本發(fā)明屬于醫(yī)療檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測細胞角蛋白19片段的化學發(fā)光免疫試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：肺癌是威脅人類健康的常見惡性腫瘤，其發(fā)病率以每年3％的速度上升。近年來對肺癌的治療雖然取得很大進展，但效果仍不理想，其5年生存率仍在20％～30％，而中晚期癌治療效果更差。研究表明，早期診斷率是提高生存率的關(guān)鍵所在，而目前所用標志物在敏感性、特異性方面還不能達到要求。細胞角蛋白19片段(cyfra21-1)是一分子量為40×103的酸性蛋白質(zhì)，是上皮細胞骨架的一部分，在惡性上皮細胞中，激活的蛋白酶加速了細胞角蛋白的障礙，使得大量細胞角蛋白片段釋放入血，尤其是cyfra21-1在肺癌中含量豐富，其與CEA和NSE聯(lián)合檢測對肺癌的鑒別診斷，病情監(jiān)測有重要價值。Cyfra21-1對乳腺癌，膀胱癌，卵巢癌也是很好的輔助診斷和治療監(jiān)測指標。還應(yīng)與其他有關(guān)的腫瘤標志物聯(lián)合檢測，以同時提高臨床診斷的特異性和靈敏度。對Cyfra21-1的定量分析，目前常用的是放射免疫分析(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必須用I等放射性元素標記，檢測設(shè)備復(fù)雜，必須用專門的儀器測定，其放射性核素的半衰期短，不能長期保存，同時也給實驗操作人員帶來了放射性傷害。ELISA檢測靈敏度不夠高，檢測范圍窄，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性等缺點也不能滿足臨床的要求，因此，化學發(fā)光免疫分析方法(CLIA)應(yīng)運而生。磁性微球作為體外診斷的固相載體，起到識別、捕獲、控制與運輸目標待檢分子的載體作用。由于其在整個反應(yīng)過程中均是懸浮在待檢樣本中，與傳統(tǒng)的多孔板載體相比，其整個反應(yīng)基本處于液態(tài)或準液態(tài)狀態(tài)，載體與待檢物之間發(fā)生分子碰撞的幾率大大增加。另外，由于磁性微球較大的表面積提高了負載目標待檢分子的效率，因而使得其生物反應(yīng)效率較傳統(tǒng)多孔板方式大為提高；一般多孔板上的生物反應(yīng)需要在1～3小時之間，而基于磁性微球的生物反應(yīng)僅需十幾分鐘。另外，由于磁性微球卓越的超順磁特性，使得采用全自動磁性分離方式與檢測可以輕松地實現(xiàn)。專利CN200710121167公開一種細胞角蛋白19片段的化學發(fā)光免疫分析方法，但是其仍然是將相關(guān)抗體固定在傳統(tǒng)的多孔板上進行相關(guān)檢測。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個目的是提供一種細胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)的定量測定試劑盒，其包含的試劑有Cyfra21-1磁分離試劑，酶標記的Cyfra21-1抗體溶液，標準品，洗滌液以及化學發(fā)光底物溶液。所述Cyfra21-1磁分離試劑為含有1mg/ml的偶聯(lián)有抗Cyfra21-1單克隆抗體的磁性微球，0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化銨，0.2mg/ml的卵磷脂，0.1mg/ml的PEG200的50mmol/L的PBS緩沖液，pH值為7.4。所述酶標記的Cyfra21-1抗體溶液是含有1mg/ml辣根過氧化酶標記的抗Cyfra21-1單克隆抗體和1mg/mlBSA的50mmol/L的PBS緩沖液，pH值為7.4。所述標準品為不同濃度的Cyfra21-1標準品溶液，其分別含有0、0.1、0.5、1、2、4、8和16ng/ml的Cyfra21-1標準品的50mmol/lPBS緩沖液，pH7.4。洗滌液由在濃度為20mol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中加入1％的Tween-20配制而成。