本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，特別是涉及一種納米粒在細(xì)胞和組織內(nèi)分布的檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

納米粒進(jìn)入體內(nèi)后，與體液中的蛋白(白蛋白、脂蛋白、免疫球蛋白等)、細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞)發(fā)生復(fù)雜的相互作用，從而導(dǎo)致納米粒在形態(tài)、表面性質(zhì)以及數(shù)量的變化。用于檢測(cè)的常規(guī)手段包括流式細(xì)胞儀、激光共聚焦顯微鏡，但過(guò)程復(fù)雜而繁瑣，提供的數(shù)據(jù)結(jié)果也無(wú)法量化，不能精確的展現(xiàn)出納米粒自身的狀態(tài)。由于血清蛋白、血細(xì)胞等的干擾，用于納米粒分析的常規(guī)儀器如DLS也顯得乏力。本發(fā)明應(yīng)用納米顆粒跟蹤分析技術(shù)，對(duì)納米粒的粒徑以及顆粒數(shù)進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)，還可以通過(guò)對(duì)復(fù)雜體系中的特定納米顆粒進(jìn)行熒光標(biāo)記，排除組分中其他粒子的干擾，使得檢測(cè)結(jié)果更有針對(duì)性，熒光通道下的檢測(cè)視野如圖1所示。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種一種納米粒細(xì)胞內(nèi)和組織內(nèi)分布的檢測(cè)方法。本發(fā)明通過(guò)使用納米顆粒跟蹤分析技術(shù)，提供了一種簡(jiǎn)單可靠的定性和/或定量檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取情況，以及納米粒在體內(nèi)組織中的分布。通過(guò)將納米粒進(jìn)行熒光標(biāo)記，用分離手段，對(duì)進(jìn)入組織器官內(nèi)納米粒的數(shù)量和粒徑進(jìn)行針對(duì)性的分析，以考察納米粒在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、節(jié)約時(shí)間、提供有效數(shù)據(jù)多等特點(diǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明第一方面提供一種納米粒在細(xì)胞內(nèi)分布的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

1)納米粒進(jìn)行熒光標(biāo)記；

2)將步驟1)得到的熒光標(biāo)記的納米粒與細(xì)胞共孵育；

3)將步驟2)得到的細(xì)胞分離得到上清；

4)將步驟3)得到的上清采用納米顆粒跟蹤分析儀進(jìn)行定性和/或定量檢測(cè)；

5)根據(jù)上清中納米顆粒定性和/或定量檢測(cè)的結(jié)果，獲取納米粒在細(xì)胞內(nèi)分布狀況。

優(yōu)選地，步驟2)中，將步驟1)得到的熒光標(biāo)記的納米粒與介質(zhì)孵育后，再加入到細(xì)胞內(nèi)孵育，所述介質(zhì)為PBS、白蛋白溶液或血清。

更優(yōu)選，所述熒光標(biāo)記的納米粒與所述介質(zhì)的體積比為0.5～1:1。

優(yōu)選地，步驟3)中，所述分離為：先梯度離心分離，再qEV分離柱分離。

所述細(xì)胞可為外周血細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。

所述納米粒包括脂質(zhì)體、自組裝納米粒、納米復(fù)合物、外泌體等納米級(jí)別的顆粒。

優(yōu)選地，步驟4)中，所述定性方法為：采用納米顆粒跟蹤分析儀獲得上清中剩余納米粒的量，與總納米粒相比，來(lái)確認(rèn)納米粒是否被細(xì)胞攝取。

優(yōu)選地，步驟4)中，所述定量方法為：采用納米顆粒跟蹤分析儀獲得上清中剩余納米粒的量，總納米粒與剩余納米粒的量的差為納米粒被細(xì)胞攝取的量。

更優(yōu)選地，所述納米顆粒跟蹤分析儀為搭載532nm激光器的NTA NS300，切換至熒光通道檢測(cè)模塊，特異性的檢測(cè)熒光標(biāo)記納米粒的粒徑及其數(shù)量。

本發(fā)明第二方面提供上述納米粒在細(xì)胞內(nèi)分布的檢測(cè)方法用于觀測(cè)納米粒被不同外周血細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的攝取狀態(tài)。

