本發(fā)明涉及抗體檢測方法領(lǐng)域，特別是涉及一種基于濾紙干血斑檢測ToRCH10項(xiàng)抗體的方法。

背景技術(shù)：

ToRCH一詞是美國學(xué)者Nahmias于1971年提出的，由多種引起宮內(nèi)感染的微生物和病毒的英文名稱首字母組成。其中To代表剛地弓形蟲(ToxopLasmagondii，Tox)，R代表風(fēng)疹病毒(RubeLLaVirus,Rub)，C代表巨細(xì)胞病毒(CytomegaLoVirus,CMV)，H代表單純皰疹病毒1型和2型(Herpes SimpLexVirus 1and 2,HSV1/2)。ToRCH感染是宮內(nèi)感染的重要危險(xiǎn)因素，孕婦被感染其中一種或多種病原體后，可通過胎盤傳播給胎兒或通過產(chǎn)道引起圍產(chǎn)期感染，導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、早產(chǎn)、先天畸形和智力障礙等不良結(jié)局，在圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)中稱為ToRCH綜合癥。

在免疫分析方法中，由于全血中的過氧化物酶、凝血因子等成分對于檢測結(jié)果有影響，傳統(tǒng)的均采用血清進(jìn)行免疫分析檢測。

目前，國際上公認(rèn)的較為準(zhǔn)確的ToRCH檢測方法是測定人體血清中的特異性IgG、IgM抗體，以判斷受感染的情況。檢測方法有酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法等分析檢測技術(shù)。

然而上述方法需要最終測定血清樣本，因此需要采集較多的全血樣本用于制備血清樣本，當(dāng)檢測人群為新生兒時會較難采集血清或全血樣本。另外還存在樣本不易保存或運(yùn)輸?shù)膯栴}。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，有必要針對檢測ToRCH10項(xiàng)抗體時樣本用量多以及樣本不易保存或運(yùn)輸?shù)膯栴}，提供一種基于濾紙干血斑檢測ToRCH10項(xiàng)抗體的方法。

本發(fā)明提供的一種基于濾紙干血斑檢測ToRCH10項(xiàng)抗體的方法，其中，所述方法包括以下步驟：

從濾紙片干血斑取得直徑為2-4mm的血片；

將血片采用樣本稀釋液復(fù)溶，制得復(fù)溶樣品；

復(fù)溶樣品采用流式熒光發(fā)光法測定。

在其中的一個實(shí)施例中，所述樣本稀釋液為包括羊抗人IgG抗體或牛血清白蛋白的磷酸緩沖溶液。

在其中的一個實(shí)施例中，所述血片采用樣本稀釋液復(fù)溶是將血片置于離心管中，向離心管中加入所述樣本稀釋液，室溫震蕩0.5-2h復(fù)溶，制得復(fù)溶樣品。

在其中的一個實(shí)施例中，所述血片為4-8片，所述加入的樣本稀釋液為100-200μL。

在其中的一個實(shí)施例中，所述血片為4片，所述加入的樣本稀釋液為100μL。

在其中的一個實(shí)施例中，所述流式熒光發(fā)光法包括以下步驟：

步驟1：將所述復(fù)溶樣品與磁性微球懸液混合，使復(fù)溶樣品中的特異性IgG抗體或IgM抗體分別結(jié)合到交聯(lián)有與所述IgG抗體或IgM抗體對應(yīng)抗原的磁性微球上，洗滌去除反應(yīng)后的剩余液體，制得磁性微球-抗原-抗體復(fù)合物；

步驟2：將藻紅蛋白標(biāo)記的抗人IgG抗體或IgM抗體加入步驟1制備的磁性微球-抗原-抗體復(fù)合物中，洗滌去除反應(yīng)后的剩余液體，制得磁性微球-抗原-抗體-藻紅蛋白標(biāo)記的抗人IgG抗體或IgM抗體復(fù)合物；