所述化學發(fā)光底物溶液分為發(fā)光底物A溶液和發(fā)光底物B溶液；發(fā)光底物A為0.1M、pH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為5.0mg/mL的魯米諾，所述發(fā)光底物B為是pH值為4.5的0.1M檸檬酸緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為100mg/mL的過氧化氫和15mg/mL辣根過氧化氫酶。本發(fā)明的另一個目的是提供所述試劑盒的制備方法，具體步驟如下：1)Cyfra21-1磁分離試劑的制備：采用化學交聯(lián)法將Cyfra21-1單克隆抗體和磁性微球偶聯(lián)，磁性微球直徑在1.0μm左右，制備后用PBS緩沖液沖洗三次，然后用1％的BSA溶液封閉3小時，磁性分離微球，用PBS緩沖液沖洗三次，然后用50mmol/L的PBS緩沖液重新懸浮，加入終濃度0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化銨，0.2mg/ml的卵磷脂和0.1mg/ml的PEG200，調(diào)pH值至7.4即得；2)酶標記的Cyfra21-1抗體溶液的制備：采用NaIO4法標記Cyfra21-1單克隆抗體，反應(yīng)后透析純化，然后用20mmol/L的PBS緩沖液溶解，加入終濃度1mg/mlBSA，調(diào)pH值至7.4即得；3)常規(guī)方法配置標準品、洗滌液和化學底物溶液。具體實施方式下面將進一步的來舉例說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要求保護的技術(shù)方案的舉例說明，并非對這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護范圍以所附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準。實施例1試劑盒制備1)Cyfra21-1磁分離試劑的制備：采用0.05mol/L的PBS緩沖液將聚苯乙烯磁性微球懸浮，磁性微球直徑在1.0μm左右，磁性微球的質(zhì)量分數(shù)為2.5％；然后向微球溶液中添加終濃度為1mg/ml的Cyfra21-1單克隆抗體(所述單克隆抗體與下述酶標記用Cyfra21-1單克隆抗體為配對抗體，購自上海領(lǐng)潮生物科技有限公司)，搖勻10分鐘，然后向體系中加入3.5mg/ml碳亞二胺，搖床反應(yīng)20小時，PBS緩沖液清洗三次，磁性分離獲得微球，然后用1％的BSA溶液封閉3小時，磁性分離微球，用PBS緩沖液沖洗三次，磁性分離，然后將偶聯(lián)有抗Cyfra21-1單克隆抗體的磁性微球分散在0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化銨，0.2mg/ml的卵磷脂，0.1mg/ml的PEG200的50mmol/L的PBS緩沖液中，調(diào)pH值為7.4，從而獲得Cyfra21-1磁分離試劑。2)酶標記的Cyfra21-1抗體溶液的制備：采用本領(lǐng)域常規(guī)NaIO4法獲得辣根過氧化物酶標記的Cyfra21-1單克隆抗體，反應(yīng)后透析純化，然后用50mmol/L的PBS緩沖液溶解，加入終濃度1mg/mlBSA，調(diào)pH值至7.4即得；3)常規(guī)方法配置標準品、洗滌液和化學底物溶液。制備后試劑盒組成如下：Cyfra21-1磁分離試劑為含有1mg/ml的偶聯(lián)有抗Cyfra21-1單克隆抗體的磁性微球，0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化銨，0.2mg/ml的卵磷脂，0.1mg/ml的PEG200的50mmol/L的PBS緩沖液，pH值為7.4。酶標記的Cyfra21-1抗體溶液是含有1mg/ml辣根過氧化酶標記的抗Cyfra21-1單克隆抗體和1mg/mlBSA的50mmol/L的PBS緩沖液，pH值為7.4。標準品為不同濃度的Cyfra21-1標準品溶液，其分別含有0、0.1、0.5、1、2、4、8和16ng/ml的Cyfra21-1標準品的50mmol/lPBS緩沖液，pH7.4。洗滌液由在濃度為20mol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中加入1％的Tween-20配制而成。