一種絲氨酸129位磷酸化alpha-突觸核蛋白聚集體的ELISA檢測方法技術領域本發(fā)明涉及聚集化的絲氨酸129位磷酸化alpha-突觸核蛋白(α-syn)檢測方法的建立。

背景技術：
帕金森病(Parkinson’sDisease,PD)作為最常見的神經(jīng)退行性疾病之一，分別影響65歲和85歲年齡中1％和5％的人口，alpha-突觸核蛋白(α-syn)作為2014年新修訂的對PD定義的核心蛋白，已引起人們高度重視α-syn在PD早期診斷、病程和藥物療效檢測中的實際應用。因此，現(xiàn)在急需一種或多種靈敏且特異的檢測方法，檢測各種形式的α-syn隨著PD的發(fā)生發(fā)展在人體液中的變化趨勢，這就要求這種檢測方法要客觀、可行，并易于在臨床上得以推廣。路易體(Lewy’sBody,LB)作為PD主要的病理標志物，其主要成分由α-syn組成，而在LB中有90％的α-syn在129位發(fā)生了磷酸化(pS129-α-syn)。為了研究PD病程的進展，人們利用了多種方法監(jiān)測α-syn在體內(nèi)的變化趨勢，縱觀近幾年的檢測α-syn的文獻，報道PD患者體液中的α-syn含量不盡相同，但是磷酸化α-syn和α-syn聚集體的含量增加是基本一致的報道。在上述有意義的研究報道中，檢測的磷酸化α-syn是單體形式和α-syn的聚集體形式，而沒有明確聚集體中α-syn是磷酸化形式還是非磷酸化形式，更沒有檢測聚集狀態(tài)的磷酸化α-syn，因為目前尚沒有檢測聚集化pS129-α-syn的方法。而聚集的磷酸化α-syn在PD發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮更關鍵的作用。而且有文獻報道，活性醛類——包括ONE(4-oxo-2-nonenal),HNE(4-hydroxynonenal)——在PD患者的腦脊液中的含量隨疾病進展而不斷升高，它們作為脂質過氧化的產(chǎn)物，可以與α-syn的第50位組氨酸發(fā)生加合(如下)。而促使α-syn更易發(fā)生聚集?？紤]到建立標準曲線所需使用的標準抗原的單一性，本專利使用HNE的氧化副產(chǎn)物(OxidativeCounterpart)ONE促進人源α-syn和pS129-α-syn發(fā)生聚集，建立基于夾心法ELISA的檢測方法，以便將來觀察臨床腦脊液、血漿、大腦勻漿中聚集化的pS129-α-syn隨病程的變化趨勢。HNE和蛋白質的組氨酸通過1,4-Michael加合對蛋白進行翻譯后修飾因此，我們發(fā)明的聚集化絲氨酸129位磷酸化α-突觸核蛋白的檢測方法具有重要意義。為臨床PD的血液及腦脊液樣品及基礎研究的PD模型的聚集化絲氨酸129位磷酸化α-突觸核蛋白的檢測提供了檢測手段，也有可能通過此方法建立PD的診斷試劑盒。ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。加入酶標記的抗原或抗體，通過反應也結合在固相載體上。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質的量直接相關，根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法,操作步驟如下:1)將特異性抗體與固相載體聯(lián)結,形成固相抗體，洗滌除去未結合的抗體及雜質，2)加受檢標本,保溫反應，標本中的抗原與固相抗體結合,形成固相抗原抗體復合物，洗滌除去其他未結合物質，3)加酶標抗體,保溫反應，固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合，徹底洗滌未結合的酶標抗體，此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關，4)加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物，通過比色,測知標本中抗原的量，這種雙位點夾心法具有很高的特異性。