步驟3：將磁性微球重懸液加入步驟2制備的磁性微球-抗原-抗體-藻紅蛋白標(biāo)記的抗人IgG抗體或IgM抗體復(fù)合物中，采用多功能流式分析儀檢測。

在其中的一個實(shí)施例中，所述步驟1為：

在96孔反應(yīng)板上各孔加入50μL/孔的磁性微球懸液；

在96孔反應(yīng)板上各孔中分別加入10μL/孔的對照品、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品以及復(fù)溶樣品；

加蓋封板紙，微孔板振蕩器上充分混勻，置37℃恒溫箱避光反應(yīng)30min；

取出96孔反應(yīng)板，振蕩30s混勻后置于磁板上靜置60s，甩掉反應(yīng)液后各孔分別加入200μL/孔的洗液，重懸30s后置于磁板上靜置60s，甩掉洗液，以除去反應(yīng)殘留物。

在其中的一個實(shí)施例中，所述步驟2為：

在所述步驟1處理后的96孔反應(yīng)板的各孔分別加入50μL/孔的藻紅蛋白標(biāo)記的抗人IgG抗體或IgM抗體溶液，加蓋封板紙，微孔板振蕩器上充分混勻，置37℃恒溫箱避光反應(yīng)30min；

取出96孔反應(yīng)板，振蕩30s混勻后置于磁板上靜置60s，甩掉反應(yīng)液后各孔分別加入200μL/孔洗液，重懸30s后置于磁板上靜置60s，甩掉洗液，以去除反應(yīng)殘留物。

在其中的一個實(shí)施例中，所述步驟3為：

在所述步驟2處理后的96孔反應(yīng)板的各孔分別加入150μL/孔的磁性微球重懸液，充分振蕩，使磁性微球懸?。粚?6孔反應(yīng)板在多功能流式分析儀上測試。

上述基于濾紙干血斑檢測ToRCH10項(xiàng)抗體的方法，克服了免疫分析法中認(rèn)為全血中的凝血因子會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響、而采用血清作為檢測樣品進(jìn)行分析的普遍認(rèn)識，通過采用濾紙干血斑(全血)結(jié)合流式熒光發(fā)光法(化學(xué)發(fā)光免疫分析法中的一種)測定IgG抗體或IgM抗體，解決了現(xiàn)有檢測方法中需樣本量較多的問題，減少了需要的樣本量，對人體損傷小，樣本便于保存和運(yùn)輸，特別是針對采用對象是新生兒時，無需靜脈采血，采樣更加方便。

附圖說明

為了更清楚地說明本申請實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明中記載的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明方法與基于靜脈血清檢測ToRCH IgG抗體相關(guān)性示意圖；

圖2為本發(fā)明方法與基于靜脈血清檢測ToRCH IgM抗體相關(guān)性示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下通過實(shí)施例，并結(jié)合附圖，對本發(fā)明的基于濾紙干血斑檢測ToRCH10項(xiàng)抗體的方法進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明基于濾紙干血斑檢測ToRCH10項(xiàng)抗體，采樣量少，采樣方便，結(jié)合流式熒光發(fā)光法能達(dá)到基于靜脈血清檢測ToRCH10項(xiàng)抗體的準(zhǔn)確性。具體的，本發(fā)明方法包括以下步驟：

從濾紙片干血斑打下直徑為2-4mm的血片；

血片采用樣本稀釋液復(fù)溶，制得復(fù)溶樣品；

復(fù)溶樣品采用流式熒光發(fā)光法測定。

樣本稀釋液優(yōu)選為包括羊抗人IgG抗體或牛血清白蛋白的磷酸緩沖溶液。

血片采用樣本稀釋液復(fù)溶是將4-8片血片置于離心管中，向離心管中加入100-200μL樣本稀釋液，室溫震蕩0.5-2h復(fù)溶，制得復(fù)溶樣品。

流式熒光發(fā)光法包括以下步驟：

步驟1：將所述復(fù)溶樣品與磁性微球懸液混合，使復(fù)溶樣品中的特異性IgG抗體或IgM抗體分別結(jié)合到交聯(lián)有與所述IgG抗體或IgM抗體對應(yīng)抗原的磁性微球上，洗滌去除反應(yīng)后的剩余液體，制得磁性微球-抗原-抗體復(fù)合物；