本發(fā)明第三方面提供一種納米粒在組織內(nèi)分布的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

1)納米粒進(jìn)行熒光標(biāo)記；

2)將步驟1)得到的熒光標(biāo)記的納米粒注入組織；

可以將步驟1)得到的熒光標(biāo)記的納米粒注入離體的組織樣本，也可以將步驟1)得到的熒光標(biāo)記的納米粒注入個(gè)體，如動(dòng)物或植物；

3)將步驟2)得到的組織分離得到上清；

當(dāng)步驟2)為將步驟1)得到的熒光標(biāo)記的納米粒注入個(gè)體時(shí)，步驟3)中所述步驟2)得到的組織需要先從個(gè)體中取出；

4)將步驟3)得到的上清采用納米顆粒跟蹤分析儀分進(jìn)行定性和/或定量檢測(cè)；

5)根據(jù)上清中納米顆粒定性和/或定量檢測(cè)的結(jié)果，獲取納米粒在組織內(nèi)分布狀況。

所述組織可為腫瘤組織、肝臟組織、脾臟組織、腎臟組織或腸道組織。

優(yōu)選地，步驟3)中，所述分離為：將步驟2)得到的組織加入dispase溶液裂解為單細(xì)胞懸液，消化組織，然后離心，取上清過(guò)qEV分離柱分離。

更優(yōu)選地，加入dispase溶液的濃度為0.6-2.4U/mL，加入量為每50mg組織加入750μLdispase溶液。

優(yōu)選地，步驟4)中，所述定性方法為：采用納米顆粒跟蹤分析儀獲得上清中剩余納米粒的量，與總納米粒相比，來(lái)確認(rèn)納米粒是否被組織攝取。

優(yōu)選地，步驟4)中，所述定量方法為：采用納米顆粒跟蹤分析儀獲得上清中剩余納米粒的量，總納米粒與剩余納米粒的量的差為納米粒被組織攝取的量。

更優(yōu)選地，所述納米顆粒跟蹤分析儀為搭載532nm激光器的NTA NS300，切換至熒光通道檢測(cè)模塊，特異性的檢測(cè)熒光標(biāo)記納米粒的粒徑及其數(shù)量，屏蔽組織處理過(guò)程中引入以及本身存在的納米級(jí)顆粒的影響。

本發(fā)明第四方面提供一種上述納米粒在組織內(nèi)分布的檢測(cè)方法的用途，用于觀測(cè)納米粒在動(dòng)物體內(nèi)的組織分布。

本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單可靠的定性和/或定量檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)細(xì)胞對(duì)納米粒的攝取情況，以及納米粒在體內(nèi)組織中的分布。通過(guò)將納米粒進(jìn)行熒光標(biāo)記，用分離手段，對(duì)進(jìn)入組織器官內(nèi)納米粒的數(shù)量和粒徑進(jìn)行針對(duì)性的分析，以考察納米粒在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、節(jié)約時(shí)間、提供有效數(shù)據(jù)多等特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是Nanosight熒光通道下檢測(cè)納米粒視野圖。

圖2是制備好的熒光納米粒在DLS Nanosizer粒徑圖。

圖3是組織中分離的納米粒在Nanosight檢測(cè)結(jié)果。

圖4是細(xì)胞在不同介質(zhì)中對(duì)納米粒攝取的流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖。

圖5是納米粒從腫瘤組織中回收的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖6是納米粒在組織處理過(guò)程中回收的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖7是納米粒在腫瘤組織中的數(shù)量隨時(shí)間變化曲線。

圖8是納米粒在肝臟組織中的數(shù)量隨時(shí)間變化曲線。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

須知，下列實(shí)施例中未具體注明的工藝設(shè)備或裝置均采用本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)設(shè)備或裝置。

