本發(fā)明涉及高分子材料科學(xué)和電化學(xué)生物分析等科技領(lǐng)域，具體涉及一種基于聚吡咯-聚多巴胺的免疫傳感器的制備方法

背景技術(shù)：

通過抗原-抗體的結(jié)合反應(yīng)形成生物活性體的機理十分復(fù)雜，而抗原-抗體的結(jié)合反應(yīng)在人類疾病的預(yù)后治療中有著重要地位。免疫傳感器是基于抗原-抗體的結(jié)合反應(yīng)從而對抗原等進行選擇性的識別與檢測的傳感器。由于抗原與相應(yīng)的抗體的結(jié)合是一一對應(yīng)的，因此，基于抗原-抗體的電化學(xué)免疫傳感器有著高度的選擇性、敏感性及較好的穩(wěn)定性。但是原子級別的抗原-抗體間相互作用通常需要X射線光散射技術(shù)或者核磁共振技術(shù)進行檢測，相應(yīng)的免疫傳感器制備復(fù)雜、所需檢測時間較長、成本較高，因此其應(yīng)用受到了限制。而將抗原-抗體的結(jié)合反應(yīng)與電化學(xué)技術(shù)相結(jié)合能很好地解決這些問題。傳統(tǒng)電化學(xué)傳感器制備成本較低，同時還具有響應(yīng)時間短、靈敏度高及輕便性等優(yōu)點，在檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。將兩者相結(jié)合制備的電化學(xué)免疫傳感器在臨床分析及早期腫瘤的篩查和診斷領(lǐng)域都有著舉足輕重的地位。

目前，已有報道將生物相容性的、親水、抗污的PEG基聚合物和殼聚糖進行改性，從而提高其生物物理性質(zhì)，并將其運用于電化學(xué)生物傳感器方面。但是，由于大多數(shù)PEG基聚合物及殼聚糖都不具有導(dǎo)電性，因此其在電化學(xué)分析方面的應(yīng)用受到了很大的限制。而導(dǎo)電聚合物的出現(xiàn)很好的解決了傳統(tǒng)生物相容性聚合物導(dǎo)電性差的問題，拓展了電化學(xué)免疫傳感器的應(yīng)用范圍。

在眾多導(dǎo)電聚合物中，聚吡咯由于具有優(yōu)異的導(dǎo)電性、制備成本低廉、有較好的長期穩(wěn)定性及生物相容性等優(yōu)點而得到廣泛的研究。但是，聚吡咯是一種黑色沉淀，在水以及大多數(shù)有機溶劑中都不溶，使得其后期的功能化改性與制備十分困難。同時，由于聚吡咯機械性能較差，且?guī)缀醪痪哂姓掣叫?，因此?yán)重阻礙了其在工業(yè)上的應(yīng)用。常用于改善導(dǎo)電聚合物溶解性的辦法是摻雜。具有良好的生物相容性的多巴胺是與具有粘附性的貽貝蛋白有著相似的結(jié)構(gòu)的小分子，并且在堿性以及氧化劑存在的條件下可以在幾乎任何基材上自聚形成具有粘附性的聚多巴胺膜。其制備條件溫和，過程中不需要加入有機溶劑及有毒物質(zhì)，因此，聚多巴胺在功能化涂層及提高眾多生物材料、納米材料的粘附性能等方面有著廣泛應(yīng)用。多巴胺在吡咯聚合過程中可以充當(dāng)摻雜劑，在不降低聚吡咯生物相容性的情況下可以提高聚吡咯的水溶性及粘附性能。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了改善聚吡咯的水溶性和導(dǎo)電性，本發(fā)明將多巴胺作為摻雜劑提高聚吡咯的水溶性和粘附性能，在聚多巴胺的弱還原作用下，將氯金酸原位還原形成金納米粒子，利用金納米粒子與抗體之間的相互作用將抗體固定在聚吡咯-聚多巴胺膜表面得到能檢測相應(yīng)抗原的電化學(xué)免疫傳感器。所述方法包括如下步驟：

