本發(fā)明屬于食品檢測(cè)技術(shù)和現(xiàn)代儀器分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及同時(shí)定量檢測(cè)海帶生物轉(zhuǎn)化液中小分子降血壓肽的方法。

背景技術(shù)：

海洋生物是藥物和高附加值食品開(kāi)發(fā)的潛在來(lái)源，特別是海帶等藻類蛋白質(zhì)。藻類蛋白質(zhì)可通過(guò)酶解、水解、發(fā)酵或者腸胃消化等生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，得到具有較高營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值的小分子生物活性肽。目前已有多種活性多肽從藻類蛋白酶解物中鑒別和分離出來(lái)，且被研究證實(shí)對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ace）活性有較強(qiáng)的抑制作用，進(jìn)而抑制機(jī)體內(nèi)的腎素ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)槟I素ⅱ，從而降低血壓。

海帶生物轉(zhuǎn)化液中的降血壓肽分子量較小且含量較低，從中檢測(cè)并分離降血壓肽成為該研究的技術(shù)難點(diǎn)。至今尚無(wú)同時(shí)實(shí)現(xiàn)海帶生物轉(zhuǎn)化液中降血壓肽的定性定量檢測(cè)方面的報(bào)道。目前世界范圍內(nèi)常用的生物活性多肽檢測(cè)與分離方法為毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、質(zhì)譜法、核磁共振法等。其中，毛細(xì)管電泳法高效快速、分辨率高，能短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)分離，并使分析科學(xué)步入納升（nl）水平，然而，毛細(xì)管管徑較小，致使光路較短，對(duì)特殊檢測(cè)方法（如紫外吸收光譜法）則靈敏度較低，且易受樣品組份干擾，重復(fù)性較差；質(zhì)譜法與核磁共振法穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確性及靈敏度較高，然而二者的樣品前處理要求較高，制樣繁瑣，且儀器昂貴，成本代價(jià)較高，不利于普及使用；高效液相色譜法（hplc）具有檢測(cè)范圍廣、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，且不受溫度和流量變化的影響，價(jià)值低廉，易于推廣，是世界范圍內(nèi)常用的多肽識(shí)別和定量檢測(cè)技術(shù)之一。因此，本發(fā)明建立了一種簡(jiǎn)單、有效且實(shí)用的高效液相色譜方法，用以定性、定量檢測(cè)海帶生物轉(zhuǎn)化液中具有降血壓功效的小分子活性肽，同時(shí)為降血壓肽的研究及其深度開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種具有簡(jiǎn)便快捷、重復(fù)性好、精密度高和檢測(cè)成本低且能同時(shí)定量檢測(cè)海帶生物轉(zhuǎn)化液中多種小分子降血壓肽的方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供同時(shí)定量檢測(cè)海帶生物轉(zhuǎn)化液中小分子降血壓肽的方法，包括以下步驟：

（1）取對(duì)照品，制成對(duì)照品溶液，用液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；

（2）海帶生物轉(zhuǎn)化液制備：采用商業(yè)化蛋白酶混合酶解海帶粗蛋白，得到富含小分子肽的海帶生物轉(zhuǎn)化液；

（3）采用液相色譜對(duì)上述海帶生物轉(zhuǎn)化液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為：

色譜柱為c18反相柱，流動(dòng)相a為0.1%vol三氟乙酸-乙腈溶液，流動(dòng)相b為0.1%vol三氟乙酸-水溶液；

（4）比較樣品和對(duì)照品的峰圖，確定待檢海帶生物轉(zhuǎn)化液中是否含有小分子降血壓肽并定量；

（5）對(duì)小分子降血壓肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ace）抑制活性檢測(cè)。

進(jìn)一步的，所述步驟（1）中所使用的混合酶為胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶中的一種或者幾種的混合物。

進(jìn)一步的，所述檢測(cè)條件中采用梯度洗脫，其洗脫條件按時(shí)間分段設(shè)定為：0至10min，流動(dòng)相a的濃度逐漸由3～6%上升為13～16%，10至17min逐步上升為20～25%，17至22min繼續(xù)上升至33～36%，22至23min急劇下降至3～6%；流速為0.5～0.8ml/min。

進(jìn)一步的，所述檢測(cè)條件中柱溫為35～50℃，進(jìn)樣量為5～15μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為216～220nm。