此外應(yīng)理解，本發(fā)明中提到的一個(gè)或多個(gè)方法步驟并不排斥在所述組合步驟前后還可以存在其他方法步驟或在這些明確提到的步驟之間還可以插入其他方法步驟，除非另有說(shuō)明；還應(yīng)理解，本發(fā)明中提到的一個(gè)或多個(gè)設(shè)備/裝置之間的組合連接關(guān)系并不排斥在所述組合設(shè)備/裝置前后還可以存在其他設(shè)備/裝置或在這些明確提到的兩個(gè)設(shè)備/裝置之間還可以插入其他設(shè)備/裝置，除非另有說(shuō)明。而且，除非另有說(shuō)明，各方法步驟的編號(hào)僅為鑒別各方法步驟的便利工具，而非為限制各方法步驟的排列次序或限定本發(fā)明可實(shí)施的范圍，其相對(duì)關(guān)系的改變或調(diào)整，在無(wú)實(shí)質(zhì)變更技術(shù)內(nèi)容的情況下，當(dāng)亦視為本發(fā)明可實(shí)施的范疇。

本發(fā)明中，縮寫符號(hào)表示如下：

縮寫名稱 中文全稱

HSPC 氫化大豆卵磷脂

Chol 膽固醇

DSPE-PEG2000 二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000

DiI 細(xì)胞膜紅色熒光探針

PBS 磷酸鹽緩沖溶液

NTA NS300 納米顆粒跟蹤分析儀

DLS 馬爾文激光粒度儀

PLD 空白阿霉素脂質(zhì)體

Alb 血清白蛋白

FBS 小牛血清

Raw246.7 巨噬細(xì)胞系

dispase溶液 中性蛋白酶

實(shí)施例1納米粒被細(xì)胞攝取的量化檢測(cè)

(一)熒光納米粒的制備

本發(fā)明采用脂質(zhì)體作為納米粒的模型。取HSPC、Chol、DSPE-PEG2000儲(chǔ)備液質(zhì)量比為3：1：1，按脂質(zhì)質(zhì)量比1％加入DiI，用乙醇注入法制備脂質(zhì)體，PBS水合30min后，在60℃分別過(guò)200nm+100nm、80nm+50nm Nuclepore聚碳酸酯膜，各過(guò)13次，為防止熒光淬滅，制備過(guò)程避光。用DLS表征制備好的熒光脂質(zhì)體的粒徑。

(二)細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞計(jì)數(shù)后鋪板，將體積比為1:1的納米粒與不同介質(zhì)(PBS、白蛋白溶液、純血清)孵育后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃共孵育2h，其中白蛋白濃度為40mg/ml，納米粒濃度為1mg/ml。

(三)流式細(xì)胞儀檢測(cè)以及Nanosight計(jì)數(shù)

將細(xì)胞300g離心10min，PBS洗三遍，將細(xì)胞重懸后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞吞噬，取上清液，稀釋適當(dāng)比例后用NTA NS300計(jì)數(shù)上清中剩余納米粒的量。流式細(xì)胞儀細(xì)胞吞噬結(jié)果見(jiàn)圖4所示，NTA NS300計(jì)數(shù)結(jié)果為表1。

實(shí)施例2分離檢測(cè)組織納米粒方法學(xué)考察

(一)熒光脂質(zhì)體的制備

取HSPC、Chol、DSPE-PEG2000儲(chǔ)備液質(zhì)量比為3：1：1，按脂質(zhì)質(zhì)量比1％加入DiI，用乙醇注入法制備脂質(zhì)體，PBS水合30min后，在60℃分別過(guò)200nm+100nm、80nm+50nm Nuclepore聚碳酸酯膜，各過(guò)13次，為防止熒光淬滅，制備過(guò)程避光。用DLS表征制備好的熒光脂質(zhì)體的粒徑，檢測(cè)結(jié)果如附圖2所示。

(二)組織中分離納米粒

將50mg腫瘤組織剪碎，分別加入50ul 6mg/ml、0.6mg/ml、0.06mg/ml熒光脂質(zhì)體混勻，加入750ul dispase溶液(濃度為2U/ml，U指的是一個(gè)蛋白酶活性單位)，37℃恒溫箱內(nèi)，靜止消化腫瘤組織4h，然后放入離心機(jī)中，通過(guò)梯度離心的方法分離熒光脂質(zhì)體，離心300g、10min去除完整細(xì)胞；取上清離心2000g、10min去除死細(xì)胞以及細(xì)胞碎片、血小板等；取上清，過(guò)qEV柱，得到樣品用NTA NS300檢測(cè)。