其中，步驟1具體為：

在96孔反應(yīng)板上各孔加入50μL/孔的磁性微球懸液；

在96孔反應(yīng)板上各孔中分別加入10μL/孔的對照品，陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品以及復(fù)溶樣品；其中對照品優(yōu)選加入復(fù)數(shù)個孔位；

加蓋封板紙，微孔板振蕩器上充分混勻，置37℃恒溫箱避光反應(yīng)30分鐘；

取出96孔反應(yīng)板，振蕩30s混勻后置于磁板上靜置60s，甩掉反應(yīng)液后各孔分別加入200μL/孔的洗液，重懸30s后置于磁板上靜置60s，甩掉洗液，以除去反應(yīng)殘留物。

步驟2：將藻紅蛋白標(biāo)記的抗人IgG抗體或IgM抗體加入步驟1制備的磁性微球-抗原-抗體復(fù)合物中，洗滌去除反應(yīng)后的剩余液體，制得磁性微球-抗原-抗體-藻紅蛋白標(biāo)記的抗人IgG抗體或IgM抗體復(fù)合物；

其中，步驟2具體為：

在所述步驟1處理后的96孔反應(yīng)板的各孔分別加入50μL/孔的藻紅蛋白標(biāo)記的抗人IgG抗體或IgM抗體溶液，加蓋封板紙，微孔板振蕩器上充分混勻，置37℃恒溫箱避光反應(yīng)30min；

取出96孔反應(yīng)板，振蕩30s混勻后置于磁板上靜置60s，甩掉反應(yīng)液后各孔分別加入200μL/孔洗液，重懸30s后置于磁板上靜置60s，甩掉洗液，以去除反應(yīng)殘留物。

步驟3：將磁性微球重懸液加入步驟2制備的磁性微球-抗原-抗體-藻紅蛋白標(biāo)記的抗人IgG抗體或IgM抗體復(fù)合物中，采用多功能流式分析儀檢測。

其中，步驟3具體為：

在所述步驟2處理后的96孔反應(yīng)板的各孔分別加入150μL/孔的磁性微球重懸液，充分振蕩，使磁性微球懸??；將96孔反應(yīng)板在多功能流式分析儀上測試。

本發(fā)明實(shí)施例與參照例采用的儀器與試劑如下：

儀器：醫(yī)用低速離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療機(jī)械有限公司)，多功能流式分析儀Luminex 200(美國Luminex公司)，Harris Micro-punch打孔器(美國Harris公司)。

試劑：弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgG抗體檢測試劑盒(上海透景公司)，弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgM抗體檢測試劑盒(上海透景公司)。

其中，弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgG抗體檢測試劑盒中各溶液成分如表1所示；弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgM抗體檢測試劑盒中各溶液成分如表2所示。

表1弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgG抗體檢測試劑盒中各溶液成分表

其中，濃縮洗液使用前用去離子水10倍稀釋后備用。

表2弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgM抗體檢測試劑盒中各溶液成分表

其中，濃縮洗液使用前用去離子水10倍稀釋后備用。

本發(fā)明的濾紙片干血斑優(yōu)選的采樣點(diǎn)位腳后跟、腳大拇指、手指尖，優(yōu)選的針刺后用濾紙蘸取血滴或?qū)⒀蔚卧跒V紙片上，采樣后的濾紙室溫放置1-2h進(jìn)行干燥，制備濾紙片干血斑備用。

本發(fā)明靜脈血清作為參照樣品，驗(yàn)證本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性。靜脈血清采用如下方法制備：用促凝管采集靜脈血，室溫放置半小時后8000rpm離心4分鐘，取上層血清備用。

