本發(fā)明屬于分析化學中熒光傳感技術領域，具體涉及一種溶酶體定位熒光探針、制備方法及在近紅外比率檢測肼中的應用。

背景技術：

水合肼可以作為火箭的推進系統(tǒng)高能量推進劑，同時水合肼具有較強還原性及堿性使得水合肼在工業(yè)領域也有很好的應用，如在金屬防腐、在合成不同種類的聚合物中用作其共同的前驅體、作為紡織染料以及藥物制備的中間體等。而同時，水合肼具有很強的毒性，當人體吸入或皮膚接觸到水合肼時將會對人體造成很大的傷害。水合肼是一種神經毒素并且具有很強的誘變效應，對肝、肺、腎以及人體的中樞神經系統(tǒng)造成嚴重的傷害。美國環(huán)境環(huán)境保護協(xié)會把水合肼定義為潛在的人類致癌物質并建議把其檢出限閾值規(guī)定低至10ppb。因此具有高靈敏度高選擇性有效的檢測水合肼的分析方法就顯得尤為重要。

傳統(tǒng)檢測水合肼的分析方法較多，如：電量分析法、電位分析法、滴定法、比色法等等。相關專利文獻包括西北大學鄭建斌、董燕、盛慶林的專利“一種用于水合肼檢測的電化學傳感器及其應用”，專利授權公告號cn104181212b和大連理工大學劉鳳玉、孫世國、李偉、李福勝的專利“一種三聯(lián)吡啶釕電化學發(fā)光檢測水合肼的方法”，專利授權公告號cn101975774b。但這些傳統(tǒng)方法操作起來比較復雜，費時并且需要特殊的儀器設備。

另外，熒光探針因其自身的高靈敏度、高選擇性、便捷、經濟、實時檢測、無破壞性以及高的生物相容性等特點使得熒光探針分析方法得到了越來越廣泛的關注。目前檢測肼的熒光探針能夠實現近紅外比率熒光檢測的還很少，特別是實現細胞定位的熒光探針更少。由于近紅外(＞650nm)的熒光探針對生物組織較低的光損傷、較深的組織穿透能力、較低的生物背景干擾等特點，因而其被廣泛用于生物檢測。而比率熒光探針同時檢測兩個不同波長的熒光強度，可以通過建立內標克服單純一個波長熒光變化引起的多種因素干擾。細胞定位是對生物熒光成像提高信噪比、準確示蹤的更高的要求。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供一種選擇性好、靈敏度高溶酶體定位熒光探針在近紅外比率檢測肼中的應用。

為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是，一種溶酶體定位熒光探針，該探針的化學結構式如下：

所述的探針的制備方法包括以下步驟：將化合物3和化合物2溶解在乙醇中，加熱回流，將反應溶液冷卻至室溫后過濾，濾餅用乙醚洗滌。

所述化合物3的結構為化合物2的結構為

優(yōu)選的，所述化合物3的合成方法如下：將3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2h-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮與seo2溶解在1，4-二氧六環(huán)中，回流7小時，減壓蒸餾，過柱分離提純即得化合物3。

優(yōu)選的，所述3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2h-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮的合成方法如下：氬氣保護下，將2-亞硝基-5-吡咯烷-1-苯酚和水合肼加入到乙醇中，將混合物加熱，然后加入pd-c催化劑，回流直至溶液的紅色消失，然后加入丙酮酸乙酯，將反應溶液加熱回流，通過真空蒸餾得到的粗產物，將粗產物過柱分離提純即得3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2h-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮，3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2h-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮的結構式如下：

優(yōu)選的，所述2-亞硝基-5-吡咯烷-1-苯酚的合成方法如下：將3-吡咯烷基-1-苯酚溶解在濃鹽酸和水混合溶劑中，將亞硝酸鈉的水溶液加入到低于5℃的上述溶液中，反應并過濾，固體用飽和醋酸鈉溶液洗滌三次即得2-亞硝基-5-吡咯烷-1-苯酚，2-亞硝基-5-吡咯烷-1-苯酚的結構式如下：

優(yōu)選的，所述3-吡咯烷基-1-苯酚的合成方法如下：將3-氨基苯酚、碳酸鉀和1，4-二溴丁烷溶解于dmf中，加熱至80℃，反應2小時，冷卻至室溫，過柱分離提純即得3-吡咯烷基-1-苯酚，3-吡咯烷基-1-苯酚的結構式如下：

