所屬技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及的是一種蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法，屬于食品、飼料及生化領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
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蛋白質(zhì)的含量是人類(lèi)食品和動(dòng)物飼料的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，蛋白質(zhì)也是生物樣品的重要組成成分。蛋白質(zhì)的測(cè)定方法很多，主要有凱氏定氮法、雙縮脲法、folin-酚試劑法、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法等?！迨称分械鞍踪|(zhì)的測(cè)定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)″(gb5009.5-2010)中包含了凱氏定氮法、燃燒法和分光光度法等三種方法。凱氏定氮法和燃燒法測(cè)定的是總氮含量，因此得到的結(jié)果代表的是粗蛋白含量。這一檢測(cè)方法無(wú)法區(qū)分蛋白氮和非蛋白氮?！迦槠啡矍璋肥录寰褪遣环ǚ肿永昧藙P氏定氮法的這一缺陷，將含氮量高達(dá)66.67％的有毒化學(xué)品三聚氰胺人為地加入到乳品中，使蛋白質(zhì)的檢測(cè)值虛高而牟取暴利。上述其它方法也不能準(zhǔn)確有效地對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè)。目前，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法均存在著一定的缺陷，而現(xiàn)代的儀器分析方法尚不成熟。

蛋白質(zhì)是氨基酸通過(guò)肽鍵結(jié)合而成的高分子化合物。食品中的蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值取決于其構(gòu)成的氨基酸的種類(lèi)和比例，按蛋白質(zhì)中必需氨基酸的含量和種類(lèi)可將食物中的蛋白質(zhì)分為三類(lèi)：(1)完全蛋白：蛋白質(zhì)組成中含有充足的維持生命和促進(jìn)生長(zhǎng)的全部必需氨基酸，如乳中的酪蛋白、蛋中的卵蛋白，這類(lèi)蛋白作為食物對(duì)人體的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高；(2)不完全蛋白：蛋白質(zhì)組成中缺乏一種或幾種人體必需氨基酸，它不能維持生命，也不能促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)，如玉米中的玉米膠蛋白、動(dòng)物結(jié)締組織、肉皮中的膠質(zhì)蛋白；(3)半完全蛋白：蛋白質(zhì)中氨基酸組成介于上述兩者之間，即蛋白質(zhì)中含有人體所需的必需氨基酸，但氨基酸間含量比例不平衡，它能維持生命，但不能促進(jìn)生長(zhǎng)，如小麥和大麥中的麥膠蛋白。

將蛋白質(zhì)水解成氨基酸，再對(duì)氨基酸進(jìn)行分析，這樣不僅能準(zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，而且可以了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的種類(lèi)和比例，并且能更好地評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的質(zhì)量。但是目前報(bào)導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解方法，都不能使蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中的氨基酸真實(shí)地反映構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸，雖然在理論上可行，但是由于水解方法的限制，目前還無(wú)法通過(guò)該方法準(zhǔn)確地測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。

文獻(xiàn)中報(bào)道的常用于蛋白質(zhì)水解的方法有三種，即酸水解法、堿水解法和酶水解法。酸水解法通常采用的是硫酸(4mol/l)或hcl(6mol/l)，回流煮沸20h。其優(yōu)點(diǎn)是水解完全，不引起消旋作用；缺點(diǎn)為：色氨酸被破壞，羥基氨基酸(絲氨酸及蘇氨酸)有一小部分被分解，天冬酰胺和谷胺酰胺的酰胺基被水解下來(lái)。另外，也可采用蛋白質(zhì)水解管，在60℃、無(wú)氧條件下水解20小時(shí)，該法在同樣也存在氨基酸損失的問(wèn)題。堿水解法是使樣品與naoh(5mol/l)共煮10-20h，優(yōu)點(diǎn)為：水解完全，色氨酸不受破壞；缺點(diǎn)為：氨基酸產(chǎn)生消旋現(xiàn)象，還會(huì)引起精氨酸脫氨并生成鳥(niǎo)氨酸和尿素。酶水解法是用胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶等蛋白酶進(jìn)行分步水解。優(yōu)點(diǎn)為：氨基酸不產(chǎn)生消旋作用，也不破壞氨基酸；缺點(diǎn)為：采用單種酶往往不能水解完全，需要幾種酶協(xié)同作用才能使蛋白質(zhì)完全水解，所需時(shí)間較長(zhǎng)，步驟復(fù)雜，不適合在蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用。因此，對(duì)采用述三種蛋白質(zhì)水解方法得到的水解產(chǎn)物進(jìn)行氨基酸分析，得到的結(jié)果都不能真實(shí)地反映構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸種類(lèi)及比例。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種蛋白質(zhì)水解為氨基酸并通過(guò)氨基酸分析檢測(cè)蛋白質(zhì)含量的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

