本發(fā)明屬于生物醫(yī)學工程領域，尤其涉及一種非診斷目的的檢測HCV抗體的方法及試劑盒。

背景技術：

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是單股正鏈RNA病毒，屬黃病毒科嗜肝病毒屬。HCV經(jīng)過血液傳播，感染人類可引發(fā)肝炎，并易發(fā)展為慢性肝炎、肝硬化、甚至肝癌。據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，全世界約有1.3～1.5億人感染HCV病毒，每年新增300～400萬例病毒感染病例，約50萬人死于HCV感染相關的肝病，HCV已成為嚴重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題。因此，篩查部分人群尤其是高危人群的HCV抗體很有必要，選擇一種靈敏、準確、及時、重復性好且窗口期短的HCV病毒檢測方法，對于HCV病毒的診療具有重要意義。

目前，臨床上監(jiān)測HCV感染的實驗室方法有分子生物學方法檢測丙肝病毒核酸和血清學方法檢測血清HCV抗體，分子生物學方法試劑較為貴重，且操作復雜，而血清學方法檢測HCV抗體與之相比較，有著操作簡單、費用低廉等好處，是目前應用最廣泛的用于流行病學調(diào)查、臨床丙型肝炎患者的篩查和診斷的檢測項目，可為丙型肝炎的早發(fā)現(xiàn)和治療提供可靠依據(jù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是HCV抗體檢測最常用的方法。然而ELISA的檢測下限仍具有局限性，不能滿足感染早期低濃度的HCV抗體水平的檢測。

雜交鏈反應(hybridization chain reaction，HCR)是一種新型高效的核酸擴增方法，HCR可以在無酶的條件下實現(xiàn)DNA的擴增。中國發(fā)明專利申請CN103940989A公開了一種基于HCR和單分子計數(shù)的免疫熒光技術檢測TNF-α。已有HCV抗體篩查方法仍存在諸多問題，需要建立檢測靈敏高、便捷的檢測方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種HCV抗體免疫檢測方法及試劑盒，以降低HCV抗體的檢測下限濃度，提高檢測靈敏度。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明通過HCR體系引入ELISA進行信號放大來實現(xiàn)HCV抗體的檢測。該方法利用間接法ELISA捕獲血清中的HCV抗體，通過生物素-親和素系統(tǒng)引入HCR體系，HCR體系在常溫下進行擴增，形成DNA雙鏈聚合物。該聚合物標記了生物素，可以和親和素標記的辣根過氧化物酶結合，從而進行顯色檢測。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：一種非診斷目的的HCV抗體免疫檢測方法，包括：

使HCV抗原特異性地捕獲檢測樣本中的HCV抗體，然后加入生物素標記二抗，孵育形成抗原-抗體-生物素標記二抗復合物；

在鏈霉親和素存在的條件下，加入生物素化引物Biotin-I，孵育使所述復合物與Biotin-I結合，然后加入生物素化的發(fā)卡鏈H1和發(fā)夾鏈Biotin-H2進行雜交反應；

加入親和素標記的辣根過氧化物酶，催化底物液顯色，通過測定吸光度進行HCV抗體的定量檢測；

所述Biotin-I堿基序列為5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG CTC TAC TTT TT-biotin-3’；

所述H1堿基序列為5’-GTA GAG CAC GCC GAA TCC TAG ACT CAA AGT AGT CTA GGA TTC GGC GTG-3’；

所述Biotin-H2的堿基序列為5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAA TCC TAG ACT ACT TTG TTT TT-Biotin-3’。

在一個具體實施方式中，將HCV抗原包被于酶標板上，用封閉液處理后，將含有HCV抗體的檢測樣本加入微孔板，36～38℃溫育，使HCV抗原特異性地捕獲HCV抗體；加入生物素化羊抗人IgG在36～38℃溫育，在微孔板上形成抗原-抗體-生物素標記二抗復合物。

所述生物素標記二抗可以為生物素化的羊抗人IgG或生物素化的鼠抗人IgG。

在一個具體實施方式中，H1和Biotin-H2先經(jīng)下述預處理：經(jīng)95～98℃水浴1～3min后，立即冰浴。

在一個具體實施方式中，免疫反應之后，向微孔板中加入鏈霉親和素在36～38℃溫育，甩去孔中液體后拍干，加入Biotin-I在36～38℃溫育，使所述復合物與Biotin-I結合。