本發(fā)明具體實(shí)施例的復(fù)溶樣品與參照例的參照樣品來自6位受試者，實(shí)施例的濾紙片干血斑測試樣本采樣點(diǎn)為手指尖，分別記為S1、S2、S3、S4、S5以及S6，由該濾紙片干血斑制備的復(fù)溶樣品分別記為復(fù)溶樣品S1-S6；參照樣品的靜脈血清采自靜脈，分別記為C1、C2、C3、C4、C5以及C6。

實(shí)施例1

取弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgG抗體檢測試劑盒中的對照品、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品1-2以及靜脈血清C1-C6各10μL，分別用200μL弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgG抗體檢測試劑盒中IgG樣本稀釋液進(jìn)行稀釋，制得對照品稀釋液、陰性質(zhì)控品稀釋液、陽性質(zhì)控品1-2稀釋液、靜脈血清C1-C6稀釋液；

用打孔器分別在濾紙片干血斑S1-S6上打4個直徑為3毫米的圓片放入離心管中，打孔位置需覆蓋滿全血，分別加入100μL弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgG抗體檢測試劑盒中IgG樣本稀釋液室溫震蕩1小時進(jìn)行復(fù)溶，制得復(fù)溶樣品S1-S6。

步驟1

在96孔反應(yīng)板上各孔加入50μL/孔的弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgG抗體檢測試劑盒中的磁性微球懸液；

再在96孔反應(yīng)板上各孔中分別加入對照品稀釋液、陰性質(zhì)控品稀釋液、陽性質(zhì)控品1-2稀釋液、靜脈血清C1-C6稀釋液以及復(fù)溶樣品S1-S6，10μL/孔；

加蓋封板紙，微孔板振蕩器上充分混勻，置37℃恒溫箱避光反應(yīng)30分鐘；

取出96孔反應(yīng)板，振蕩30s混勻后置于磁板上靜置60s，甩掉反應(yīng)液后各孔分別加入200μL/孔的洗液，重懸30s后置于磁板上靜置60s，甩掉洗液，重復(fù)洗滌3次，以除去反應(yīng)殘留物。

步驟2

在步驟1處理后的96孔反應(yīng)板的各孔分別加入50μL/孔的弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgG抗體檢測試劑盒中的藻紅蛋白標(biāo)記的抗人IgG抗體溶液，加蓋封板紙，微孔板振蕩器上充分混勻，置37℃恒溫箱避光反應(yīng)30min；

取出96孔反應(yīng)板，振蕩30s混勻后置于磁板上靜置60s，甩掉反應(yīng)液后各孔分別加入200μL/孔洗液，重懸30s后置于磁板上靜置60s，甩掉洗液，重復(fù)洗滌3次，以去除反應(yīng)殘留物。

步驟3

在步驟2處理后的96孔反應(yīng)板的各孔分別加入150μL/孔的弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgG抗體檢測試劑盒中的磁性微球重懸液，充分振蕩，使磁性微球懸浮；將96孔反應(yīng)板在多功能流式分析儀上測試。

測試結(jié)果如表3所示。

表3實(shí)施例1測試結(jié)果

實(shí)施例2

取弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgM抗體檢測試劑盒中的對照品、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品以及靜脈血清C1-C6各10μL，分別用200μL弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgG抗體檢測試劑盒中IgM樣本稀釋液進(jìn)行稀釋，制得對照品稀釋液、陰性質(zhì)控品稀釋液、陽性質(zhì)控品稀釋液、靜脈血清C1-C6稀釋液；

用打孔器分別在濾紙片干血斑S1-S6上打4個直徑為3毫米的圓片放入離心管中，打孔位置需覆蓋滿全血，分別加入100μL弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgM抗體檢測試劑盒中ToRCH IgM樣本稀釋液室溫震蕩1小時進(jìn)行復(fù)溶，制得復(fù)溶樣品S1-S6。

