本發(fā)明涉及保健食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種固相萃取-比色法測定西洋參中總皂甙的方法。

背景技術(shù)：

西洋參(Panaxquinquefolium L)，又名美國參、花旗參、洋參，系五加科人參，屬多年生草本植物，味苦，性涼，入心、肺、腎經(jīng)，功能以補(bǔ)益為主，可滋陰降火，益氣生津。隨著人民生活水平的提高，以西洋參為代表的一些具有保健功能的產(chǎn)品層出不群，市場上此類保健食品中多以西洋參根部為原料，經(jīng)粉碎或提取后制成西洋參含片、西洋參茶或西洋參膠囊等，保健功能以總皂甙含量來衡量。其定量分析的研究方法主要包括重量法、比色法、近紅外光譜法、薄層掃描法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)等。重量法分析流程時(shí)間長，操作繁瑣，試劑消耗量大，得到的皂苷中一般混有一定量的雜質(zhì)，誤差較大；近紅外光譜技術(shù)目前雖已廣泛用于藥材研究，但其譜帶較寬，重疊嚴(yán)重，信號(hào)弱，加之儀器噪聲、基線漂移、雜散光等因素，嚴(yán)重限制了其研究的準(zhǔn)確性；HPLC對(duì)設(shè)備要求較高，且HPLC法適合單個(gè)人參皂苷的測定。目前，國內(nèi)大多數(shù)研究均按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范(2003年版)》“保健食品中總皂甙的測定”方法進(jìn)行測定，但有文獻(xiàn)報(bào)道，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測得的分析結(jié)果重現(xiàn)性和可比性較差，有的濃度水平還出現(xiàn)離群值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種固相萃取-比色法測定西洋參中總皂甙的方法，該方法簡便、準(zhǔn)確且穩(wěn)定性、重復(fù)性好，回收率高。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種固相萃取-比色法測定西洋參中總皂甙的方法，步驟如下：

(1)樣品前處理：精密稱取0.5g樣品，置于50mL容量瓶中，按料液比1g:30mL加水溶解，60℃超聲30min，放至室溫，純水定容至50mL，搖勻，放置，作為樣品溶液；

(2)固相萃?。簩?duì)固相萃取柱進(jìn)行活化處理，樣品溶液上活化處理后的固相萃取柱，依次用25mL水、25mL質(zhì)量濃度70％乙醇進(jìn)行洗脫，收集質(zhì)量濃度70％乙醇洗脫液于50mL離心管中，將收集的洗脫液置于蒸發(fā)皿中，60℃下水浴揮干；

(3)比色法測定：在步驟(2)所得已揮干的洗脫液中準(zhǔn)確加入0.2mL 5％香草醛冰乙酸溶液，使殘?jiān)咳芙?，再?.8m L高氯酸，充分混勻后精密吸取0.5mL于10mL具塞離心管中，60℃水浴上加熱15min，冰浴冷卻后，準(zhǔn)確加入冰乙酸5.0mL，搖勻后，以1cm比色皿于560nm波長處測定吸光度；

(4)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算結(jié)果：以人參皂苷Re配置標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL、40μL、60μL、80μL、100μL、200μL，于10mL具塞離心管中，40-50℃熱風(fēng)揮干后，按照步驟(3)的方法在560nm處分別測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，人參皂苷Re質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將步驟(3)測得的樣品吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算獲得樣品中總皂甙的含量。

綜合現(xiàn)有研究的弊端，本發(fā)明通過對(duì)測定總皂苷前處理?xiàng)l件的優(yōu)化，建立一種測定以西洋參為原料的保健食品中總皂甙的方法。整套方法快速簡便、準(zhǔn)確性高、平行性好，且設(shè)備容易購買，可普遍適用于以西洋參為原料的保健食品中總皂苷含量的準(zhǔn)確定量及產(chǎn)品功能性評(píng)價(jià)，同時(shí)也為保健食品評(píng)審和監(jiān)督監(jiān)測提供一定的依據(jù)，增強(qiáng)了國家對(duì)保健食品的監(jiān)督管理力度。

作為優(yōu)選，步驟(2)中所述活化處理為：控制流速在2.5mL/min，用25mL質(zhì)量濃度70％乙醇沖洗后用25mL純水淋洗。

作為優(yōu)選，步驟(2)中所述洗脫速度控制在0.8mL/min。

作為優(yōu)選，步驟(2)中所述固相萃取型號(hào)為：Agela Technologies，CleanertPS/AL，規(guī)格：填料1g，柱體積6mL。

作為優(yōu)選，步驟(2)樣品溶液上活化處理后的固相萃取柱的上樣速度控制在1mL/min。

作為優(yōu)選，步驟(3)中標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法為：精密稱取干燥至恒重的人參皂苷Re 20mg置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