所述化合物2的合成方法如下：取4-羧基苯肼鹽酸鹽和氫氧化鈉，加入乙醇超聲，室溫條件下攪拌，溶解30min，隨后將乙醇旋轉蒸出，將剩余的固體轉移至三口瓶中，加入冰乙酸溶解，再加入醋酸鈉，超聲溶解，最后加入3-甲基-2-丁酮，加熱至100℃，回流反應16h，冷卻至室溫，減壓蒸餾，旋轉蒸出冰乙酸，用冰水冷卻至0℃，慢慢加入飽和的碳酸鈉溶液，直至沒氣泡產生為止，用鹽酸調節(jié)ph＝4，用二氯甲烷萃取三次，收集油相，用無水硫酸鈉干燥，抽濾，再旋轉蒸出二氯甲烷，得紅色油狀物2，3，3-三甲基-3h-吲哚-5-羧酸；將2，3，3-三甲基-3h-吲哚-5-羧酸和碘甲烷溶解于乙腈中，混合物加熱回流反應12小時，冷卻至室溫，過濾旋蒸除去溶劑得到化合物2。

本發(fā)明產生的有益效果是：本發(fā)明的熒光探針的合成條件溫和、成本較低，對肼具有良好的檢測效果，熒光變化明顯，檢測靈敏，對肼檢測限達到339nm(3.39×10^-7m)，在70-210μm范圍內可以定量檢測肼，對肼具有很好的選擇性和抗干擾性，在細胞內具有細胞溶酶體定位功能，能夠實現比率熒光成像，在生物化學領域具有實際的應用價值。

附圖說明

圖1為實施例1制備的熒光探針(vwater/vdmso＝6/4，濃度1.0×10^-5m)滴定水合肼水溶液(0-50.0當量)的紫外可見光譜變化圖(反應時間為30分鐘)；

圖2為實施例1制備的熒光探針滴定水合肼水溶液時450nm和650nm處水合肼濃度與紫外可見光譜吸收峰比率的關系圖

圖3為實施例制備的熒光探針(濃度1.0×10^-5min6∶4(v/v)water/dmso)滴定水合肼水溶液(從左到右濃度分別為0m，2×10^-5m，4×10^-5m，6×10^-5m，8×10^-5m，10×10^-5m，15×10^-5m，20×10^-5m，25×10^-5m，30×10^-5m，35×10^-5m，40×10^-5m，45×10^-5m，50×10^-5m)的日光下照片；

圖4為實施例1制備的熒光探針(濃度1.0×10^-5m水與dmso體積比例6∶4)滴定水合肼水溶液(0-50.0當量)的熒光光譜圖(反應時間30分鐘)，(a)激發(fā)波長為470nm，(b)激發(fā)波長為630nm；

圖5為實施例1制備的熒光探針(濃度1.0×10^-5m)滴定水合肼水溶液(0-50.0當量)的i570/i720發(fā)射強度比值的線性關系圖，i570和i720分別表示570nm和720nm處的熒光強度；

圖6為采用實施例1制備的熒光探針(濃度1.0×10^-5m)滴定水合肼水溶液時，720nm處的熒光強度與肼溶液濃度線性關系。

圖7為實施例1制備的熒光探針(濃度為1.0×10^-5m水與dmso體積比例6∶4)在570nm和720nm處熒光強度與加入不同濃度的肼(濃度分別為1.0×10^-5m，5.0×10^-5m，1.0×10^-4m，1.5×10^-4m，2.0×10^-4m，3.0×10^-4m，4.0×10^-4m和5.0×10^-4m)的動力學曲線；(a)激發(fā)波長為470nm，(b)激發(fā)波長為630nm，i570和i720分別表示570nm和720nm處的熒光強度；

圖8為實施例1制備的探針的溶液(濃度為1.0×10^-5m，水與dmso體積比例6∶4)加入不同的生物分子(濃度為熒光探針濃度的50倍當量，分別為gsh，iie，pro，thr，ser，met，glc，his，ala，gly，val，leu，phe，cys，asp，glu，tyr和trp)的柱狀圖(深色柱狀圖)和探針溶液(濃度為1.0×10^-5m)加入肼后再加入不同的生物分子(濃度為熒光探針濃度的50倍當量，分別為gsh，iie，pro，thr，ser，met，glc，his，ala，gly，val，leu，phe，cys，asp，glu，tyr和trp)抗干擾柱狀圖(淺色柱狀圖)，反應時間30分鐘，(a)激發(fā)波長為470nm，(b)的激發(fā)波長為630nm，i570和i720分別表示570nm和720nm處的熒光強度；