在一個具體實施方式中，加入H1和Biotin-H2，室溫下反應1～3h，使H1和Biotin-H2打開發(fā)夾結構、交替雜交，形成有缺口的雙鏈DNA聚合物。

在一個具體實施方式中，加入親和素標記的辣根過氧化物酶在36～38℃溫育后倒出液體，加入底物緩沖液及底物液在36～38℃溫育，再加入終止液，混勻后比色。

本發(fā)明還提供一種HCV抗體免疫檢測試劑盒，包括：

HCV抗原、生物素標記二抗、鏈霉親和素、生物素化引物Biotin-I、生物素化的發(fā)卡鏈H1、發(fā)夾鏈Biotin-H2和親和素標記的辣根過氧化物酶；

所述Biotin-I堿基序列為5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG CTC TAC TTT TT-biotin-3’；

所述H1堿基序列為5’-GTA GAG CAC GCC GAA TCC TAG ACT CAA AGT AGT CTA GGA TTC GGC GTG-3’；

所述Biotin-H2的堿基序列為5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAA TCC TAG ACT ACT TTG TTT TT-Biotin-3’。

在一個具體實施方式中，所述HCV抗原濃度為115～125ng/mL；

所述生物素標記二抗?jié)舛葹?.5～2.2μg/mL；

所述鏈霉親和素濃度為1.3～1.6μg/mL；

所述Biotin-I濃度為8～12nM，配置時加入SPSC緩沖液；

所述H1和Biotin-H2濃度均為180～220nM，配置時加入SPSC緩沖液；

所述親和素標記的辣根過氧化物酶濃度為22～28μg/mL。

在一個具體實施方式中，還包括包被液、封閉液、洗液、底物液、底物緩沖液和終止液；包被液為含115～125ng/mL HCV抗原的8～12mM PBS緩沖液；封閉液為含鮭魚精DNA 40～60μg/mL的0.8～1.2％BSA溶液。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術具有如下優(yōu)點：

(1)HCR是利用一組互補的、動力學受限的發(fā)夾探針來實現(xiàn)雜交的鏈反應，它是在等溫、無酶的條件下進行的，穩(wěn)定而廉價。本發(fā)明將HCR引入了ELISA，本發(fā)明中抗體與酶是一對多的關系，在利用抗原抗體反應保證檢測特異性的同時，利用HCR進行信號放大，實現(xiàn)了HCV抗體的超靈敏檢測，檢測下限低至4.68pg/mL，比傳統(tǒng)ELISA至少提高2個數(shù)量級。

(2)本方法操作簡便，無需特殊儀器，且具有易于自動化、穩(wěn)定性強、毒性低等特點。

附圖說明

圖1是本發(fā)明HCR-ELISA檢測HCV抗體的原理示意圖；

圖2是傳統(tǒng)ELISA和HCR-ELISA定量檢測不同濃度HCV抗體的結果對比；

圖3是40例臨床標本檢測結果。

具體實施方式

本發(fā)明所述“室溫”具有本領域公知的含義，具體是指20-30℃，優(yōu)選20-25℃。

圖1是本發(fā)明HCR-ELISA檢測HCV抗體的原理示意圖。HCV抗原包被于微孔板上，特異性地捕獲血清中的HCV抗體。加入生物素化的羊抗人IgG(免疫球蛋白G)后，在微孔板上形成了抗原-抗體-生物素羊抗人IgG復合物。在鏈霉親和素存在的條件下，通過生物素-親和素之間的作用，這些復合物可進一步與生物素標記的引發(fā)鏈I(Biotin-I)結合。加入發(fā)夾H1和Biotin-H2，引發(fā)鏈可催化H1和Biotin-H2打開發(fā)夾結構，H1和Biotin-H2交替雜交，形成有缺口的雙鏈DNA聚合物，加入SA-HRP，該酶催化底物液顯色，使信號得以放大顯色。因此利用簡易的紫外分光光度計即可對血清中的抗體進行定量檢測。