作為優(yōu)選，步驟(3)中標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝5.0546x-0.0126，其中X為人參皂苷Re質(zhì)量，Y為吸光度。

本發(fā)明的有益效果是：方法簡便、準(zhǔn)確且穩(wěn)定性、重復(fù)性好，回收率高，可用于以西洋參為代表的保健食品中總皂苷含量的測定和產(chǎn)品質(zhì)量控制。

附圖說明

圖1是本發(fā)明顯色反應(yīng)穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果圖，*表示P＝0.05時(shí)有顯著性差異，**表示P＝0.05時(shí)有極顯著差異。

圖2是本發(fā)明人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。

本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

實(shí)施例：

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 材料

西洋參膠囊(總皂甙含量2.13g/100g)，市售。

1.1.2 試劑

人參皂甙Re(中國藥品生物制品研究院，含量92.3％)，冰醋酸、高氯酸、乙醇均為分析純，純化水，5％香草醛冰乙酸溶液(稱取0.5g香草醛于10mL容量瓶中，用冰乙酸定容至刻度，現(xiàn)配現(xiàn)用)，70％乙醇溶液。

1.1.3 儀器與設(shè)備

UV-2700紫外分光光度計(jì)：島津公司，日本；FC204電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；CPA2250電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；AS10200ADT超聲波清洗儀：中國科學(xué)院聲學(xué)研究所東海研究站；恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；固相萃取裝置：上海安譜科學(xué)儀器公司；固相萃取柱：Agela Technologies，CleanertPS/AL，1g，6mL，天津；層析管(手工裝填3g XAD-2大孔樹脂，1.5g中性氧化鋁)，上海安譜科學(xué)儀器公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱取干燥至恒重的人參皂苷Re適量(20mg左右)置于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 供試品前處理

精密稱取約0.5g左右樣品，置于50mL容量瓶中，按料液比1g:30mL加水適量溶解，60℃超聲30min，放至室溫，純水定容，搖勻，放置，作為樣品溶液。

1.2.3 固相萃取凈化(固相萃取柱：Agela Technologies，CleanertPS/AL 1g6mL，天津)

1.2.3.1 固相萃取柱活化：控制流速在2.5ml·min^-1左右，用25ml 70％乙醇沖洗后用25ml純水淋洗。

1.2.3.2 上樣：控制流速在1ml·min-1左右，加入樣品溶液。

1.2.3.3 洗脫：控制流速在0.8ml·min-1左右，依次用25ml水，25ml70％乙醇進(jìn)行洗脫，收集70％乙醇洗脫液于50mL離心管中。

1.2.3.4 揮干：將收集的洗脫液置于蒸發(fā)皿中，60℃下水浴揮干。

1.2.4 顯色與測定

在上述已揮干的洗脫液中準(zhǔn)確加入0.2ml 5％香草醛冰乙酸溶液，使殘?jiān)既芙?，再?.8ml高氯酸，充分混勻后精密吸取0.5mL于10mL具塞離心管中，60℃水浴上加熱15min，冰浴冷卻后，準(zhǔn)確加入冰乙酸5.0ml，搖勻后，以1cm比色池于560nm波長處測定。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液20uL、40uL、60uL、80uL、100uL、200uL，于10mL具塞離心管中，40-50℃熱風(fēng)揮干后，照1.2.4項(xiàng)處理，在560nm處分別測定吸光度，以吸光度(OD)為縱坐標(biāo)，人參皂苷Re質(zhì)量(m)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用GraphPad Prism 5.00.288統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理、繪圖，并通過顯著性檢驗(yàn)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 顯色反應(yīng)穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液100uL于10mL具塞離心管中，40-50℃熱風(fēng)揮干后，按照1.2.4項(xiàng)處理，每隔10min測定一次吸光值。我們發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長，反應(yīng)體系在一定時(shí)間內(nèi)呈紫色，且顏色基本保持不變。用GraphPad Prism 5.00.288統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，由圖1可以看出，隨著時(shí)間的變化，其吸光值呈非線性遞減趨勢，根據(jù)顯著性分析結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，樣品在40min內(nèi)其吸光值與10min相比，差異不顯著，而從50min開始有顯著性差異，60min時(shí)存在極顯著差異(p＜0.05)。40min內(nèi)，其吸光值相比10min測定值降低了4.54％，根據(jù)GB/T 5009.51可知，相對(duì)誤差在5％內(nèi)為允許誤差，結(jié)合顯著性分析結(jié)果，表明當(dāng)顯色體系反應(yīng)完全，樣品液在40min內(nèi)其吸光度變化不明顯，穩(wěn)定性較好，上述結(jié)果表明反應(yīng)體系40min內(nèi)吸光值可間接反映保健食品中總皂甙的含量，且穩(wěn)定性好，適用于西洋參中總皂苷含量的測定。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)結(jié)果分析得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝5.0546x-0.0126，r＝0.9996(n＝6)，其中X為人參皂苷質(zhì)量(mg),Y為吸光度(OD),線性范圍為0.015～0.152mg。