在臨床檢驗中,雙抗體夾心法法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清,包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體,一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶結合物。本專利提供了可以用于ELISA實驗的特異性捕獲α-syn的N段蛋白(氨基酸1-60)的兔多克隆抗體-SN16和特異性檢測pS129-α-syn的小鼠單克隆抗體C140S，并探索出抗體用于檢測的最適濃度，分別為1ug/ml的SN16捕獲抗原，0.02ug/ml的C140S檢測目的抗原。本專利首次明確提出用于檢測聚集化pS129-α-syn的雙抗體夾心ELISA，驗證檢測抗體C140S的反應性標準，即純化為干粉狀態(tài)的C140S抗體在配制為4mg/ml濃度的蛋白溶液后，對于1000ng/ml的陽性抗原OP(oligomerized129-serinephosphorylatedhumanalpha-synuclein,聚集化的129位絲氨酸磷酸化的人源alpha型突觸核蛋白)和陰性抗原OW(Oligomerizedwild-typehumanalpha-synuclein,聚集化的野生型人源alpha型突觸核蛋白)，使用0.125ug/ml的C140S，和1:10000稀釋的m-HRP做間接法ELISA時，在背景信號和陰性對照組490nm波長吸光光度值信號均小于0.2的情況下，陽性組的490nm波長吸光光度值要達到2.0-2.5之間，該批次純化的C140S抗體方可用于雙抗體夾心ELISA。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種絲氨酸129位磷酸化alpha-突觸核蛋白聚集體的夾心ELISA檢測方法，所述方法包括使用單克隆抗體C140S，和多克隆抗體SN16進行夾心法ELISA，以測定人血液樣本中的絲氨酸129位磷酸化alpha-突觸核蛋白聚集體的含量。本發(fā)明還提供一種細胞株，保藏編號為CGMCC12993。本發(fā)明還提供一種單克隆抗體C140S，由上述細胞株制備得到。本發(fā)明還提供一種用于ELISA方法的捕獲alpha-突觸核蛋白抗原的兔多克隆抗體SN16。本發(fā)明還提供一種抗原，為通過hPLK3激酶催化的絲氨酸129位磷酸化的α-syn標準蛋白。本發(fā)明還提供一種絲氨酸129位磷酸化alpha-突觸核蛋白聚集體的夾心ELISA檢測方法的建立方法，包括如下步驟：1)制備人源α-syn；2)將人源α-syn129位的絲氨酸磷酸化；3)使用ONE將步驟1)中的人源α-syn和步驟2)中129位磷酸化的人源α-syn(pS129-α-syn)聚集化；4)制備可識別人源pS129-α-syn的單克隆抗體C140S；5)制備特異性捕獲α-syn的兔多克隆抗體SN16；6)使用單克隆抗體C140S和兔多克隆抗體SN16做夾心法ELISA；優(yōu)選的，所述的建立方法，包括如下步驟：1)制備人源α-syn，并使用谷胱甘肽瓊脂糖珠-4B純化人源α-syn；2)使用hPLK3催化步驟1)中得到的人源α-syn使其在129位絲氨酸發(fā)生磷酸化；3)使用ONE使步驟1)中的人源α-syn和步驟2)中129位磷酸化的人源α-syn聚集化；4)用斑點印跡實驗篩選可識別人源pS129-α-syn的免疫Balb/c小鼠的腹水C140S,獲得單克隆抗體C140S，使用蛋白G瓊脂糖珠FF親和層析柱純化單克隆抗體C140S；5)制備特異性捕獲α-syn的兔多克隆抗體SN16；6)確定檢測抗體的濃度；7)使用單克隆抗體C140S和特異性捕獲α-syn的兔多克隆抗體SN16做夾心法ELISA。本發(fā)明還提供一種試劑盒，其中包括以下試劑：小鼠源單克隆抗體C140S，和兔源多克隆抗體SN16。本發(fā)明的的試劑盒，還包括以下試劑：磷酸化試劑，和試劑ONE。本發(fā)明的試劑盒，還包括以下試劑：ELISA酶標板，PBS，NaHCO3緩沖液，封閉液，PBST等，所述試劑盒，各試劑分別包裝，每個包裝中裝入試劑的量以夠一個樣本使用量為基本量，可以擴大到10個，100個，1000個樣本的使用量。