在一個具體的實施方式中，本發(fā)明的一種基于雜交鏈反應的HCV抗體免疫檢測方法，包括以下步驟：

(1)間接法ELISA捕獲檢測樣本中的HCV抗體：將HCV抗原包被于微孔板上，冷藏過夜。加入封閉液室溫放置2～4h后棄去封閉液，拍干冷藏備用。將檢測樣本加入微孔板，36～38℃溫育0.5～1h，HCV抗原可特異性地捕獲血清中的HCV抗體。加入生物素化羊抗人IgG 36～38℃溫育0.5～1h后，在微孔板上形成抗原-抗體-生物素鼠抗人IgG復合物。每步反應之后均用PBST洗液洗板，以除去未結合的試劑；

(2)基于HCR信號放大的免疫檢測技術：免疫反應之后，向微孔板中加入的鏈霉親和素，36～38℃溫育20～40min。甩去孔中液體后拍干，加入Biotin-I，36～38℃溫育20～40min后洗板，加入H1和Biotin-H2，混勻，室溫下放置使其反應1～3h。洗板除去未結合的發(fā)夾鏈；

(3)顯色及信號檢測：加入親和素標記的辣根過氧化物酶，36～38℃溫育20～40min，洗板后充分拍干，加入底物緩沖液及底物液，36～38℃溫育20～40分鐘。加入終止液，混勻后比色。

其中，HCV抗原濃度為115～125ng/mL；生物素標記二抗?jié)舛葹?.5～2.2μg/mL；鏈霉親和素(SA)濃度為1.3～1.6μg/mL；Biotin-I濃度為8～12nM，配置時加入SPSC緩沖液；H1和Biotin-H2濃度為180～220nM，配置時加入SPSC緩沖液；親和素標記的辣根過氧化物酶(SA-HRP)的濃度為22～28μg/mL。

所述生物素化引物(Biotin-I)的堿基序列為5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG CTC TAC TTT TT-biotin-3’，如SEQ ID NO.1所示；

所述發(fā)卡鏈H1(H1)的堿基序列為5’-GTA GAG CAC GCC GAA TCC TAG ACT CAA AGT AGT CTA GGA TTC GGC GTG-3’如SEQ ID NO.2所示；

所述發(fā)夾鏈Biotin-H2的堿基序列為5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAA TCC TAG ACT ACT TTG TTT TT-Biotin-3’如SEQ ID NO.3所示。

步驟(2)中H1和Biotin-H2需如下預處理：經(jīng)95～98℃沸水浴1～3min后，立即冰浴，冷藏保存?zhèn)溆?。煮沸可使發(fā)夾結構打開成為單鏈DNA。

需要特別說明的是，本發(fā)明方法之所以能夠用于HCV抗體的檢測，Biotin-I、發(fā)卡鏈H1和發(fā)夾鏈Biotin-H2的選擇至關重要。本發(fā)明人是經(jīng)大量的試驗篩選、偶然得出SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的序列。特別的是，在該序列基礎上取代、缺失或添加一個或多個核苷酸，均無法實現(xiàn)HCV抗體的檢測或并不能降低檢測下限濃度、提高檢測靈敏度。

下面結合附圖和一個具體實施例對本發(fā)明的技術方案進行詳細說明。

實施例1

實施例中用到的各種溶液配方如下：

磷酸鈉-氯化鈉緩沖溶液(sodium phosphate-sodium chloride buffer solution，SPSC)(50mM Na₂HPO₄/1.0M NaCl)：17.9g的Na₂HPO₄·12Biotin-H2O，58.5g的NaCl加少許超純水溶解，用鹽酸調(diào)pH至7.5，定容至100mL。

10mM磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)(pH＝7.4)：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄·12Biotin-H2O、0.24g KBiotin-H2PO₄溶解到1L超純水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH＝7.4，高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Biotin-I的配制：將按已知序列合成的3.3nmol Biotin-I用33μl超純水溶解至100μM，并用SPSC緩沖液稀釋至10nM。分裝，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?，使用前避免反復凍融?/p>

H1和Biotin-H2的配制：將按已知序列合成的2.1nmol H1用21μl超純水溶解，2.2nmol Biotin-H2用21μl超純水溶解，用SPSC緩沖液稀釋至200nM。-20℃冷凍保存?zhèn)溆?，使用前避免反復凍融?/p>