所述化學發(fā)光底物溶液分為發(fā)光底物A溶液和發(fā)光底物B溶液；發(fā)光底物A為0.1M、pH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為5.0mg/mL的魯米諾，所述發(fā)光底物B為是pH值為4.5的0.1M檸檬酸緩沖液，且該緩沖液中含有終濃度為100mg/mL的過氧化氫和15mg/mL辣根過氧化氫酶。實施例2試劑盒檢測方法a.向微孔板分別加入血清樣本和Cyfra21-1標準品，每孔20μl；b.依次向每孔加入酶標記的Cyfra21-1抗體溶液和Cyfra21-1磁分離試劑各50μl，振蕩30s后，置37℃水浴30分鐘。c.采用磁分離器，沉淀2分鐘。緩慢的倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的微孔板連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。d.加200μl洗滌液至每孔中，振蕩混勻30s，磁分離去洗滌液，重復(fù)三次。e.加發(fā)光底物A、B每孔各50μl，充分混勻，立刻加入化學發(fā)光儀中檢測信號值。實施例3Cyfra21-1磁分離試劑的穩(wěn)定性考察采用不同的溶液組成的磁分離試劑，在37℃下以60轉(zhuǎn)/分鐘搖動放置一個月，采用實施例2的方法測定Cyfra21-1標準品(濃度4ng/ml)，其他檢測試劑同實施例1，計算不同放置時間測定的化學信號值與0天時測定的化學信號值的百分比。各組磁分離試劑組成如下：組1：同實施例1組2：Cyfra21-1磁分離試劑為含有1mg/ml的偶聯(lián)有抗Cyfra21-1單克隆抗體的磁性微球，0.2mg/ml的卵磷脂，0.1mg/ml的PEG200的50mmol/L的PBS緩沖液，pH值為7.4。組3：Cyfra21-1磁分離試劑為含有1mg/ml的偶聯(lián)有抗Cyfra21-1單克隆抗體的磁性微球，0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化銨，0.1mg/ml的PEG200的50mmol/L的PBS緩沖液，pH值為7.4。組4：Cyfra21-1磁分離試劑為含有1mg/ml的偶聯(lián)有抗Cyfra21-1單克隆抗體的磁性微球，0.4mg/ml的十八烷基三甲基氯化銨，0.2mg/ml的卵磷脂的50mmol/L的PBS緩沖液，pH值為7.4。具體結(jié)果如下：N＝5組1組2組3組45天99.1％82.4％91.6％89.3％15天98.8％72.7％83.3％78.2％30天98.2％64.1％71.9％68.7％另外，需要說明的是將整個試劑盒置于37℃下保存一個月后，試劑盒性能沒有明顯改變。與0天測定值相比差別<2％。實施例4Cyfra21-1試劑盒性能考察采用實施例1制備的Cyfra21-1檢測試劑盒進行下列測定：1)分別取Cyfra21-1標準品溶液，分別含有0、0.1、0.5、1、2、4、8和16ng/ml的Cyfra21-1標準品；按照實施例2的方法進行測定，以化學發(fā)光值(RLU)為Y軸，以標準品濃度為x軸，繪制標準曲線；結(jié)果表明：本發(fā)明實施例1試劑盒線性良好，線性方程為y＝29821X+945；線性系數(shù)R>0.999。2)對20次零標準品的測定，取其2倍的平均偏差，其在標準曲線上所對應(yīng)的濃度即為分析靈敏度，結(jié)果表明實施例1試劑盒靈敏度為0.03ng/ml實施例5實施例1試劑盒其他性能指標精密性：批內(nèi)變異CV％≤4.3％；批間變異CV％≤4.7％線性系數(shù)：r≥0.9990線性范圍：0.10-16ng/ml特異性：與CEA、AFP、CA199等常規(guī)腫瘤標志物交叉反應(yīng)率低于0.2％。本
發(fā)明內(nèi)容僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個或多個技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案也在本申請保護范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開內(nèi)容中具體記載一樣。當前第1頁1 2 3