首先將樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，然后用氨基酸分析儀對(duì)水解液中的氨基酸進(jìn)行分析，根據(jù)氨基酸求出蛋白質(zhì)的含量。

具體實(shí)施方案：

1、蛋白質(zhì)的水解

(1)樣品的蛋白質(zhì)的水解：稱(chēng)取樣品于蛋白質(zhì)水解管中，加入對(duì)酚磺酸水解試劑，對(duì)酚磺酸水解試劑是以乙醇、甲醇或乙腈的水溶液配制，超聲，使樣品混合均勻，通氬氣或氮?dú)獬ト芙庋酰饪诤?，放入真空干燥箱中，?00-120℃水解14-20小時(shí)；

(2)過(guò)濾及定容：水解完成后，取出水解管冷卻至室溫，開(kāi)管后，將水解物過(guò)濾，洗滌水解管和濾紙，收集洗滌液，并定容；

(3)蒸干處理：吸取定容后的樣品并放入真空干燥箱中，在溫度為40-60℃下使其完全干燥，底部留有少許固體或痕漬。

2、氨基酸的測(cè)定

(1)氨基酸的分析原理：氨基酸分析儀中的陽(yáng)離子交換柱利用氨基酸的酸堿性、極性及相對(duì)分子質(zhì)量的不同，使各種氨基酸在色譜柱上實(shí)現(xiàn)分離。氨基酸被緩沖溶液洗脫下來(lái)的先后順序依次是酸性氨基酸、極性大的氨基酸和非極性氨基酸、堿性氨基酸。被洗脫下來(lái)的氨基酸與茚三酮發(fā)生顯色反應(yīng)，顏色的深淺程度在一定范圍內(nèi)與氨基酸的含量呈線性關(guān)系，然后利用分光光度法對(duì)氨基酸進(jìn)行檢測(cè)，每種被洗脫下來(lái)的氨基酸會(huì)對(duì)應(yīng)不同的保留時(shí)間，根據(jù)得到圖譜的保留時(shí)間可以對(duì)氨基酸進(jìn)行定性分析，根據(jù)每個(gè)譜峰的面積或峰高可以對(duì)其進(jìn)行定量分析。

(2)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的分析

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品1：標(biāo)準(zhǔn)品中含有19種氨基酸，分別為半胱氨酸(cys)、天冬氨酸(asp)、蛋氨酸砜(metson)、蘇氨酸(thr)、絲氨酸(ser)、谷氨酸(glu)、脯氨酸(pro)、甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、胱氨酸((cys)2)、纈氨酸(val)、蛋氨酸(met)、異亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、酪氨酸(tyr)、苯丙氨酸(phe)、組氨酸(his)、賴(lài)氨酸(lys)和精氨酸(arg)，標(biāo)準(zhǔn)品中每種氨基酸濃度為100nmol/ml，標(biāo)準(zhǔn)品1的圖譜如圖1所示。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品2：色氨酸(trp)的濃度為100nmol/ml。標(biāo)準(zhǔn)品2的圖譜如圖2所示。

