化學(xué)適配體傳感器的構(gòu)建

(3)AuNPs-SPCE構(gòu)建：將上述處理過的SPCE浸入5mL HAuCl₄溶液(2mM)進行金納米粒子的表面沉積，沉積電壓為0.5V，沉積時間設(shè)定為1200s，得到AuNPs-SPCE，二次蒸餾水淋洗，氮氣吹干，備用。

(4)電沉積AuNPs的量與沉積時間的關(guān)系：設(shè)置不同的沉積時間，在SPCE表面進行電沉積，對不同沉積時間下的電極進行電化學(xué)阻抗分析，得到一系列的電化學(xué)阻抗譜，并繪制時間-阻抗關(guān)系曲線。

(5)FB1核酸適配體修飾的AuNPs-SPCE的制備：首先取10μL的活化的FB1核酸適配體溶液滴涂在(3)中得到電極的工作電極表面，4℃條件下反應(yīng)6h后，通過Au-S鍵共價結(jié)合得到FB1核酸適配體修飾的AuNPs-SPCE(aptamer-AuNPs-SPCE)，用50mM Tris-HCl緩沖溶液淋洗，氮氣吹干；

然后在電極上滴涂10μL 6-巰基己醇(MCH)溶液(1mM)，室溫條件下反應(yīng)1h，得到表面封閉的電極，用50mM Tris-HCl緩沖液淋洗，氮氣吹干；得到可用于伏馬毒素B1檢測的免標(biāo)記電化學(xué)適配體傳感器，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例4：

建立伏馬菌毒素B1檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線

對FB1標(biāo)準(zhǔn)品進行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：取10μL不同濃度的FB1標(biāo)準(zhǔn)溶液滴涂在(5)的電化學(xué)傳感界面上，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度依次是0，0.005，0.01，0.05，0.25，1，2，5，10，50，和100ng mL^-1，在37℃條件下孵化30min，之后將修飾電極用Tris-HCl緩沖液和二次蒸餾水淋洗，氮氣吹干；將修飾電極置于5mL 5mM阻抗液中，阻抗液為0.1M磷酸鹽緩沖溶液(PB，pH 7.4)+5mM[Fe(CN)₆]^3-/4-+0.1M KCl，掃描電化學(xué)阻抗圖譜，根據(jù)阻抗值與對應(yīng)的FB1標(biāo)準(zhǔn)樣濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖1中，圖A為在不同F(xiàn)B1濃度(從a到k依次為：0，0.005，0.01，0.05，0.25，1，2，5，10，50，100ng mL^-1)下的阻抗圖譜，從圖中可以看出，隨著濃度的增大阻抗圖譜中所呈現(xiàn)的半圓弧也逐漸增大，表明FB1的加入對傳感體系中的電荷傳遞起到一個阻礙作用；圖B為FB1濃度與EIS值的對應(yīng)關(guān)系圖，插圖為標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，可以看出在0～50ng mL^-1的濃度范圍內(nèi)阻抗值與FB1濃度的對數(shù)呈現(xiàn)一個很好的線性關(guān)系。

上述實驗所涉及的：

1.適配體序列：5’-SH-(CH₂)₆-ATA CCA GCT TAT TCA ATT AAT CGC ATT ACC TTA TAC CAG CTT ATT CAA TTA CGT CTG CAC ATA CCA GCT TAT TCA ATT AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3’；

2.FB1檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線是指該傳感器在與不同濃度的FB1進行反應(yīng)后，掃描得到其交流阻抗圖譜，根據(jù)不同濃度下阻抗值制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.本發(fā)明中所用的Tris-HCl緩沖溶液pH均為7.4。

SEQUENCE LISTING

<110> 江蘇大學(xué)

<120> 一種檢測伏馬毒素B1的電化學(xué)適配體傳感器的制備方法

<130> 一種檢測伏馬毒素B1的電化學(xué)適配體傳感器的制備方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ataccagctt attcaattaa tcgcattacc ttataccagc ttattcaatt acgtctgcac 60

ataccagctt attcaattag atagtaagtg caatct 96