所用到的洗液、底物緩沖液、底物液和終止液，為ELISA的常用試劑。

本實施例的基于雜交鏈反應的HCV抗體免疫檢測方法，具體步驟如下：

(一)間接法ELISA捕獲檢測樣本中的HCV抗體：

(1)H1和Biotin-H2預處理：200nM的H1和Biotin-H2經(jīng)98℃沸水浴2min后，立即冰浴，保存在4℃?zhèn)溆茫?/p>

(2)將120ng/mL的HCV抗原溶液(含有HCV抗原120ng/mL的10mM PBS溶液)注入96孔聚苯乙烯微孔板中，每孔200μL，4℃過夜；甩去包被液，每孔加入封閉液(含鮭魚精DNA 50μg/mL的1％BSA溶液)200μL，室溫放置2h后棄去封閉液，拍干4℃冷藏備用；

(3)將100μL含有不同濃度的HCV抗體的樣本加入微孔板，37℃水浴箱溫育1h；

(4)甩去孔中液體后，PBST洗板1次，浸泡60s，拍干，加入100μL 1.8μg/mL(1:4000)生物素化羊抗人IgG溶液，37℃水浴箱溫育1h；

(二)基于HCR信號放大的免疫檢測技術：

(5)甩去微孔中液體后，PBST洗板1次，浸泡60s，拍干，加入100μL 1.5μg/mL的SA，37℃水浴箱溫育30min；

(6)甩去孔中液體后拍干，加入100μL 10nM的Biotin-I，37℃溫育30min；

(7)甩去孔中液體后，常規(guī)洗液洗一遍，浸泡60s，拍干，加入200nM的H1和Biotin-H2各50μL，混勻，室溫下放置使其反應1h；

(三)顯色及信號檢測：

(8)甩去孔中液體后，PBST洗板1次，浸泡60s，拍干，加入100μL 25μg/mL的SA-HRP，37℃溫育30min后倒出液體；

(9)將含2％的Tween 20的PBS洗液注滿各孔，靜置60s后棄去孔內(nèi)洗液，重復5次后拍干即可；

(10)加入底物緩沖液(含過氧化脲的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液)及底物液(含TMB的溶液)各50μL，輕輕振蕩混勻，置37℃水浴箱溫育30分鐘。再加入終止液(2mol/L硫酸溶液)50μL，混勻后比色；

(11)反應溶液450nm處的吸光度值(OD)使用RT 6100微孔板分光光度計進行測定。

對該實施例所建立方法進行檢測性能考察，結果如下：

配制不同濃度的HCV抗體樣本，使?jié)舛确謩e為0、10^-11、10^-10、10^-9、10^-8g/mL，檢測方法同實施例1，考察450nm處OD值與HCV抗體濃度之間的關系。結果表明，當HCV抗體濃度在10^-11g/mL至10^-8g/mL的范圍時，HCV抗體濃度與450nm處吸光度的吸光度值呈擬線性關系(附圖2)。檢測下限為4.68pg/mL,，比傳統(tǒng)ELISA至少提高2個數(shù)量級。因此，HCR-ELISA法定量檢測HCV抗體具有較高的靈敏度。

采用本發(fā)明實施例1實驗步驟對40例臨床患者血清標本進行檢測，同時與商品化的HCV抗體ELISA檢測試劑盒(珠海麗珠試劑股份有限公司)進行對比，結果如附圖3所示，兩種方法檢測結果基本一致，說明本發(fā)明檢測HCV抗體具有較好的準確性。

作為對比試驗，采用如下的序列檢測HCV抗體：

Biotin-I堿基序列為5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC TTT TTT TTT T-biotin-3’；

Biotin-H1堿基序列為5’-GTA GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA CAA AGT TCT CAA GGA CCA CCG CAT-biotin-3’；

H2的堿基序列為5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGG TGG TCC TTG AGA ACT TTG-3’；

其他步驟和參數(shù)與實施例1相同，結果顯示，本發(fā)明所用序列所得檢測下限為4.68pg/mL,優(yōu)于對比序列的檢測下限8.42pg/mL。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大學

<120> 一種非診斷目的的HIV抗體免疫檢測方法及試劑盒

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agtctaggat tcggcgtgct ctacttttt 29

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtagagcacg ccgaatccta gactcaaagt agtctaggat tcggcgtg 48

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agtctaggat tcggcgtggg ttaacacgcc gaatcctaga ctactttgtt ttt 53