采用德國(guó)aminosys公司的a300氨基酸分析儀，進(jìn)樣量為20μl，每種氨基酸參與顯色反應(yīng)的物質(zhì)的量為2nmol。

(3)樣品的氨基酸分析及蛋白質(zhì)含量的計(jì)算

在蒸干后的樣品水解物試管中加入樣品緩沖液，置振蕩混合器上混合均勻，用針管吸取少量，通過(guò)過(guò)濾器過(guò)濾后，用a300型氨基酸分析儀對(duì)水解液進(jìn)行氨基酸分析，進(jìn)樣量為20μl，得到樣品的氨基酸圖譜。與標(biāo)準(zhǔn)樣品的譜圖對(duì)照，根據(jù)圖譜上各峰的保留時(shí)間及峰面積求出樣品中的氨基酸種類(lèi)及含量。

根據(jù)樣品峰和標(biāo)準(zhǔn)品峰面積之比，求算水解液中每種氨基酸摩爾數(shù)，公式為：

式中：ni-樣品中氨基酸的摩爾數(shù)，mol；

si-樣品中每種氨基酸的峰面積；

s0-標(biāo)準(zhǔn)品氨基酸的峰面積；

2-標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣中的氨基酸納摩爾數(shù)，nmol；

0.02-進(jìn)樣量，ml；

50-樣品的稀釋倍數(shù)。

樣品中每種氨基酸的質(zhì)量為：

mi＝ni×mi(2)

式中：mi-每種氨基酸的質(zhì)量，g；

mi-氨基酸的相對(duì)分子質(zhì)量。

蛋白質(zhì)的水解相當(dāng)于每?jī)蓚€(gè)氨基酸之間加入了一個(gè)水分子，由于蛋白質(zhì)屬于高分子化合物，分子量非常大，每個(gè)蛋白質(zhì)由成千上萬(wàn)個(gè)氨基酸構(gòu)成，因此，計(jì)算時(shí)只按氨基酸的摩爾數(shù)減去相同摩爾數(shù)的水分子求算蛋白質(zhì)，而由于每個(gè)蛋白質(zhì)鏈之間相差的1個(gè)水分子產(chǎn)生的誤差可以忽略不計(jì)。樣品中蛋白質(zhì)的百分含量為：

式中：mi-每種氨基酸的質(zhì)量，g；

ni-樣品中氨基酸的摩爾數(shù)，mol；

-水的相對(duì)分子質(zhì)量；

m-樣品的稱(chēng)樣量，g。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明中采用的蛋白質(zhì)水解劑為對(duì)酚磺酸的，較傳統(tǒng)的鹽酸或氫氧化鈉水解劑溫和，對(duì)于色氨酸不產(chǎn)生破壞作用；

2、對(duì)酚磺酸水解劑是以乙醇、甲醇或乙腈的水溶液配制，降低了溶液的極性，較傳統(tǒng)的水溶劑極性低，對(duì)水解產(chǎn)生的氨基酸起到了保護(hù)作用；

3、因?yàn)樽鳛槭称分械鞍踪|(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值主要是由必需氨基酸決定的，因此，采用氨基酸分析來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)，可以了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的種類(lèi)及各自的含量，更有利于評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

實(shí)例1

1、樣品的蛋白質(zhì)水解：稱(chēng)取奶粉樣品0.2000g于水解管中，樣品是由唐山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所提供的，是牛乳企業(yè)由鮮牛乳直接干燥得到的，在水解管中加入5ml濃度為6mol/l的對(duì)酚磺酸水解試劑，對(duì)酚磺酸水解試劑是以20％乙醇溶液配制的，超聲30min使樣品混合均勻，通氬氣或氮?dú)獬ト芙庋酰饪诤?，放入真空干燥箱中，?10℃水解17h；水解完成后取出水解管冷卻至室溫，開(kāi)管后，過(guò)濾到50ml容量瓶中，用水洗滌水解管和濾紙，收集洗滌液，并定容至刻度線；吸取定容后的樣品1ml放入真空干燥箱中，在溫度為50℃下使其完全干燥，底部留有少許固體或痕漬。

2、氨基酸的分析：在蒸干后的樣品水解物試管中加入1ml樣品緩沖液，置振蕩混合器上混合均勻，用針管吸取少量，通過(guò)過(guò)濾器過(guò)濾后，用a300型氨基酸分析儀對(duì)水解液進(jìn)行氨基酸分析，進(jìn)樣量為20μl，得到樣品的氨基酸圖譜3。與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的譜圖1和譜圖2進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)圖譜上各峰的保留時(shí)間及峰面積求出樣品中的氨基酸種類(lèi)及含量，見(jiàn)表1。