圖9為hela細胞的熒光成像結果，(a)hela細胞在加入探針15分鐘(圖像采集通道1：激發(fā)波長為560nm，發(fā)射波長570-620nm(a)；(b)hela細胞在加入溶酶體定位染料(2.0mm)15分鐘(圖像采集通道2：激發(fā)波長為640nm，發(fā)射波長663-738nm；(c)為(a)和(b)的混合圖像；(d)明場圖像；(e)hela細胞區(qū)域強度分布圖；(f)探針分子與溶酶體定位染料在細胞中的強度相關性圖；

圖10為hela細胞在加入探針前(a，b，c，d)和加入探針后(1.0×10^-5m)(e，f，g，h)，以及加入探針分子(1.0×10^-5m)和水合肼后(5.0×10^-4m)(i，j，k，l)的共聚焦顯微鏡成像圖，激發(fā)波長分別為488nm和560nm，圖像采集的通道分別為525±25nm(第一行)和595±25nm(第二行)，比率圖像由第一通道與第二通道的比值(i1/i2，第三行)；

圖11為470nm光激發(fā)下實施例1制備的探針分子(1.0×10^-5m水與dmso體積比例6∶4)的熒光比率變化與肼濃度的關系圖，i570和i720分別表示570nm和720nm處的熒光強度；

圖12為630nm光激發(fā)下實施例1制備的探針分子(1.0×10^-5m水與dmso體積比例6∶4)的720nm處熒光強度與肼濃度的關系圖，i720表示720nm處的熒光強度；

圖13為實施例1制備的探針溶液(濃度為1.0×10^-5m水與dmso體積比例6∶4)加入不同的金屬離子(濃度為探針分子的50當量，柱的顏色為深色)以及探針溶液[1.0×10^-5m水與dmso體積比例6∶4]加入不同金屬離子(濃度為探針分子的50當量)和肼水溶液(在水中濃度為5.0×10^-4m)(柱的顏色為淺色)的熒光響應圖，激發(fā)波長為470nm，反應時間為30分鐘。i570和i720分別表示570nm和720nm處的熒光強度，金屬離子分別為k⁺，ca²⁺，na⁺，mg²⁺，al³⁺，zn²⁺，ni²⁺，hg²⁺，mn²⁺和cd²⁺離子；

圖14為實施例1制備的探針溶液(濃度為1.0×10^-5m水與dmso體積比例6∶4)加入不同的陰離子(濃度為探針分子的50當量，柱的顏色為深色)以及探針溶液[1.0×10^-5m水與dmso體積比例6∶4]加入不同陰離子(濃度為探針分子的50當量)和肼水溶液(在水中濃度為5.0×10^-4m)(柱的顏色為淺色)的熒光響應圖。激發(fā)波長為470nm，反應時間為30分鐘。i570和i720分別表示570nm和720nm處的熒光強度，陰離子分別為clo4^-，so4^2-，no3^-，c2o4^2-，hso3^-，hso4^-，s2o3^2-，sh^-，i^-，n3^-，so3^2-，clo3^-，f^-，br^-和cl^-離子；

圖15為實施例1制備的探針溶液(濃度為1.0×10^-5m水與dmso體積比例6∶4)加入不同的金屬離子(濃度為探針分子的50當量，柱的顏色為深色)以及探針溶液[1.0×10^-5m水與dmso體積比例6∶4]加入不同金屬離子(濃度為探針分子的50當量)和肼水溶液(在水中濃度為5.0×10^-4m)(柱的顏色為淺色)的熒光響應圖，激發(fā)波長為630，反應時間為30分鐘。i720表示720nm處的熒光強度，金屬離子分別為k⁺，ca²⁺，na⁺，mg²⁺，al³⁺，zn²⁺，ni²⁺，hg²⁺，mn²⁺和cd²⁺離子；

圖16為實施例1制備的探針溶液(濃度為1.0×10^-5m水與dmso體積比例6∶4)加入不同的陰離子(濃度為探針分子的50當量，柱的顏色為深色)以及探針溶液[1.0×10^-5m水與dmso體積比例6∶4]加入不同陰離子(濃度為探針分子的50當量)和肼水溶液(在水中濃度為5.0×10^-4m)(柱的顏色為淺色)的熒光響應圖。激發(fā)波長為630nm，反應時間為30分鐘。i720表示720nm處的熒光強度，陰離子分別為clo4^-，so4^2-，no3^-，c2o4^2-，hso3^-，hso4^-，s2o3^2-，sh^-，i^-，n3^-，so3^2-，clo3^-，f^-，br^-和cl^-離子；

