本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)組織化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種植物組織的顯示方法，具體涉及一種快速顯示橡膠樹(shù)樹(shù)皮乳管的組織化學(xué)方法。

背景技術(shù)：

橡膠樹(shù)的乳管有兩類：由初生分生生組織分化形成的初生乳管和由維管形成層分化形成的次生乳管。初生乳管分布在橡膠樹(shù)葉、花、果實(shí)、種子和根、莖的初生結(jié)構(gòu)中。次生乳管分布在次生韌皮部中。與天然橡膠生產(chǎn)直接相關(guān)的乳管是分布在樹(shù)干樹(shù)皮中的次生乳管。有證據(jù)表明，樹(shù)干樹(shù)皮中的次生乳管數(shù)量與天然橡膠產(chǎn)量高度正相關(guān)(Hao B Z,Wu J L.Biology oflaticifers in Hevea and latex production.Chinese J Trop Crops,2004,25(4):1-7)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，次生乳管數(shù)量多少取決于維管形成層分化乳管的能力。然而，由于次生乳管發(fā)育的階段性和器官特異性，在橡膠樹(shù)新生萌條中沒(méi)有次生乳管，而且次生乳管數(shù)目的差異在1-3齡幼樹(shù)上還不能表現(xiàn)出來(lái)(周鐘毓，國(guó)外巴西橡膠樹(shù)產(chǎn)量早期預(yù)測(cè)方法研究概況，《熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)》，1993年，第2期，第77-83頁(yè))。

目前，顯示橡膠樹(shù)乳管的方法基于史自強(qiáng)和胡正海報(bào)道的方法(Shi ZQ,Hu ZH,Ahistological method forrubber-bearing tissues ofplants,《Act Bot Sin》,1965,13,179-182)，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)是用碘和溴的冰醋酸溶液處理含膠組織，經(jīng)石蠟切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。該方法應(yīng)用于顯示橡膠樹(shù)樹(shù)皮中的乳管時(shí)，有幾個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行了改進(jìn)(Hao B Z,Wu J L.Biology oflaticifers inHevea and latexproduction.《Chinese JTrop Crops》,2004,25(4):1-7)。具體包括：1)固定液用80％的乙醇代替FAA固定液，目的是溶解單寧類物質(zhì)，避免把含單寧的薄壁細(xì)胞誤認(rèn)為乳管細(xì)胞；2)含膠組織置于碘和溴的冰醋酸溶液中，在60-65℃條件下處理36-48小時(shí)，可以加深橡膠顏色，容易分辨乳管細(xì)胞；3)在組織透明環(huán)節(jié)，使用毒性較小的正丁醇或叔丁醇代替毒性較大的二甲苯。

在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了一種苗期預(yù)測(cè)橡膠樹(shù)乳管分化能力的方法(中國(guó)發(fā)明專利ZL200810003352.7)。這種方法通過(guò)機(jī)械傷害一年生萌條的第1伸長(zhǎng)單位著生鱗片葉的莖得以實(shí)現(xiàn)，從而能夠很好地在苗期預(yù)測(cè)亞馬遜野生種質(zhì)和魏克漢種質(zhì)的次生乳管分化能力。但是，這種顯示乳管的方法存在兩個(gè)主要缺點(diǎn)：1)步驟繁多，費(fèi)時(shí)，容易弄錯(cuò)標(biāo)簽，切片質(zhì)量不容易重復(fù)。該方法的操作流程有40多個(gè)步驟，從材料固定到切片觀察需要7-10天，而且在材料比較多的時(shí)候，容易弄錯(cuò)標(biāo)簽。此外，由于步驟多，如果操作不熟練，切片質(zhì)量不容易重復(fù)；2)使用的揮發(fā)性有毒的試劑較多。除酒精外，還需要腐蝕性的溴和冰醋酸、具有一定毒性的正丁醇和二甲苯。此外，多個(gè)步驟在高溫下操作，存在安全隱患。

針對(duì)上述多種缺陷，迫切需要建立一種快捷而安全的顯示樹(shù)皮乳管的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種快速顯示橡膠樹(shù)樹(shù)皮乳管的組織化學(xué)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下快速顯示橡膠樹(shù)樹(shù)皮乳管的組織方法，包括如下步驟：

a)將橡膠樹(shù)樹(shù)皮修切成長(zhǎng)0.5cm×寬0.5cm的切片組織塊，置于盛有固定液的離心管中；

b)打開(kāi)離心管蓋子，放入連接真空泵的玻璃干燥器中，抽氣1-2min；

c)換新鮮的固定液，在室溫條件下固定4-6h后，用緩沖液浸洗3次，每次30min；

d)將步驟c)中的材料從固定液過(guò)渡到不同濃度梯度的保護(hù)劑中；

e)將步驟d)中最高濃度保護(hù)劑中的材料，用OCT包埋劑中包埋，置于-20℃冷凍臺(tái)，冷凝20min；

f)取出步驟e)中的材料，按常規(guī)冰凍切片方法進(jìn)行切片；

g)用室溫的普通載玻片粘取切片；

h)用封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

步驟a)中，所述橡膠樹(shù)樹(shù)皮指用單面刀片從橡膠樹(shù)萌條上縱向切割的帶有部分木質(zhì)部的樹(shù)皮；所述切片組織塊的兩端平切。橡膠樹(shù)幼樹(shù)樹(shù)皮的取皮方法如圖1所示。