依據(jù)本方法所得標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖結(jié)果，小分子降血壓肽ky、gky、skty、aky、akysy、kkfy、fy、kfky的出峰時(shí)間依次為12.450～12.837min，12.895～13.230min，13.692～13.936min，14.348～14.626min，19.462～19.734min，20.938～21.229min，21.527～22.019min，22.075～23.146min。其標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

ky：a1=14016c1+24520，

gky：a2=11615c2-27.146，

skty：a3=12299c3+5363.4，

aky：a4=12254c4+8453.4，

akysy：a5=33296c5+5410.6，

kkfy：a6=13976c6+2096.7，

fy：a7=19355c7+3691.3，

kfky：a8=13514c8-1762.5。

其中a1～a8分別代表八種降血壓肽的峰面積，c1-c8分別表示其在待檢測(cè)海帶生物轉(zhuǎn)化液中的濃度。

所述海帶生物轉(zhuǎn)化液中小分子降血壓肽的同時(shí)定量檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)海帶生物轉(zhuǎn)化液中小分子降血壓肽分離及同時(shí)定量檢測(cè)。利用外標(biāo)法制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，峰面積與小分子降血壓肽濃度之間的相關(guān)系數(shù)r²均大于0.9997；分別對(duì)小分子降血壓肽進(jìn)行日間、日內(nèi)多次重復(fù)測(cè)定，得知該方法的日間、日內(nèi)精密度rsd值均小于3%；利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入法得知該檢測(cè)方法的回收率rsd值小于5%；由此可見(jiàn)本發(fā)明方法具有較高的精確度；利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入法測(cè)定方法的回收率在92.17%～120.08%，rsd＜5%；由此可見(jiàn)本發(fā)明方法具有很高的精確度、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

采用hplc-esi-ms/ms對(duì)本發(fā)明檢測(cè)方法檢測(cè)海帶生物轉(zhuǎn)化液得到的幾種小分子降血壓肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與鑒定，與對(duì)照品對(duì)比確定本發(fā)明方法準(zhǔn)確可靠。

采用ace體外活性檢測(cè)方法對(duì)海帶生物轉(zhuǎn)化液中的小分子降血壓肽進(jìn)行降血壓效果測(cè)評(píng)：根據(jù)cushman和cheung等的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ace）抑制活性測(cè)定方法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。詳細(xì)步驟如下：取10μlace與40μl樣品置于200μl離心管中，渦旋震蕩器中輕微震蕩1min混合均勻，在37℃保溫5min后，加入50μl底物hhl混合均勻，37℃下反應(yīng)30min之后，加入100μl的1.0mol/lhcl終止反應(yīng)，混合均勻，在10000rpm下離心5min，上清通過(guò)hplc法測(cè)定在228nm處，反應(yīng)生成馬尿酸（ha，hippuricacid）的吸收值。

ace抑制活性根據(jù)下式計(jì)算：

抑制率（i%）=(a-b)/a×100%

a：不加入抑制劑時(shí)液相圖譜中馬尿酸的峰面積；

b：加入抑制劑時(shí)液相圖譜中馬尿酸的峰面積。

測(cè)定得知小分子降血壓肽的體外ace抑制活性檢測(cè)的ic50值范圍為2.42μm～20.63μm。（換成測(cè)定ic50的方法）生物轉(zhuǎn)化液

本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便快速，樣品前處理簡(jiǎn)單、科學(xué)有效，且目前尚無(wú)有關(guān)海帶生物轉(zhuǎn)化液中小分子降血壓肽的檢測(cè)方面的報(bào)道；該檢測(cè)方法較lc/ms、gc/ms分析方法，儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本更低，對(duì)操作人員要求不高，易于操作。

本發(fā)明方法不僅可以用于海帶生物轉(zhuǎn)化液中小分子降血壓肽的同時(shí)定量檢測(cè)，還適用于其他天然食品生物轉(zhuǎn)化液中的小分子降血壓肽的同時(shí)檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于天然制品、中草藥檢測(cè)以及藥品監(jiān)管等領(lǐng)域。