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍不限于此。本發(fā)明中除非特別指出，肼水溶液0-50.0當量為：0m，2×10^-5m，4×10^-5m，6×10^-5m，8×10^-5m，10×10^-5m，15×10^-5m，20×10^-5m，25×10^-5m，30×10^-5m，35×10^-5m，40×10^-5m，45×10^-5m，50×10^-5m。

實施例1

本實施例中的熒光探針采用如下合成路線：

1)合成3-吡咯烷基-1-苯酚：

將3-氨基苯酚(1.0913g，10.0mmol)、碳酸鉀(1.5203g，11.0mmol)和1，4-二溴丁烷(1340μl，11.0mmol)溶解于10mldmf中。加熱至80℃，反應2小時，冷卻至室溫。過柱提純(展開劑為乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10)，得到3-吡咯烷基苯酚，產率：58.8％。

表征如下：¹hnmr(400mhz，dmso-d6，tms)：δh7.10(t，1h)，6.19(t，2h)，6.09(s，1h)，4.86(s，1h)，3.28(t，4h)，2.02(t，4h).¹³cnmr(100mhz，dmso-d6)：δc156.55，149.47，130.06，104.81，102.57，98.69，47.71，and25.44。

2)合成2-亞硝基-5-吡咯烷-1-苯酚

將3-吡咯烷基苯酚(324.6毫克，2毫摩爾)溶解在12毫升的濃鹽酸(37wt％)和4ml的水混合溶劑中，將亞硝酸鈉(138毫克，2毫摩爾)的4毫升水溶液加入到低于5℃的上述溶液中，混合物反應1.5小時并過濾。固體用飽和醋酸鈉溶液洗滌三次，獲得呈紅褐色固體最終產物(340毫克，產率：88.4％)。

表征如下：¹hnmr(400mhz，dmso-d6，tms)：δh7.30(d，1h)，6.72(d，1h)，5.91(s，1h)，5.32(s，1h)，3.44(t，4h)，1.92(t，4h).¹³cnmr(100mhz，dmso-d6)：δc173.88，169.19，156.46，134.66，117.30，96.28，49.63，and23.49。

3)合成3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2h-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮：

將2-亞硝基-5-吡咯烷-1-苯酚(720.75毫克，2.5毫摩爾)和1563微升80％的水合肼加入到17毫升乙醇中，將混合物加熱至30-40℃，然后加入41.5毫克pd-c催化劑。將上述混合物回流直至溶液的紅色在氬氣氛消失。加入2.5毫升丙酮酸乙酯，將反應溶液回流4小時。通過真空蒸餾得到的粗產物，并用乙酸乙酯/石油醚(1/20)為洗脫液過柱提純得到終產物，產率為68％。

表征如下：¹hnmr(400mhz，dmso-d6，tms)：δh7.40(d，1h)，6.56(d，1h)，6.37(s，1h)，3.31(t，4h)，1.98(t，4h)，1.26(s，3h).¹³cnmr(100mhz，dmso-d6)：δc149.39，148.96，146.66，129.21，122.24，110.08，97.11，61.96，and48.04。

4)合成7-(吡咯烷-1-)-2h-苯并[b][1，4]噁嗪-3-甲醛：

將3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2h-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮(345.4毫克，1.5毫摩爾)與seo2(204.4毫克，1.8毫摩爾)溶解在12ml1，4-二氧六環(huán)中，回流7小時。減壓蒸餾，過柱分離提純(展開劑為二氯甲烷/乙醇＝500∶1)得到產物(式iii)，產率：84.7％。

表征如下：¹hnmr(400mhz，cdcl3，tms)：δh10.08(s，1h)，7.67(d，1h)，6.68(d，1h)，6.31(s，1h)，3.51(t，4h)，2.15(t，4h).¹³cnmr(100mhz，cdcl3)：δc187.86，153.07，152.64，151.30，134.17，133.42，124.64，112.46，96.96，48.59，and25.33。

5)化合物2的制備：

稱取4-羧基苯肼鹽酸鹽(500mg，2.46mmol)和氫氧化鈉(98.5mg，2.46mmol)于100ml的茄形瓶中，加入適量的乙醇超聲，室溫條件下攪拌，溶解30min，隨后將乙醇旋出，將剩余的固體轉移至100ml三口瓶中，加入16ml冰乙酸溶解，再加入醋酸鈉(405mg，4.94mmol)，超聲溶解，最后加入3-甲基-2-丁酮(397μl，3.7mmol)，加熱至100℃，回流16h，待反應完全后，停止反應，冷卻至室溫，減壓蒸餾，旋出冰乙酸，用冰水冷卻至0℃，慢慢加入飽和的碳酸鈉溶液，直至沒氣泡產生為止，用鹽酸調節(jié)ph＝4，用二氯甲烷萃取三次，收集油相，用無水硫酸鈉干燥，抽濾，再旋出二氯甲烷，得紅色油狀物2，3，3-三甲基-3h-吲哚-5-羧酸(405mg，產率為81％)。