第一步：聚吡咯-聚多巴胺復(fù)合物的制備

將吡咯(PPy)、多巴胺(DA)溶于緩沖溶液中，通15～30min N₂除去體系中的氧氣，將溶液體系移入冰浴中，在400～1000rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌，然后向其中加入過硫酸銨(APS)溶液，反應(yīng)8～24h，得到聚吡咯-聚多巴胺懸浮液，離心后，沉淀用去離子水洗滌，如此重復(fù)至上層清夜無色，將沉淀分散在水中，冷凍干燥得到聚吡咯-聚多巴胺復(fù)合物粉末；

第二步：聚吡咯-聚多巴胺膜修飾電極的制備

將第一步所得到的聚吡咯-聚多巴胺溶于超純水中，通過滴涂或旋涂的方法將聚吡咯-聚多巴胺水溶液修飾在電極表面，自然晾干后，得到聚吡咯-聚多巴胺膜修飾電極；

第三步：電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建

將聚吡咯-聚多巴胺膜修飾電極浸泡在氯金酸溶液中，氯金酸在電極表面原位還原形成金納米粒子，將得到的電極用去離子水清洗，再將表面修飾有金納米粒子的電極浸入到含抗體的磷酸鹽緩沖溶液中，分別用去離子水和磷酸鹽緩沖溶液清洗，然后將其浸入到牛血清蛋白溶液中以屏蔽非特異性吸附位點，再用去離子水和磷酸鹽緩沖溶液清洗后即制得電化學(xué)免疫傳感器。具體路線如附圖1所示。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明中將多巴胺作為吡咯聚合的摻雜劑，提高聚吡咯水溶性的同時還增強了其粘附性能，解決了聚吡咯后期加工困難的缺點，能實現(xiàn)對多種基材的改性，同時避免了小分子摻雜劑的加入，不破壞聚吡咯的生物相容性。

(2)在免疫傳感器中引入導(dǎo)電聚吡咯及金納米粒子，明顯提高了電極的導(dǎo)電性，同時增大了電極表面的比表面積，能大量固定抗體并保持其活性，因此制備的電化學(xué)免疫傳感器具有較高的靈敏度，較寬的檢測范圍和較低的檢測下限。

(3)與傳統(tǒng)X射線、核磁共振的檢測方法相比，電化學(xué)傳感器避免了檢測過程中對人體的傷害，同時具有耗時短、成本低廉、無需專業(yè)人員操作等優(yōu)點。

(4)本發(fā)明介紹的檢測方法是基于抗原-抗體的結(jié)合反應(yīng)，因此對所檢測的抗原具有很好的普適性，能用于多種對應(yīng)的抗體-抗原檢測。

附圖說明

圖1是Ab/Au/PPy-PDA/Au免疫傳感器的制備示意圖；

圖2是實施例1中Ab/Au/PPy-PDA/Au電極對不同濃度的CEA抗原溶液的DPV曲線；

具體實施方式

下面結(jié)合具體實例，進一步闡述本發(fā)明。這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

第一步：稱取0.1g Py和0.282g DA溶于40mL緩沖液中，冰浴攪拌，然后向其中加入5mL 1.0mg·mL^-1的APS溶液，Py與DA摩爾比例1：1，通N₂ 15min除掉氧氣，冰水浴下攪拌12h，反應(yīng)完成后將產(chǎn)物離心并用去離子水洗滌至上清液無色，所得沉淀再次分散在去離子水中，通過冷凍干燥的方法得到產(chǎn)物PPy-PDA；

第二步：稱取0.005g PPy-PDA，加入到6mL水，超聲分散1h，用微量計量器吸取10μL PPy-PDA水溶液滴涂于金電極表面，自然晾干，得到PPy-PDA/Au電極；

第三步：將PPy-PDA/Au電極浸入到0.5mg·mL^-1的氯金酸溶液中12h，用去離子水沖洗得到Au/PPy-PDA/Au電極。將Au/PPy-PDA/Au電極在4℃下浸入到1.08×10^-2mg·mL^-1的癌胚抗體(CEA Ab)溶液中24h，用去離子水和PBS溶液清洗，得到Ab/Au/PPy-PDA/Au電極，再將Ab/Au/PPy-PDA/Au電極浸入到10mg·mL^-1牛血清蛋白溶液中，在37℃下孵化2h，得到電化學(xué)免疫傳感器，使用前將其保存在4℃的pH＝6.0的磷酸鹽緩沖溶液中。