具體的發(fā)明過(guò)程如下：

1、檢測(cè)方法的建立：

采用帶有二級(jí)陣列管檢測(cè)器的島津高效液相色譜儀及耐酸的c18反相柱，柱溫為35～50℃，進(jìn)樣量5～15μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為216～220nm。流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸-乙腈溶液（流動(dòng)相a）與0.1%三氟乙酸-水溶液（流動(dòng)相b），采取濃度梯度洗脫，具體的梯度洗脫程序如下：0至10min，流動(dòng)相a的濃度逐漸由3～6%上升為13～16%，10至17min逐步上升為20～25%，17至22min繼續(xù)上升至33～36%，22至23min急劇下降至3～6%，整個(gè)洗脫程序耗時(shí)33min；流速為0.5～0.8ml/min。

相關(guān)試劑如下：ky，gky，skty，aky，akysy，kkfy，fy，kfky的標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于吉爾生化（上海）有限公司，乙腈（色譜純，德國(guó)merk），雙蒸水，三氟乙酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、硼酸、硼酸鈉（均為分析純）。其中，采用一定比例的甲醇-水配制fy、ky、aky、gky、kfky、kkfy、skty、akysy小分子降血壓肽的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使得八種小肽的摩爾濃度依次為25mm，40mm，40mm，40mm，5mm，25mm，20mm，置于-20℃條件下冷凍保存。

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系

采用hplc方法分別檢測(cè)八種多肽八個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液平行測(cè)定三次。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，根據(jù)最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析后繪制八條小肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以準(zhǔn)確定量海帶粗蛋白酶解樣品中八種小肽的含量。該線性回歸方程整體表示為y=kx+c，x代表濃度，y代表峰面積，k、c為常量。每條肽所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示，且每條標(biāo)準(zhǔn)曲線都具有較高的相關(guān)系數(shù)（r²≥0.9997），說(shuō)明該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系較好，能夠用于定量檢測(cè)使用。

表1小分子降血壓肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3、檢測(cè)限、定量限與線性范圍

檢測(cè)限和定量限的檢測(cè)分別是以相應(yīng)多肽hplc圖譜顯示的信噪比的3倍（s/n=3）和10倍（s/n=10）定值的。由定量限以及標(biāo)準(zhǔn)曲線可得出每條肽的線性范圍，具體數(shù)值如表2所示：

表2八種降血壓小肽的檢測(cè)限及線性范圍

如表2所示，八條多肽的檢出限較低，說(shuō)明該檢測(cè)方法靈敏度較高，可用于樣品中8種多肽微量的檢測(cè)；定量限相對(duì)也較低，且線性范圍較廣，能夠在較大范圍內(nèi)準(zhǔn)確檢測(cè)樣品中八條多肽的含量。

4、精確度與準(zhǔn)確度考察

以八條多肽各自20μm濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液為樣液，檢測(cè)每個(gè)樣液的日內(nèi)精密度和日間精密度，以rsd值為標(biāo)準(zhǔn)衡量檢測(cè)方法的精確度。日內(nèi)精密度指對(duì)加標(biāo)后的每個(gè)樣液在一天之內(nèi)進(jìn)行7次重復(fù)檢測(cè)（大約每2h檢測(cè)一次），進(jìn)樣量為10μl，計(jì)算rsd值；日間精密度指每個(gè)樣液每天平行三次進(jìn)樣，連續(xù)檢測(cè)七天，進(jìn)樣量均為10μl，計(jì)算rsd值。準(zhǔn)確度是由添加回收率及其rsd值來(lái)衡量。添加回收率指在八條多肽樣液中添加三個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，通過(guò)hplc方法檢測(cè)加標(biāo)后的峰面積值，計(jì)算相應(yīng)濃度與理論濃度的比率。每個(gè)濃度平行三次檢測(cè)即可求出rsd值。具體數(shù)據(jù)結(jié)果如表3所示。