步驟b)中，所述固定液選自包含多聚甲醛和戊二醛的溶液。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述固定液是4wt％多聚甲醛和2.5wt％戊二醛的0.01M的pH 7.2磷酸緩沖液。所述離心管為普通帶蓋子的塑料或玻璃離心管；離心管規(guī)格是1.5-10mL的試管。有利地，所述固定液的體積為離心管規(guī)格的二分之一至三分之二。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，離心管規(guī)格是5mL的離心管；所述固定液的體積為3mL。

步驟c)中，所述緩沖液具體為0.01M的pH 7.2磷酸緩沖液。

步驟d)中，所述保護(hù)劑為蔗糖水溶液。進(jìn)一步地，所述不同濃度梯度的保護(hù)劑選自2wt％蔗糖水溶液、6wt％蔗糖水溶液、10wt％蔗糖水溶液、12wt％蔗糖水溶液、14wt％蔗糖水溶液、16wt％蔗糖水溶液和20wt％蔗糖水溶液的任意三種或三種以上。優(yōu)選地，所述不同濃度梯度的保護(hù)劑選自2wt％蔗糖水溶液、6wt％蔗糖水溶液、10wt％蔗糖水溶液、12wt％蔗糖水溶液、14wt％蔗糖水溶液和16wt％蔗糖水溶液的任意三種或三種以上。例如，所述不同濃度梯度包含的濃度數(shù)量可以是3個(gè),例如2wt％、6wt％和12wt％；濃度數(shù)量也可以是4個(gè)，6wt％、10wt％、12wt％和14wt％。

步驟e)中，所述高濃度保護(hù)劑為12wt％、14wt％、16wt％和20wt％的蔗糖水溶液；所述冷凍臺(tái)溫度為-18至-22℃；所述冷凝時(shí)間為15-30min。

步驟h)中，所述封片劑為甘油為5wt％甘油水溶液。

在本發(fā)明中，所述橡膠樹(shù)為1-3年生的幼樹(shù)。

在本發(fā)明中，在熒光顯微鏡的白光下觀察，乳管中的物質(zhì)棕褐色；在熒光顯微鏡的488nm藍(lán)光激發(fā)下，乳管中的物質(zhì)呈綠色。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下列有益的技術(shù)效果：第一，操作簡(jiǎn)單，節(jié)省時(shí)間。最多兩天完成實(shí)驗(yàn)流程，時(shí)間主要花在固定和保護(hù)這兩個(gè)環(huán)節(jié)。由于環(huán)節(jié)少，操作簡(jiǎn)單，切片的質(zhì)量重復(fù)性好，而且不容易弄錯(cuò)標(biāo)簽。第二，在整個(gè)方法中不使用揮發(fā)性有毒的試劑，同時(shí)所有步驟在室溫和低溫下操作，不存在安全隱患。第三，具有取材方便、省工省地、重復(fù)性和通用性好以及批量篩選的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是橡膠樹(shù)幼樹(shù)樹(shù)皮取皮示意圖(其中，外側(cè)區(qū)域示樹(shù)皮，內(nèi)部區(qū)域示木質(zhì)部。用單面刀片取幼樹(shù)樹(shù)皮材料，包括樹(shù)皮、形成層和部分木質(zhì)部；虛線處示修切樹(shù)皮材料的部位；右圖示修切樹(shù)皮的立體示意圖)；

圖2是一年生幼樹(shù)樹(shù)皮的初生乳管的樹(shù)皮橫切面圖(其中，A為10倍物鏡明場(chǎng)條件下樹(shù)皮橫切面圖，B為10倍物鏡熒光條件下樹(shù)皮橫切面圖。三角形示表皮，五角星示厚壁組織，箭頭示初生乳管；V：導(dǎo)管，Ca：維管形成層，St：篩管，標(biāo)尺：100μm，切片厚度：14μm，物鏡倍數(shù)為10倍)；

圖3是一年生幼樹(shù)樹(shù)皮在機(jī)械傷害處理后的初生乳管和次生乳管的5倍物鏡明場(chǎng)條件下樹(shù)皮橫切面圖(其中，五角星示厚壁組織；由上至下，第一排箭頭示木栓層，第二排箭頭示初生乳管，第三排箭頭示次生乳管；V：導(dǎo)管，Ca：維管形成層，St：篩管，標(biāo)尺：100μm，切片厚度：12μm，物鏡倍數(shù)為5倍)；