實施例2

第一步：稱取0.1g Py和0.565g DA溶于40mL緩沖液中，冰浴攪拌，然后向其中加入5mL 1.0mg·mL^-1的APS溶液，Py與DA摩爾比例1：2，通N₂ 15min除掉氧氣，冰水浴下攪拌12h，反應(yīng)完成后將產(chǎn)物離心并用去離子水洗滌至上清液無色，所得沉淀再次分散在去離子水中，通過冷凍干燥的方法得到產(chǎn)物PPy-PDA；

第二步：稱取0.005g PPy-PDA，加入到6mL水，超聲分散1h，用微量計量器吸取10μL PPy-PDA水溶液滴涂于金電極表面，自然晾干，得到PPy-PDA/Au電極；

第三步：將PPy-PDA/Au電極浸入到0.5mg·mL^-1的氯金酸溶液中12h，用去離子水沖洗得到Au/PPy-PDA/Au電極。將Au/PPy-PDA/Au電極在4℃下浸入到1.08×10^-2mg·mL^-1的癌胚抗體(CEA Ab)溶液中24h，用去離子水和PBS溶液清洗，得到Ab/Au/PPy-PDA/Au電極，再將Ab/Au/PPy-PDA/Au電極浸入到10mg·mL^-1牛血清蛋白溶液中，在37℃下孵化2h，得到電化學(xué)免疫傳感器，使用前將其保存在4℃的pH＝6.0的磷酸鹽緩沖溶液中。

實施例3

第一步：稱取0.1g Py和1.41g DA溶于40mL緩沖液中，冰浴攪拌，然后向其中加入5mL 1.0mg·mL^-1的APS溶液，Py與DA摩爾比例1：5，通N₂ 15min除掉氧氣，冰水浴下攪拌12h，反應(yīng)完成后將產(chǎn)物離心并用去離子水洗滌至上清液無色，所得沉淀再次分散在去離子水中，通過冷凍干燥的方法得到產(chǎn)物PPy-PDA；

第二步：稱取0.005g PPy-PDA，加入到6mL水，超聲分散1h，用微量計量器吸取10μL PPy-PDA水溶液滴涂于金電極表面，自然晾干，得到PPy-PDA/Au電極；

第三步：將PPy-PDA/Au電極浸入到0.5mg·mL^-1的氯金酸溶液中12h，用去離子水沖洗得到Au/PPy-PDA/Au電極。將Au/PPy-PDA/Au電極在4℃下浸入到1.08×10^-2mg·mL^-1的癌胚抗體(CEA Ab)溶液中24h，用去離子水和PBS溶液清洗，得到Ab/Au/PPy-PDA/Au電極，再將Ab/Au/PPy-PDA/Au電極浸入到10mg·mL^-1牛血清蛋白溶液中，在37℃下孵化2h，得到電化學(xué)免疫傳感器，使用前將其保存在4℃的pH＝6.0的磷酸鹽緩沖溶液中。

實施例4

第一步：稱取0.1g Py和1.97g DA溶于40mL緩沖液中，冰浴攪拌，然后向其中加入5mL 1.0mg·mL^-1的APS溶液，Py與DA摩爾比例1：7，通N₂ 15min除掉氧氣，冰水浴下攪拌12h，反應(yīng)完成后將產(chǎn)物離心并用去離子水洗滌至上清液無色，所得沉淀再次分散在去離子水中，通過冷凍干燥的方法得到產(chǎn)物PPy-PDA；

第二步：稱取0.005g PPy-PDA，加入到6mL水，超聲分散1h，用微量計量器吸取10μL PPy-PDA水溶液滴涂于金電極表面，自然晾干，得到PPy-PDA/Au電極；

第三步：將PPy-PDA/Au電極浸入到0.5mg·mL^-1的氯金酸溶液中12h，用去離子水沖洗得到Au/PPy-PDA/Au電極。將Au/PPy-PDA/Au電極在4℃下浸入到1.08×10^-2mg·mL^-1的癌胚抗體(CEA Ab)溶液中24h，用去離子水和PBS溶液清洗，得到Ab/Au/PPy-PDA/Au電極，再將Ab/Au/PPy-PDA/Au電極浸入到10mg·mL^-1牛血清蛋白溶液中，在37℃下孵化2h，得到電化學(xué)免疫傳感器，使用前將其保存在4℃的pH＝6.0的磷酸鹽緩沖溶液中。