本發(fā)明所述的ELISA檢測方法，需要用到標準曲線來確定有關物質的含量，所述標準曲線的制作方法如下：使用OP建立標準曲線，在各個濃度點使用OW作為陰性對照，顯色方法為AP(堿性磷酸酶)催化pNPP(p-nitrophenylphosphate，p-硝基苯基磷酸鹽，SurModics,貨號PNPS-1000-01)延遲顯色，即從30分鐘為第一次掃描，每隔10分鐘掃描一次選取反應性和靈敏度范圍滿意的時間點用作最終的標準曲線的建立。將建立標準曲線使用的各濃度OP和OW的A405(405nm處的吸光度值)輸入到Excel表格中，選中用于建立標準曲線的數(shù)據(jù)，單擊插入菜單，選擇散點圖，在生成的散點圖中，右鍵單擊任一一個數(shù)據(jù)點，在彈出的菜單中選擇“添加趨勢線”，在窗口中選擇趨勢線選項為“線性”，并勾選“顯示公式”和“顯示R平方值”。采用本發(fā)明的ELISA檢測方法，可以得到吸光度數(shù)據(jù)，將得到的吸光度數(shù)據(jù)用上述標準曲線比對，可以計算出樣本中的OP含量，本發(fā)明檢測方法的具體操作見本發(fā)明實施例。以下為本發(fā)明方法中的名稱術語的解釋：樣本為建立標準曲線使用的純蛋白樣本。人源α-syn人源α型突觸核蛋白，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)末梢，現(xiàn)認為此蛋白與維持神經(jīng)元可塑性有關。谷胱甘肽瓊脂糖珠-4B為瓊脂糖珠上包被有谷胱甘肽，在純化大腸桿菌表達GST-α-syn融合蛋白時，利用融合蛋白N端上的GST(谷胱甘肽轉移酶)標簽，與其結合，達到純化的目的，之后再使用人凝血酶將此標簽切除，即得到純化的人源α-syn純蛋白。hPLK3為人源Polo樣激酶家族(Polo-LikeKinaseFamily)中的一個亞型，在體外實驗中顯示，hPLK3可以將全部的人源α-syn催化磷酸化，在本專利中的質譜實驗部分也確認了磷酸化的位點僅發(fā)生在第129位絲氨酸。ONE：4-oxo-2-nonenal,4-氧代壬烯醛人體內(nèi)脂質過氧化(lipidperoxide)產(chǎn)物之一，還包括HNE(4-hydro-2-nonenal,4-羥代壬烯醛)，是HNE的氧化副產(chǎn)物(oxidativecounterpart)。人源α-syn聚集體，英文縮寫OW(OligomerizedWild-Typehα-syn)由ONE對人源α-syn第50位組氨酸翻譯后修飾，形成ONE-蛋白加合物(ONE-proteinadduct)，當人源α-syn收到這種翻譯后修飾后，會更容易形成聚集體，且文獻中HPLC結果顯示，其分子量集中在2000kD。129位磷酸化的人源α-syn(pS129-α-syn)聚集體，英文縮寫OP(Oligomerized129-serine-phosphorylatedhα-syn)由ONE對129位磷酸化的人源α-syn第50位組氨酸翻譯后修飾，形成ONE-蛋白加合物(ONE-proteinadduct)，促進形成聚集體。斑點印跡實驗中使用硝酸纖維素膜(NC膜)，在其上點1μl蛋白樣本，并使用抗體與其反應，用于檢測抗體反應的特異性和靈敏性。免疫Balb/c小鼠Balb/c小鼠是用于生產(chǎn)抗體的最常用的實驗動物品系，將目的肽段免疫這種小鼠，為后期提取脾臟做融合細胞做準備。腹水C140S在初步使用間接法ELISA篩選出抗體的其中一個克隆號，根據(jù)所處孔板的位置命名為C140S，由于是腹水，還沒有純化，因此命名為腹水C140S和純化后的抗體相區(qū)分。蛋白G瓊脂糖珠FF在從腹水C140S和其他克隆號中純化抗體使用的瓊脂糖珠，其上包被有G蛋白，可以結合抗體，從而通過結合、洗柱等流程除去腹水中非抗體的成分，得到純化抗體。為建立本發(fā)明所述的ELISA檢測方法，特制備了一種針對129位磷酸化的人源α-syn的小鼠源單克隆抗體C140S，該單克隆抗體的制備方法如下：使用P1(M18631-1hz-1-1,Ac-CEAYEMP(pS)EGG-NH2,人源129位絲氨酸磷酸化α-syn的123-131肽段)肽段免疫balb-c小鼠，取脾制備融合骨髓瘤細胞系，間接法ELISA篩選出克隆號為C140S的細胞系，使用該細胞系注射入4只balb-c/nu小鼠腹腔，間接法ELISA驗證腹水反應特異性后純化抗體，再次使用間接法ELISA驗證純化的抗體的反應性后(即0.125ug/ml的抗體識別1000ng/ml的陽性組490nm波長吸光光度值高于陰性組至少30倍，且背景和陰性組讀數(shù)小于0.2)，方可用作本方法中的檢測抗體，最終濃度為4mg/ml。