2.3 萃取純化方法的選擇

萃取純化主要包括淋洗和洗脫兩步，淋洗要求加入合適的洗脫液以最大可能的除去干擾物而不影響目標(biāo)化合物的保留。而洗脫是打斷吸附劑與被保留化合物之間的作用力，使目標(biāo)化合物從吸附劑中流出。前期文獻(xiàn)報(bào)道采用溶劑萃取法純化樣品中總皂甙，但由于其存在操作繁瑣、分離不完全、純化效果差且石油醚、正丁醇等有機(jī)溶劑對(duì)人體危害較大等缺點(diǎn)而逐漸被淘汰。現(xiàn)在大量研究采用大孔樹脂層析法，其重復(fù)性及回收率不佳等限制了其應(yīng)用。所以本發(fā)明通過重復(fù)性試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)和加標(biāo)回收率試驗(yàn)，將傳統(tǒng)方法(手填層析柱、人工進(jìn)行柱洗脫)和固相萃取法進(jìn)行柱效對(duì)比，進(jìn)而判定兩種柱效對(duì)樣品目的物萃取凈化的優(yōu)劣。

2.4.1 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100uL 6份分別置于蒸發(fā)皿中，60℃水浴揮干后，水溶解殘?jiān)?.2.3-1.2.4項(xiàng)下進(jìn)行處理，測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，100uL時(shí)其理論吸光值為0.375，總皂甙含量的理論值為0.0767mg。傳統(tǒng)方法處理下，其測得量的平均值為理論值的80.98％，其RSD值為6.30％；而固相萃取處理下，其測得量為理論值的97.94％，RSD值為1.16％。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表

2.4.2 精密度試驗(yàn)

精密稱取6份樣品，按1.2.3-1.2.4項(xiàng)下進(jìn)行處理，測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得樣品中含量。由表2可知，傳統(tǒng)方法測得的樣品中總皂甙平均含量為1.70g/100g，占標(biāo)示值的79.75％，其RSD值為16.03％，而采用固相萃取SPE處理后測得的樣品中總皂甙平均含量為2.12g/100g，占標(biāo)示值的99.53％，其RSD值為2.17％。由此可以看出固相萃取SPE法相比傳統(tǒng)方法，在相同洗脫液處理下，能更好的將樣品中可能存在的雜質(zhì)分離，同時(shí)將總皂甙洗脫下來，且每次測定的精密度相比傳統(tǒng)方法較高。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果表

2.4.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

采用加樣回收率法，精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液40uL、80uL、120uL各3份分別置于9個(gè)蒸發(fā)皿中，放水浴揮干，作為加標(biāo)樣。稱取約0.5g樣品9份，按1.2.2項(xiàng)下進(jìn)行樣品預(yù)處理，精密吸取9份樣品溶液各1mL，分別加入上述9個(gè)含有加標(biāo)樣的蒸發(fā)皿中溶解殘?jiān)?，并用水潤洗后進(jìn)行萃取純化，按1.2.3-1.2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行處理測定，計(jì)算回收率(見表3-表4)，可以看出，傳統(tǒng)方法處理下其平均回收率為73.73％，RSD＝13.86％；固相萃取處理下，其平均回收率98.45％，RSD＝2.56％。進(jìn)行比較，表明固相萃取方法在測定總皂甙的提取、純化過程中沒有較大損失，準(zhǔn)確度較高，且離散度低于傳統(tǒng)方法。

表3 傳統(tǒng)方法(手填層析柱、人工進(jìn)行柱洗脫)加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表(n＝9)

表4 固相萃取法加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表(n＝9)

。

3 結(jié)論

本發(fā)明采用超聲提取法對(duì)西洋參膠囊中總皂苷進(jìn)行提取，運(yùn)用固相萃取法萃取凈化樣品中總皂甙，既能使其中油脂、雜質(zhì)糖等與總皂甙得到較好的分離，使目的產(chǎn)物萃取下來，又具有較高的穩(wěn)定性。香草醛-高氯酸-冰乙酸比色法在40min內(nèi)對(duì)總皂甙含量進(jìn)行分析測定，結(jié)果穩(wěn)定性好且精密度高。綜上所述，本發(fā)明的方法，較之傳統(tǒng)方法簡便易行，重現(xiàn)性、回收率高，適用于以西洋參為代表的保健食品中總皂苷含量及品質(zhì)的分析，對(duì)保健食品的質(zhì)量控制具有重要參考意義。

以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。