步驟1

在96孔反應(yīng)板上各孔加入50μL/孔的弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgM抗體檢測試劑盒中的磁性微球懸液；

再在96孔反應(yīng)板上各孔中分別加入對照品稀釋液、陰性質(zhì)控品稀釋液、陽性質(zhì)控品稀釋液、靜脈血清C1-C6稀釋液以及復(fù)溶樣品S1-S6，10μL/孔；

加蓋封板紙，微孔板振蕩器上充分混勻，置37℃恒溫箱避光反應(yīng)30min；

取出96孔反應(yīng)板，振蕩30s混勻后置于磁板上靜置60s，甩掉反應(yīng)液后各孔分別加入200μL/孔的洗液，重懸30s后置于磁板上靜置60s，甩掉洗液，重復(fù)洗滌3次，以除去反應(yīng)殘留物。

步驟2

在步驟1處理后的96孔反應(yīng)板的各孔分別加入50μL/孔的弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgM抗體檢測試劑盒中的藻紅蛋白標(biāo)記的抗人IgM抗體溶液，加蓋封板紙，微孔板振蕩器上充分混勻，置37℃恒溫箱避光反應(yīng)30min；

取出96孔反應(yīng)板，振蕩30s混勻后置于磁板上靜置60s，甩掉反應(yīng)液后各孔分別加入200μL/孔洗液，重懸30s后置于磁板上靜置60s，甩掉洗液，重復(fù)洗滌3次，以去除反應(yīng)殘留物。

步驟3

在步驟2處理后的96孔反應(yīng)板的各孔分別加入150μL/孔的弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒1型/2型IgM抗體檢測試劑盒中的磁性微球重懸液，充分振蕩，使磁性微球懸??；將96孔反應(yīng)板在多功能流式分析儀上測試。

測試結(jié)果如表4所示。

表4實(shí)施例2測定結(jié)果

用透景公司軟件對實(shí)施例1以及實(shí)施例2的測定結(jié)果進(jìn)行定性分析，其中，結(jié)果≥1為陽性，＜1為陰性。

ToRCHIgG 5項(xiàng)檢測6位受檢者，參照品測試結(jié)果分別為Tox-IgG 0/6、Rub-IgG 3/6、CMV-IgG 0/6、HSV1-IgG 6/6、HSV2-IgG 1/6，測定樣本測定結(jié)果分別為Tox-IgG 0/6、Rub-IgG 3/6、CMV-IgG 0/6、HSV1-IgG 6/6、HSV2-IgG 1/6，血清與DBS指尖全血結(jié)果陽性符合率為100％。

ToRCH IgM5項(xiàng)檢測6位受檢者，參照品測定結(jié)果分別為Tox-IgM 0/6、Rub-IgM 0/6、CMV-IgM 0/6、HSV1-IgM 0/6、HSV2-IgM 0/6，測定樣本測定結(jié)果分別為Tox-IgM 0/6、Rub-IgM 0/6、CMV-IgM 0/6、HSV1-IgM 0/6、HSV2-IgM 0/6，血清與DBS指尖全血結(jié)果陽性符合率為100％。

請參閱圖1和圖2所示，以參照品測定結(jié)果為x坐標(biāo)，測定樣本測定結(jié)果為縱坐標(biāo)進(jìn)行擬合，ToRCH IgG得擬合曲線y＝1.0278x+0.0111，R²＝0.987，ToRCH IgM得擬合曲線y＝0.8649x-0.0139，R²＝0.9203，相關(guān)性非常好。說明本發(fā)明方法與參照品的測定結(jié)果與靜脈血清測定結(jié)果相同，本發(fā)明方法可以完全替代靜脈血清樣品進(jìn)行ToRCH10項(xiàng)抗體檢測，減少了樣品需要量。另外，濾紙干血斑樣品更易保存和運(yùn)輸，降低了ToRCH10項(xiàng)抗體檢測成本。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。