表3精密度及準(zhǔn)確度驗(yàn)證

附圖說(shuō)明

圖1為小分子降血壓肽對(duì)照品的高效液相色譜圖

圖2圖2a為海帶生物轉(zhuǎn)化液樣品的高效液相色譜圖，圖2b為加標(biāo)后海帶生物轉(zhuǎn)化液樣品的高效液相色譜圖

圖3海帶粗蛋白酶解液中降血壓肽的hplc檢測(cè)圖譜（圖3a為堿性蛋白酶；圖3b為胰蛋白酶；圖3c為木瓜蛋白酶；圖3d為混合蛋白酶）

圖4海帶酶解液中二肽的hplc-esi-ms（外）與hplc-esi-ms/ms（內(nèi)）質(zhì)譜圖

圖4所示為海帶粗蛋白酶解液中的二肽成分在正離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖（外）與二級(jí)質(zhì)譜圖（內(nèi)）。圖4a中的分子離子峰[m+h]+為310.55m/z，得知該化合物的分子量為309.5，結(jié)合hplc的保留時(shí)間證實(shí)該組分為ky。選取母離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得出二級(jí)質(zhì)譜圖的兩個(gè)主要離子峰。其中定量碎片離子峰為84.1m/z，定性碎片離子峰為129.1m/z；圖4b中的分子離子峰[m+h]+為329.24m/z，得知該化合物的分子量為328，結(jié)合hplc的保留時(shí)間證實(shí)該組分為fy。選取母離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描分析，優(yōu)化碰撞能得出相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖，其中定量離子峰為120.2m/z，定性離子峰為99.1m/z。

圖5海帶酶解液中三肽的hplc--esi-ms（外）與hplc--esi-ms/ms（內(nèi)）質(zhì)譜圖

由圖5a中可知，該圖中一級(jí)質(zhì)譜得到[m+h]+為367.54m/z的分子離子峰知該化合物的分子量為366.5，結(jié)合rp-hplc保留時(shí)間得知該組分為gky；選取gky的母離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得出該物質(zhì)的定量碎片峰為129.1m/z，定性碎片峰為186.1m/z；由圖5b中的分子離子峰[m+h]+為381.58m/z，得知該化合物的分子量為380.5，結(jié)合hplc的保留時(shí)間證實(shí)該組分為aky，且由母離子峰的二級(jí)質(zhì)譜掃描得知aky的定量碎片離子峰為129.1m/z，定性碎片離子峰為200.1m/z。

圖6海帶酶解液中四肽的hplc--esi-ms（外）與hplc--esi-ms/ms（內(nèi)）質(zhì)譜圖

圖6所示為海帶粗蛋白酶解液中四肽的hplc-ms與hplc-ms/ms圖譜，由圖6a中可知，分子離子峰[m+h]+為498.75m/z，得知該化合物的分子量為497左右，結(jié)合hplc的保留時(shí)間證實(shí)該組分為stky。選取該分子的母離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得出相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜圖中的定量離子峰為120.2m/z，定性離子峰為99.1m/z。圖6b中的分子離子峰[m+h]+為585.94m/z，得知該化合物的分子量為584.94左右，結(jié)合hplc的保留時(shí)間證實(shí)該組分為kkfy；對(duì)母離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描得該分子的定量離子峰為84.1m/z，定性離子峰為129.1m/z。圖6c中的分子離子峰[m+h]+為586.01m/z，得知該化合物的分子量為585左右，結(jié)合hplc的保留時(shí)間證實(shí)該組分為kfky。對(duì)kfky的母離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描得知，該四肽的定量離子峰為114.1m/z，定性離子峰為129.1m/z。

圖7海帶酶解液中五肽的hplc-esi-ms（外）與hplc-esi-ms/ms（內(nèi)）質(zhì)譜圖

圖7所示的是海帶粗蛋白酶解液中五肽的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖，由圖知外層圖為以及質(zhì)譜圖，圖中的離子峰是[m+h]⁺為632.09m/z的分子離子峰，得知該化合物的分子量為631，結(jié)合hplc的保留時(shí)間證實(shí)該組分為akysy。對(duì)該離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，優(yōu)化碰撞能得出最優(yōu)的二級(jí)質(zhì)譜圖（內(nèi)層圖），其中129.1m/z為定量離子峰，114.2m/z定性離子峰。

具體實(shí)施例：

實(shí)施例1：

同時(shí)定量檢測(cè)海帶生物轉(zhuǎn)化液中小分子降血壓肽的方法，主要包括以下步驟：

（1）取對(duì)照品，制成對(duì)照品溶液，用液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示。

（2）海帶生物轉(zhuǎn)化液制備：

以海帶下腳料為原料，采用木瓜蛋白酶解海帶粗蛋白，制備得到富含小分子肽的海帶生物轉(zhuǎn)化液；

（3）采用液相色譜對(duì)上述海帶生物轉(zhuǎn)化液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為：