(該細胞株已經(jīng)保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCC12993，保藏日期2016年9月14日，分類命名：雜交瘤細胞株，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)。為建立本發(fā)明所述的ELISA檢測方法，特制備一種針對人源α-syn的N端(1-60位氨基酸)的兔源多克隆抗體SN16；該多克隆抗體的制備方法如下：使用α-syn的N端(1-60位氨基酸)肽段免疫2只新西蘭白兔，頸動脈放血收集血清后純化抗體，最終濃度為192ug/ml。由于本發(fā)明效果的優(yōu)越性，本發(fā)明人根據(jù)上述方法制備了一種檢測試劑盒，所述試劑盒包括以下試劑：小鼠源單克隆抗體C140S兔源多克隆抗體SN16本發(fā)明所述試劑盒，必要時還可包括以下試劑：磷酸化試劑(包括hPLK3激酶和催化磷酸化反應的緩沖液)；試劑ONE本發(fā)明所述試劑盒，根據(jù)需要，所述試劑盒還可包括任何一種適合本發(fā)明方法的輔助試劑：如，ELISA酶標板，PBS(磷酸鹽緩沖液)，NaHCO3緩沖液，封閉液，PBST(PBS中加入0.2％的Tween-20)等。本發(fā)明的上述試劑盒的使用是以血漿中重組人α-突觸核蛋白聚合體作為標準蛋白，以該聚集體濃度與吸光度值的關系曲線作為標準曲線，通過測定樣本中的血漿-重組人α-突觸核蛋白聚合體的濃度以及形成率達到診斷帕金森病的目的。本發(fā)明的試劑盒，各試劑分別包裝，優(yōu)選使用包裝管，每個包裝管中裝入試劑的量以夠一個樣本使用量為基本量，可以擴大到10個，100個，1000個樣本的使用量。本發(fā)明的試劑盒的使用是根據(jù)上述檢測血漿中重組人α-突觸核蛋白聚集體的方法進行的，使用時將試劑盒中的試劑根據(jù)需要配制成相應的濃度，按照所述方法測定即可。為研究本發(fā)明，還進行了重復性試驗，精密度試驗，檢測方法的篩選等試驗以確保本發(fā)明的應用性。質譜分析PLK3催化人源α-syn磷酸化位點的特異性2010年MartialK.Mbefo等人使用同位素標記蛋白質觀察PLK3磷酸化α-syn時發(fā)現(xiàn)，在30℃反應時間達到2.5小時，所有的α-syn均發(fā)生了磷酸化，本專利使用這一方法將制備的人源Pα-syn做質譜分析發(fā)現(xiàn)，PLK3使α-syn僅在129位絲氨酸發(fā)生了磷酸化(圖3)，而S87位和Y125位均沒有發(fā)生磷酸化(圖4)，證實PLK3對于α-syn的磷酸化位點具有特異性。本發(fā)明的靈敏度實驗：制備C140S抗體使用的免疫肽段：P1(M18631-1hz-1-1,Ac-CEAYEMP(pS)EGG-NH2，人源129位絲氨酸磷酸化α-syn的123-131肽段)對照包括：P2(M18631-1hz-2-1,Ac-EMP(pS)EEGYQDC-NH2，人源129位絲氨酸磷酸化α-syn的126-135肽段)，W(Z18631-1hz-3-1,Ac-CEAYEMPSEEGYQD-NH2，人源α-syn的123-135肽段)，ASWT(hα-syn-FL，F(xiàn)L代表全長)，SE(hα-syn/S129E，為模擬磷酸化突變體)實驗結果如下表：抗體名稱體積(ml)理論靈敏度(ng)實際稀釋比例使用體積(μl)C140S0.10.011:50010顯示C140S抗體可以特異性識別100ng的P1肽段(圖1)。間接法ELISA(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，酶聯(lián)免疫吸附測定)篩選抗體識別磷酸化位點特異性α-syn在S87,Y125,S129位點是三個磷酸化翻譯后修飾位點，C140S抗體僅可以識別S129位磷酸化的肽段，對于S87、Y125磷酸化的肽段和野生型肽段均不識別(圖2)。