圖4是一年生幼樹(shù)樹(shù)皮在茉莉酸處理后的初生乳管和次生乳管的樹(shù)皮橫切面圖(其中，A為10倍物鏡明場(chǎng)條件下樹(shù)皮橫切面圖，B為10倍物鏡熒光條件下樹(shù)皮橫切面圖。五角星示厚壁組織；由上至下，第一排箭頭示木栓層，第二排箭頭示初生乳管，第三排箭頭示次生乳管，V：導(dǎo)管，Ca：維管形成層，St：篩管，標(biāo)尺：100μm，切片厚度：12μm，物鏡倍數(shù)為10倍)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。

實(shí)施例1、一年生幼樹(shù)自然狀態(tài)下樹(shù)皮的初生乳管組織化學(xué)顯示

本實(shí)施例，采用橡膠樹(shù)品種CATAS7-33-97的自然狀態(tài)下幼樹(shù)樹(shù)皮進(jìn)行樹(shù)皮初生乳管組織化學(xué)顯示。

1、實(shí)驗(yàn)條件：將橡膠樹(shù)品種CATAS7-33-97穩(wěn)定期新稍的幼樹(shù)樹(shù)皮修切成長(zhǎng)0.5cm×寬0.5cm的切片組織塊，置于盛有3ml的4wt％多聚甲醛和2.5wt％戊二醛的0.01M磷酸緩沖液(pH 7.2)固定液中，抽氣2min，換新的固定液，在室溫條件下固定5h；用0.01M磷酸緩沖液(pH 7.2)浸洗3次，每次30min；進(jìn)入不同濃度梯度的保護(hù)劑中，保護(hù)劑的蔗糖濃度依次為2wt％-6wt％-10wt％-12wt％-14wt％-16wt％，每級(jí)時(shí)間1h，最終的保護(hù)劑蔗糖濃度為16wt％；使用普通的冰凍切片技術(shù)進(jìn)行切片，切片厚度14μm，常溫載玻片貼片，5wt％甘油水溶液封片；在熒光顯微鏡的下觀察結(jié)果。

2、結(jié)果表明：在顯微鏡的白光下觀察，乳管中的物質(zhì)棕褐色，如圖2A所示；在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)光波長(zhǎng)488nm，乳管中的物質(zhì)呈綠色，如圖2B所示。

實(shí)施例2、一年生幼樹(shù)樹(shù)皮在機(jī)械傷害和茉莉酸處理后的初生乳管和次生乳管組織化學(xué)顯示

本實(shí)施例，采用橡膠樹(shù)品種CATAS7-33-97的機(jī)械傷害和茉莉酸處理7天后幼樹(shù)樹(shù)皮進(jìn)行樹(shù)皮乳管組織化學(xué)顯示。

1、實(shí)驗(yàn)條件：選取橡膠樹(shù)品種CATAS7-33-97穩(wěn)定期新稍的幼樹(shù)，在新稍基部以上約2cm處，刮去表皮及部分皮層(長(zhǎng)1cm×寬1cm)，受傷部位直接暴露在空氣中7d后，切取刮傷處的樹(shù)皮為機(jī)械傷害處理的樹(shù)皮材料；受傷部位涂抹含有3mM茉莉酸甲酯的羊毛脂，再覆蓋黑色塑料薄膜處理7d后，切取刮傷處的樹(shù)皮為茉莉酸處理的樹(shù)皮材料。將機(jī)械傷害和茉莉酸處理的橡膠樹(shù)幼樹(shù)樹(shù)皮修切成長(zhǎng)0.5cm×寬0.5cm的切片組織塊，置于盛有3ml的4wt％多聚甲醛和2.5wt％戊二醛的0.01M磷酸緩沖液(pH 7.2)固定液中，抽氣2min，換新的固定液，在室溫條件下固定5h；用0.01M磷酸緩沖液(pH 7.2)浸洗3次，每次30min；進(jìn)入不同濃度梯度的保護(hù)劑中，保護(hù)劑的蔗糖濃度依次為2wt％-6wt％-10wt％-12wt％-14wt％-16wt％，每級(jí)時(shí)間1h，最終的保護(hù)劑蔗糖濃度為16wt％；使用普通的冰凍切片技術(shù)進(jìn)行切片，切片厚度12μm，常溫載玻片貼片，5wt％甘油水溶液封片；在熒光顯微鏡的下觀察結(jié)果。

2、結(jié)果表明：在顯微鏡的白光下觀察，乳管中的物質(zhì)棕褐色，如圖3和圖4A所示。在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)光波長(zhǎng)488nm，乳管中的物質(zhì)呈綠色，如圖4B所示。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，多種條件下的實(shí)驗(yàn)證明，使用冰凍切片后的組織化學(xué)顯示能夠鑒定橡膠樹(shù)的乳管，利用本發(fā)明所提供的鑒定方法，很容易鑒定出橡膠樹(shù)幼樹(shù)樹(shù)皮中的初生乳管和次生乳管，而且重復(fù)性好?？梢?jiàn)本發(fā)明所提供的篩選方法能夠快速而有效的對(duì)橡膠幼樹(shù)樹(shù)皮的乳管進(jìn)行鑒定，具有廣闊的應(yīng)用前景。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。