采用帶有二級(jí)陣列管檢測(cè)器的高效液相色譜儀及耐酸的c18反相柱，流動(dòng)相a為0.1%三氟乙酸-乙腈溶液，流動(dòng)相b為0.1%三氟乙酸-水溶液，采用梯度洗脫，其洗脫條件按時(shí)間分段設(shè)定為：0至10min，流動(dòng)相a的濃度逐漸由5%逐漸上升為15%，10至17min逐步上升為23%，17至22min繼續(xù)上升至35%，22至23min急劇下降至5%；流速為0.7ml/min；柱溫為45℃，進(jìn)樣10μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為217nm。檢測(cè)結(jié)果如圖3a所示。

（4）依據(jù)小分子肽對(duì)照品的出峰保留時(shí)間，確定待檢海帶生物轉(zhuǎn)化液中小分子降血壓肽含有種類及含量：

依據(jù)小分子降血壓肽ky、gky、skty、aky、akysy、kkfy、fy、kfky的對(duì)照品的色譜圖及出峰時(shí)間可知，該海帶生物轉(zhuǎn)化液中含有此八種小分子降血壓肽；根據(jù)小分子降血壓肽的線性回歸方程可知，該海帶生物轉(zhuǎn)化液中的小分子降血壓肽含量依次為0.035±0.001g/100g，0.089±0.003g/100g，未檢出，0.127±0.005g/100g，0.089±0.003g/100g，0.103±0.004g/100g，0.078±0.003g/100g，0.258±0.010g/100g，這幾種小分子肽的總量為0.779±0.015g/100g。

實(shí)施例2：

同時(shí)定量檢測(cè)海帶生物轉(zhuǎn)化液中小分子降血壓肽的方法，主要包括以下步驟：

（1）取對(duì)照品，制成對(duì)照品溶液，用液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示。

（2）海帶生物轉(zhuǎn)化液制備：

以海帶為原料，采用堿性蛋白酶酶解海帶粗蛋白，制備得到富含小分子肽的海帶生物轉(zhuǎn)化液；

（3）采用液相色譜對(duì)上述海帶生物轉(zhuǎn)化液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為：

采用帶有二級(jí)陣列管檢測(cè)器的高效液相色譜儀及耐酸的c18反相柱，流動(dòng)相a為0.1%三氟乙酸-乙腈溶液，流動(dòng)相b為0.1%三氟乙酸-水溶液，采用梯度洗脫，其洗脫條件按時(shí)間分段設(shè)定為：0至10min，流動(dòng)相a的濃度逐漸由3%逐漸上升為13%，10至17min逐步上升為20%，17至22min繼續(xù)上升至33%，22至23min急劇下降至3%；流速為0.5ml/min；柱溫為35℃，進(jìn)樣5μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為216nm。檢測(cè)結(jié)果如圖3b所示。

（4）依據(jù)小分子肽對(duì)照品的出峰保留時(shí)間，確定待檢海帶生物轉(zhuǎn)化液中小分子降血壓肽含有種類及含量：

依據(jù)小分子降血壓肽ky、gky、skty、aky、akysy、kkfy、fy、kfky的對(duì)照品的色譜圖及出峰時(shí)間可知，該海帶生物轉(zhuǎn)化液中含有此八種小分子降血壓肽；根據(jù)小分子降血壓肽的線性回歸方程可知，該海帶生物轉(zhuǎn)化液中的小分子降血壓肽含量依次為0.019±0.001g/100g，未檢出，0.020±0.001g/100g，0.035±0.001g/100g，0.062±0.002g/100g，未檢出，0.012±0.001g/100g，0.098±0.003g/100g，這幾種小分子肽的總量為0.246±0.006g/100g。

實(shí)施例3：

同時(shí)定量檢測(cè)海帶生物轉(zhuǎn)化液中小分子降血壓肽的方法，主要包括以下步驟：

（1）取對(duì)照品，制成對(duì)照品溶液，用液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示。

（2）海帶生物轉(zhuǎn)化液制備：

以海帶為原料，采用胰蛋白酶酶解海帶粗蛋白，制備得到富含小分子肽的海帶生物轉(zhuǎn)化液；

（3）采用液相色譜對(duì)上述海帶生物轉(zhuǎn)化液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為：