將2，3，3-三甲基-3h-吲哚-5-羧酸(1.0g，4.93mmol)和碘甲烷(700mg，4.93mmol)溶解于10毫升乙腈中?；旌衔锛訜峄亓鞣磻?2小時，冷卻至室溫。過濾旋蒸除去溶劑得到化合物2(0.76g，44.7％)。

化合物2表征如下：¹hnmr(400mhz，dmso-d6，tms)：δh8.38(s，1h)，8.19(d，1h)，8.03(d，21h)，4.00(s，3h)，2.82(s，3h)，1.57(sd，6h).¹³cnmr(100mhz，dmso-d6)：δc199.48，166.95，142.42，141.72，132.04，130.83，124.68，115.85，54.72，35.52，21.96，and15.12。

6)近紅外比率檢測肼的溶酶體定位熒光探針的制備：

將化合物3(209.9毫克，0.64毫摩爾)和化合物2(155.3毫克，0.64毫摩爾)溶解在17毫升乙醇中，加熱至78℃并回流12小時。將反應溶液冷卻至室溫后過濾，濾餅用乙醚洗滌三次，得到為暗綠色固體，產率：76.4％。

表征如下：hrms(ei)m/z：calcdforc26h26n3o4[m-i]，444.1923；found，444.1921.¹hnmr(400mhz，dmso-d6，tms)：δh8.39(s，1h)，8.24(s，1h)，8.19(d，1h)，8.02(d，1h)，7.80(d，1h)，7.66(d，1h)，6.96(d，1h)，6.67(s，1h)，4.04(s，3h)，3.59(t，4h)，2.00(t，4h)，1.79(s，6h).¹³cnmr(100mhz，dmso-d6)：δc166.99，153.39，145.75，143.88，133.14，131.55，131.04，127.48，124.22，115.58，114.86，98.14，52.30，49.49，34.98，26.22，and25.25。

本實施例中制備的熒光探針的應用

熒光探針探針可以在水溶液中通過滴定的方式檢測水合肼，當肼加入后溶液的顏色發(fā)生明顯的變化由藍色變?yōu)闊o色。由圖1-3可以看出，肼的水溶液(濃度0.1m)，通過滴定加入熒光探針(vwater/vdmso＝6/4，濃度1.0×10-5m)的水溶液中，紫外-可見光譜中650nm處的峰減弱消失，450nm出現新的吸收峰。

由圖4-6可以看出熒光探針(濃度1.0×10^-5m)滴定水合肼水溶液(0-50.0當量)的熒光光譜中探針的水溶液的熒光光譜在470nm的光激發(fā)下，570nm處的熒光強度增強，720nm處的熒光強度減弱。在630nm的光激發(fā)下720nm處的熒光強度明顯減弱超過六十倍。由圖7可以看出，探針識別肼在5分鐘內完成響應，2分鐘內有明顯的強度變化。圖8和圖13-圖16可以看出，通過水合肼與不同生物分子gsh，iie，pro，thr，ser，met，glc，his，ala，gly，val，leu，phe，cys，asp，glu，tyr和trp，及陽離子k⁺，ca²⁺，na⁺，mg²⁺，al³⁺，zn²⁺，ni²⁺，hg²⁺，mn²⁺和cd²⁺和陰離子clo4^-，so4^2-，no3^-，c2o4^2-，hso3^-，hso4^-，s2o3^2-，sh^-，i^-，n3^-，so3^2-，clo3^-，f^-，br^-和cl^-的選擇性和抗干擾性實驗表明，探針分子對肼具有很好的選擇性和抗干擾性。圖11和圖12表明探針分子熒光比率和熒光強度在肼的濃度較小(10^-4m)時即有明顯變化。

圖9和圖10可以看出細胞熒光成像實驗表明探針在細胞內具有細胞溶酶體定位的性質，能夠實現比率熒光成像。

本發(fā)明制備的熒光探針對肼具有良好的檢測效果，熒光變化明顯，檢測靈敏，對肼檢測限達到339nm(3.39×10-7m，在70-210μm范圍內可以定量檢測肼，選擇性強，抗干擾性好；在細胞內具有細胞溶酶體定位功能，能夠實現比率熒光成像，在生物化學領域具有實際的應用價值。