實施例5

第一步：稱取0.1g Py和2.82g DA溶于40mL緩沖液中，冰浴攪拌，然后向其中加入5mL 1.0mg·mL^-1的APS溶液，Py與DA摩爾比例1：10，通N₂ 15min除掉氧氣，冰水浴下攪拌12h，反應(yīng)完成后將產(chǎn)物離心并用去離子水洗滌至上清液無色，所得沉淀再次分散在去離子水中，通過冷凍干燥的方法得到產(chǎn)物PPy-PDA；

第二步：稱取0.005g PPy-PDA，加入到6mL水，超聲分散1h，用微量計量器吸取10μL PPy-PDA水溶液滴涂于金電極表面，自然晾干，得到PPy-PDA/Au電極；

第三步：將PPy-PDA/Au電極浸入到0.5mg·mL^-1的氯金酸溶液中12h，用去離子水沖洗得到Au/PPy-PDA/Au電極。將Au/PPy-PDA/Au電極在4℃下浸入到1.08×10^-2mg·mL^-1的癌胚抗體(CEA Ab)溶液中24h，用去離子水和PBS溶液清洗，得到Ab/Au/PPy-PDA/Au電極，再將Ab/Au/PPy-PDA/Au電極浸入到10mg·mL牛血清蛋白溶液中，在37℃下孵化2h，得到電化學(xué)免疫傳感器，使用前將其保存在4℃的pH＝6.0的磷酸鹽緩沖溶液中。

實施例6

第一步：稱取0.1g Py和0.786g DA溶于40mL緩沖液中，冰浴攪拌，然后向其中加入5mL 1.0mg·mL^-1的APS溶液，Py與DA摩爾比例5：1，通N₂ 15min除掉氧氣，冰水浴下攪拌12h，反應(yīng)完成后將產(chǎn)物離心并用去離子水洗滌至上清液無色，所得固體再次分散在去離子水中，通過冷凍干燥的方法得到產(chǎn)物PPy-PDA；

第二步：稱取0.005g PPy-PDA，加入到6mL水，超聲分散1h，用微量計量器吸取10μL PPy-PDA水溶液滴涂于金電極表面，自然晾干，得到PPy-PDA/Au電極；

第三步：將PPy-PDA/Au電極浸入到0.5mg·mL^-1的氯金酸溶液中12h，用去離子水沖洗得到Au/PPy-PDA/Au電極。將Au/PPy-PDA/Au電極在4℃下浸入到1.08×10^-2mg·mL^-1的癌胚抗體(CEA Ab)溶液中24h，用去離子水和PBS溶液清洗，得到Ab/Au/PPy-PDA/Au電極，再將Ab/Au/PPy-PDA/Au電極浸入到10mg·mL^-1牛血清蛋白溶液中，在37℃下孵化2h，得到電化學(xué)免疫傳感器，使用前將其保存在4℃的pH＝6.0的磷酸鹽緩沖溶液中。

測試?yán)?/p>

制備的電化學(xué)免疫傳感器對癌胚抗原(CEA)的電化學(xué)檢測

將實施例1制備好的免疫傳感器分別浸入濃度依次為(a)0mg·mL^-1，(b)3.6×10^-8mg·mL^-1，(c)3.6×10^-7mg·mL^-1，(d)3.6×10^-6mg·mL^-1，(e)3.6×10^-5mg·mL^-1，(f)3.6×10^-4mg·mL^-1的癌胚抗原磷酸鹽緩溶液(pH＝7.4)中，37℃條件下孵育2h；將吸附癌胚抗原(CEA)的免疫傳感器取出，分別用去離子水和磷酸鹽緩沖液沖洗后，以該免疫傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極，在上海辰華CHI660A電化學(xué)工作站上，采用差分脈沖伏安法法(DPV)進行測定。

通過測試未結(jié)合抗原的免疫傳感器與結(jié)合不同濃度癌胚抗原的免疫傳感器的DPV曲線，通過峰電流的變化，實現(xiàn)對癌胚抗原的檢測，檢測結(jié)果如附圖2所示。