表1對(duì)酚磺酸水解干奶粉的氨基酸分析數(shù)據(jù)

求出氨基酸的總摩爾數(shù)為416.4，氨基酸的總質(zhì)量為54990求得樣品中蛋白質(zhì)的百分含量為23.74％。

3、對(duì)比實(shí)驗(yàn)：稱(chēng)取相同的奶粉樣品0.2000g于水解管中，將用5ml濃度為6mol/l的鹽酸為水解試劑進(jìn)行水解，在溫度為110℃時(shí)水解樣品24h，其它步驟與1和2的相同，進(jìn)行氨基酸分析得到譜圖，如圖4所示。根據(jù)圖譜上各峰的保留時(shí)間及峰面積求出樣品中的氨基酸種類(lèi)及含量，見(jiàn)表2。

表2鹽酸水解干奶粉的氨基酸分析數(shù)據(jù)

求出氨基酸的總摩爾數(shù)為300.2μmol，氨基酸的總質(zhì)量為39340μg，計(jì)算得出樣品中蛋白質(zhì)的百分含量為16.97％。鹽酸作為水解劑與對(duì)酚磺酸比較，前者的水解液中不含有色氨酸及半胱氨酸，而后者均能檢測(cè)到色氨酸及半胱氨酸，說(shuō)明鹽酸作為水解試劑使色氨酸和半胱氨酸完全破壞。另外，鹽酸作為水解劑求得的蛋白質(zhì)含量是16.97％，而以對(duì)酚磺酸為水解試劑求得的蛋白質(zhì)的含量是23.74％，后者得到的蛋白質(zhì)含量及各種氨基酸的含量均明顯高于前者，說(shuō)明了鹽酸作為水解劑會(huì)使氨基酸受到明顯破壞。

實(shí)例2

1、樣品的蛋白質(zhì)水解：稱(chēng)取市售商品奶粉樣品0.2000g于水解管中，在水解管內(nèi)加入6ml濃度為5.5mol/l的對(duì)酚磺酸水解試劑，對(duì)酚磺酸水解試劑是以20％乙腈溶液配制，超聲25min使樣品混合均勻，通氬氣或氮?dú)獬ト芙庋?，封口后，放入真空干燥箱中，?05℃水解20h；水解完成后取出水解管冷卻至室溫，開(kāi)管后，過(guò)濾到50ml容量瓶中，用水洗滌水解管和濾紙，收集洗滌液，并定容至刻度線；吸取定容后的樣品1ml放入真空干燥箱中，在溫度為55℃下使其完全干燥，底部留有少許固體或痕漬。

2、氨基酸的分析：在蒸干后的樣品水解物試管中加入1ml樣品緩沖液，置振蕩混合器上混合均勻，用針管吸取少量，通過(guò)過(guò)濾器過(guò)濾后，用a300型氨基酸分析儀對(duì)水解液進(jìn)行氨基酸分析，進(jìn)樣量為20μl，得到樣品的氨基酸圖譜5。

3、計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量：將圖5與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖1和2進(jìn)行比較，根據(jù)圖譜上各峰的保留時(shí)間及峰面積求出樣品中的氨基酸種類(lèi)及含量，見(jiàn)表3

表3對(duì)酚磺酸水解市售奶粉的氨基酸分析數(shù)據(jù)

求出氨基酸的總摩爾數(shù)為375.7μmol，氨基酸的總質(zhì)量為49160μg，計(jì)算求得樣品中蛋白質(zhì)的百分含量為21.20％。樣品中的色氨酸含量較高，說(shuō)明采用該水解方法可以很好地保護(hù)氨基酸不受破壞。

附圖說(shuō)明：

圖1氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品1的圖譜。

圖2氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品2的圖譜。

圖3對(duì)酚磺酸水解干奶粉的氨基酸分析譜圖。

圖4鹽酸水解干奶粉的氨基酸圖譜。

圖5對(duì)酚磺酸水解市售奶粉的氨基酸分析圖譜。