使用的抗原列表：編碼全稱序列濃度檢測抗體P①P1CEAYEMP(pS)EEG4mg/mlC140S&C54SP②P2EMP(pS)EEGYQDC4mg/mlC48SS22667-1-1KTVEGAGS(p)IAAATG8mg/mlY22667-1-2VDPDNEAY(p)EMPSEE8mg/mlWZ18631-1hz-3-1CEAYEMPSEEGYQD4mg/ml本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明使用捕獲抗體SN16和檢測抗體C140S，可以特異性檢測出聚集體形式的129位絲氨酸磷酸化的人源α-syn，而不識別其單體形式，亦不識別野生型α-syn單體和聚集體；識別的信號顯著高于非磷酸化的聚集體、磷酸化單體、野生syn單體。本發(fā)明可以自行調(diào)整pNPP的顯色時間，以控制背景，并得到檢測所需的靈敏度范圍，對于聚集體形式的129位絲氨酸磷酸化的人源α-syn，最大靈敏度可達10ng/ml。附圖說明圖1是Dotblot結果提示1:500稀釋的C140S腹水對于P1肽段的靈敏度為100ng，對于P2肽段、野生型肽段W、野生型α-syn蛋白全長(ASWT)、α-syn-S129E突變體(SE)則沒有反應性。圖2表示C140S，C48S，C54S為Dot-Blot篩選出的功能相同的三株抗體，間接法ELISA提示三株抗體對于免疫肽段P均有反應性，對于87位磷酸化肽段(S)、125位磷酸化肽段(Y)、野生型肽段(W)則沒有反應性，間接法ELISA結果中使用的3D5抗體為宣武醫(yī)院于順教授制備的小鼠單克隆抗hα-syn115-121抗體，WAKO為日本制造的小鼠單克隆抗129位磷酸化hα-syn抗體(pSyn#64)，CWRA為本室制造的兔源多克隆抗hα-syn-FL抗體，結果提示后三者對于四種肽段均無反應性。圖3顯示Glu-C切割的肽段之一α-syn124-131質譜顯示129位絲氨酸發(fā)生了磷酸化，而125位酪氨酸沒有發(fā)生磷酸化。圖4顯示Trypsin切割的肽段之一α-syn84-104質譜顯示87位絲氨酸未發(fā)生磷酸化。圖5是在間接法實驗中，C140S腹水對于129位磷酸化α-syn全長蛋白的反應性和WAKO抗體沒有顯著性差異，且反應性顯著高于C48S和C54S腹水，3D5抗體對于野生型α-syn全長(W)、S129E(模擬磷酸化α-syn蛋白突變體，E)、S129A(阻斷磷酸化α-syn蛋白突變體，A)均有反應性，且無顯著性差異，3A5抗體為本室前期自制小鼠源單克隆抗磷酸化α-syn抗體，在ELISA中可特異性識別129位模擬磷酸化α-syn蛋白突變體(E)。圖6在同一張PVDF膜(polyvinylidenedifluoride，聚偏二氟乙烯)先后孵育兩種抗體觀察，左側C140S抗體僅識別17kD的129位磷酸化hα-syn(P)，洗膜后孵育BD抗體可見129位磷酸化hα-syn(P)和野生型hα-syn(W)上樣量一致。圖7為間接法ELISA篩選出符合應用標準的純化抗體批次。圖8使用Santa的多克隆抗磷酸化α-syn抗體(SantaCruz,sc-135638)為捕獲抗體，生物素化3D5單克隆抗人α-syn115-121為檢測抗體，發(fā)現(xiàn)不識別磷酸化(P)和野生型α-syn單體(W)，以及α-syn聚集體(OW)，僅識別聚集化Pα-syn(OP)。圖9為本室自制SN16為多克隆抗人α-syn-N端抗體做捕獲抗體，C140S抗體做檢測抗體，發(fā)現(xiàn)不識別磷酸化(P)和野生型α-syn單體(W)，以及α-syn聚集體(OW)，僅識別聚集化Pα-syn(OP)。圖10為使用SN16/C140S抗體建立OP的標準曲線，抗原濃度包括64000，32000，16000，8000，4000，2000，1000，500pg/ml的OP和OW的A405讀數(shù)，AP-pNPP顯色時間60分鐘。圖11為間接法ELISA驗證SN16抗體的對于α-syn的N端可以特異性識別。具體實施方式以下通過實施例進一步說明本發(fā)明。實施例1α-syn的表達和純化：實驗材料：質粒：pGEX-4T-1-hαsyn-WT(4969bp+423bp)AMP(Ampicillin,氨芐霉素)抗性，表達GST-hαsyn-WT融合蛋白，分子量26kD+16kD；...