為考察處理過(guò)程對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，作為對(duì)照，不加腫瘤組織，分別將50ul 6mg/ml、0.6mg/ml、0.06mg/ml熒光脂質(zhì)體加入750ul dispase溶液，37℃恒溫箱內(nèi)，靜止4h，然后放入離心機(jī)中，通過(guò)梯度離心的方法分離熒光脂質(zhì)體，離心300g、10min，取上清離心2000g、10min，取上清，過(guò)qEV柱，得到樣品用NTA NS300檢測(cè)。

(三)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取分離好的樣品，去離子水稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，用Nanosight檢測(cè)，儀器參數(shù)設(shè)置為

粒子計(jì)數(shù)與濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5(腫瘤組織)、圖6(不加腫瘤組織)所示。

實(shí)施例3納米粒在腫瘤的分布檢測(cè)

(一)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將接種腫瘤的裸鼠隨機(jī)分為6組，其中一組作為空白對(duì)照，另外5組尾靜脈注射熒光標(biāo)記的脂質(zhì)體，分別在給藥后2h、6h、9h、12h、24h后處死小鼠，解剖后得到腫瘤組織。

(二)腫瘤組織中分離納米粒

分別稱取2h、6h、9h、12h、24h的腫瘤組織50mg，加入750ul dispase溶液(濃度為0.6U/ml，U指的是一個(gè)蛋白酶活性單位)，37℃恒溫箱內(nèi)，靜止消化腫瘤組織4h，然后放入離心機(jī)中，通過(guò)梯度離心的方法分離熒光脂質(zhì)體，離心300g、10min去除完整細(xì)胞；取上清離心2000g、10min去除死細(xì)胞以及細(xì)胞碎片、血小板等；取上清，過(guò)qEV柱，得到樣品檢測(cè)。為保證熒光脂質(zhì)體熒光的特性，整個(gè)過(guò)程都嚴(yán)格避光操作。

(三)用Nanosight檢測(cè)熒光脂質(zhì)體

將分離后的樣品，用去離子水稀釋到適宜倍數(shù)，用搭載532nm激光器的NTA300檢測(cè)，儀器參數(shù)設(shè)置為

NTA NS300檢測(cè)到組織中分離的納米粒粒徑如圖3所示，在腫瘤組織中分布隨時(shí)間變化曲線如圖7所示。

實(shí)施例4納米粒在肝臟組織中的分布檢測(cè)

(一)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將接種腫瘤的裸鼠隨機(jī)分為6組，其中一組作為空白對(duì)照，另外5組尾靜脈注射熒光標(biāo)記的脂質(zhì)體，分別在給藥后9h、12h、24h、48h后處死小鼠，解剖后得到肝臟組織。

(二)肝臟組織中分離納米粒

分別稱取9h、12h、24h、48h的腫瘤組織50mg，加入750ul dispase溶液(濃度為2.4U/ml，U指的是一個(gè)蛋白酶活性單位)，37℃恒溫箱內(nèi)，靜止消化腫瘤組織4h，然后放入離心機(jī)中，通過(guò)梯度離心的方法分離熒光脂質(zhì)體，離心300g、10min去除完整細(xì)胞；取上清離心2000g、10min去除死細(xì)胞以及細(xì)胞碎片、血小板等；取上清，過(guò)qEV柱，得到樣品檢測(cè)。為保證熒光脂質(zhì)體熒光的特性，整個(gè)過(guò)程都嚴(yán)格避光操作。

(三)用Nanosight檢測(cè)熒光脂質(zhì)體

將分離后的樣品，用去離子水稀釋到適宜倍數(shù)，用搭載532nm激光器的NTA300檢測(cè)，儀器參數(shù)設(shè)置為

納米粒在腫瘤組織中分布隨時(shí)間變化曲線如圖8所示。

上述實(shí)施例僅例示性說(shuō)明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。