采用帶有二級(jí)陣列管檢測(cè)器的高效液相色譜儀及耐酸的c18反相柱，流動(dòng)相a為0.1%三氟乙酸-乙腈溶液，流動(dòng)相b為0.1%三氟乙酸-水溶液，采用梯度洗脫，其洗脫條件按時(shí)間分段設(shè)定為：0至10min，流動(dòng)相a的濃度逐漸由6%逐漸上升為16%，10至17min逐步上升為25%，17至22min繼續(xù)上升至36%，22至23min急劇下降至6%；流速為0.8ml/min；柱溫為50℃，進(jìn)樣15μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。檢測(cè)結(jié)果如圖3c所示。

（4）依據(jù)小分子肽對(duì)照品的出峰保留時(shí)間，確定待檢海帶生物轉(zhuǎn)化液中小分子降血壓肽含有種類及含量：

依據(jù)小分子降血壓肽ky、gky、skty、aky、akysy、kkfy、fy、kfky的對(duì)照品的色譜圖及出峰時(shí)間可知，該海帶生物轉(zhuǎn)化液中含有此八種小分子降血壓肽；根據(jù)小分子降血壓肽的線性回歸方程可知，ky、gky、未檢出，其他的小分子降血壓肽含量依次為0.092±0.004g/100g，0.087±0.004g/100g，0.041±0.002g/100g，0.012±0.001g/100g，0.037±0.001g/100g，0.087±0.003g/100g，這幾種小分子肽的總量為0.356±0.008g/100g。

實(shí)施例4：

同時(shí)定量檢測(cè)海帶生物轉(zhuǎn)化液中小分子降血壓肽的方法，主要包括以下步驟：

（1）取對(duì)照品，制成對(duì)照品溶液，用液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示。

（2）海帶生物轉(zhuǎn)化液制備：

以海帶為原料，采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶三種商業(yè)化蛋白酶按照1:2:2的摩爾比混合而成的混合酶解海帶粗蛋白，制備得到富含小分子肽的海帶生物轉(zhuǎn)化液；

（3）采用液相色譜對(duì)上述海帶生物轉(zhuǎn)化液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為：

采用帶有二級(jí)陣列管檢測(cè)器的高效液相色譜儀及耐酸的c18反相柱，流動(dòng)相a為0.1%三氟乙酸-乙腈溶液，流動(dòng)相b為0.1%三氟乙酸-水溶液，采用梯度洗脫，其洗脫條件按時(shí)間分段設(shè)定為：0至10min，流動(dòng)相a的濃度逐漸由5%逐漸上升為15%，10至17min逐步上升為23%，17至22min繼續(xù)上升至35%，22至23min急劇下降至5%；流速為0.7ml/min；柱溫為45℃，進(jìn)樣10μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為218nm。檢測(cè)結(jié)果如圖3d所示。

（4）依據(jù)小分子肽對(duì)照品的出峰保留時(shí)間，確定待檢海帶生物轉(zhuǎn)化液中小分子降血壓肽含有種類及含量：

依據(jù)小分子降血壓肽ky、gky、skty、aky、akysy、kkfy、fy、kfky的對(duì)照品的色譜圖及出峰時(shí)間可知，該海帶生物轉(zhuǎn)化液中含有此八種小分子降血壓肽；根據(jù)小分子降血壓肽的線性回歸方程可知，該海帶生物轉(zhuǎn)化液中的小分子降血壓肽含量依次為0.103±0.005g/100g，0.134±0.007g/100g，0.190±0.008g/100g，0.151±0.007g/100g，0.082±0.004g/100g，0.153±0.007g/100g，0.066±0.003g/100g，0.256±0.012g/100g，這幾種小分子肽的總量為1.134±0.021g/100g。

（5）對(duì)海帶生物轉(zhuǎn)化液中小分子降血壓肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和ace抑制活性檢測(cè)，小分子降血壓肽ky、gky、skty、aky、akysy、kkfy、fy、kfky的ace體外抑制活性ic50值依次為5.24μm，7.94μm，20.63μm，7.52μm，2.42μm，15.33μm，4.83μm，10.73μm。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。