本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，進(jìn)一步涉及一種單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)，以及應(yīng)用該檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測的方法。

背景技術(shù)：

癌癥是由細(xì)胞增殖、凋亡機(jī)制失常而引起的疾病，嚴(yán)重威脅人類生命健康，僅2012年全球新增約1400萬癌癥患者，約有820萬人死于癌癥。腫瘤異質(zhì)性是癌癥治療無法攻克的原因之一，即使是同一個(gè)體的腫瘤細(xì)胞之間也存在差異，故而單細(xì)胞分析在腫瘤異質(zhì)性的研究中起著重要作用。

蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體的重要物質(zhì)，具有催化功能、結(jié)構(gòu)功能，運(yùn)輸功能，貯存功能，運(yùn)動(dòng)功能，防御功能，調(diào)節(jié)功能，信息傳遞功能，遺傳調(diào)控功能等，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)著。其中細(xì)胞骨架蛋白是指真核細(xì)胞中的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)蛋白，腫瘤細(xì)胞中的骨架蛋白在結(jié)構(gòu)、組裝和分布上存在異常，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的過度繁殖、侵襲和遷徙。因此研究蛋白非常重要。

在細(xì)胞蛋白的研究中，傳統(tǒng)定量檢測手段為酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，其原理是采用抗原抗體特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量檢測，此技術(shù)可以評(píng)估群體細(xì)胞的蛋白情況。而流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)是單細(xì)胞蛋白分析的主要手段，其原理是通過熒光標(biāo)記待測蛋白實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞多參數(shù)、快速的定量分析，通過表面熒光分子濃度可控的校準(zhǔn)微球可以得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到蛋白濃度。

然而現(xiàn)有技術(shù)存在如下技術(shù)缺陷：

(1)ELISA只能檢測群體細(xì)胞的蛋白情況，不能對(duì)單細(xì)胞的蛋白進(jìn)行檢測；

(2)流式細(xì)胞儀中使用的校準(zhǔn)微球只能對(duì)細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行定量，而在校準(zhǔn)微球內(nèi)部進(jìn)行熒光分子定量修飾方法尚不成熟，無法使用傳統(tǒng)校準(zhǔn)微球方法進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白表達(dá)的定量檢測；

(3)已有一些基于微流控技術(shù)的單細(xì)胞蛋白檢測方法也存在弊端，如微型流式細(xì)胞術(shù)，微腔微孔序列等，前者缺少校準(zhǔn)手段，無法定量檢測蛋白；后者通量低，操作復(fù)雜。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

(一)要解決的技術(shù)問題

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)及其使用方法，以解決以上所述的至少一項(xiàng)技術(shù)問題。

(二)技術(shù)方案

根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)，包括微流控芯片模塊、熒光激發(fā)及檢測模塊，以及壓力控制模塊，其中，所述微流控芯片模塊包括一透明基底以及形成于所述基底上的壓縮通道，所述壓縮通道配置為其橫截面積小于待測細(xì)胞的橫截面積，以使細(xì)胞在壓力作用下變形擠過所述壓縮通道；所述熒光激發(fā)及檢測模塊，用于對(duì)進(jìn)入壓縮通道的細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測；所述壓力控制模塊用于提供所述壓力以使細(xì)胞變形通過壓縮通道。

優(yōu)選的，所述系統(tǒng)還包括中央控制模塊，分別與所述壓力控制模塊和熒光激發(fā)及檢測模塊連接，用于控制所述壓力控制模塊和熒光激發(fā)及檢測模塊，并且對(duì)檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

優(yōu)選的，所述壓縮通道在基底一側(cè)上還設(shè)置有一限光窗口，該窗口寬度小于細(xì)胞變形后的長度，以限定所述熒光激發(fā)及檢測模塊的接收光至限光窗口所在范圍內(nèi)。

優(yōu)選的，所述熒光激發(fā)及檢測模塊包含激發(fā)光產(chǎn)生單元與熒光檢測單元。

優(yōu)選的，所述激發(fā)光產(chǎn)生單元和熒光檢測單元共用光路，且光路與基底平面垂直；或者所述激發(fā)光產(chǎn)生單元產(chǎn)生的激發(fā)光光路位于基底平面，與熒光檢測單元的光路垂直。

優(yōu)選的，所述激發(fā)光產(chǎn)生單元包括激發(fā)光源，以激發(fā)待測細(xì)胞的熒光。

優(yōu)選的，所述熒光檢測單元包括光電倍增管(PMT)，以感應(yīng)所述細(xì)胞受激發(fā)后產(chǎn)生的熒光并放大。

優(yōu)選的，所述壓力控制模塊設(shè)置于所述壓縮通道的入口側(cè)，以增加進(jìn)入所述壓縮通道流體的壓力；或者所述壓力控制模塊設(shè)置于所述壓縮通道的出口側(cè)，以降低流出所述壓縮通道流體的壓力；或者所述壓力控制模塊同時(shí)設(shè)置于所述壓縮通道的入口側(cè)和出口側(cè)，以在入口側(cè)增加進(jìn)入所述壓縮通道流體的壓力，在出口側(cè)降低流出所述壓縮通道流體的壓力。

優(yōu)選的，所述壓縮通道的截面為梯形、圓形或者矩形。

優(yōu)選的，所述透明基底材料為玻璃或者石英。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種利用上述任意一種單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測的方法，包括步驟：

制備經(jīng)過免疫熒光試劑染色的細(xì)胞懸液；

在壓力控制模塊作用下，細(xì)胞懸液中的細(xì)胞通過微流控芯片模塊的壓縮通道；

在所述壓縮通道內(nèi)，細(xì)胞受激產(chǎn)生熒光，通過所述熒光激發(fā)及檢測模塊被逐一檢測；

通過檢測熒光亮度，并比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)亮度，得到單細(xì)胞蛋白含量。

優(yōu)選的，所述蛋白為骨架蛋白或者胞漿蛋白。

(三)有益效果

通過上述技術(shù)方案可得出本發(fā)明單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)及其使用方法具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明將微流控芯片技術(shù)與熒光檢測技術(shù)結(jié)合，提出一種基于壓縮通道的微型流式細(xì)胞術(shù)，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的高通量(高速)定量采集，為細(xì)胞生物特性的表征提供可靠的方法和途徑；

(2)本發(fā)明所使用的微流控芯片選取石英和聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)等材料基于微細(xì)加工方法，具有可批量化制造、一次性等特點(diǎn)；

(3)本發(fā)明需要的附屬設(shè)備為常規(guī)的倒置顯微鏡，光電倍增管(photomultiplier tube，PMT)和攝像頭，可以在傳統(tǒng)的生物實(shí)驗(yàn)室使用，具有可移植性高等優(yōu)勢。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方法總流程圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)設(shè)計(jì)示意圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)中微流控芯片制作流程圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)中微流控芯片制作過程圖。

圖5為應(yīng)用本實(shí)施例的單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)進(jìn)行單細(xì)胞骨架蛋白檢測流程圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例數(shù)據(jù)處理原理示意圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，并參照附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。下述參照附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的說明旨在對(duì)本發(fā)明的總體發(fā)明構(gòu)思進(jìn)行解釋，而不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的一種限制。

微流控技術(shù)是指在微觀尺寸下控制和檢測流體的技術(shù)，由于其特征尺寸與細(xì)胞大小相匹配，適合單細(xì)胞的操縱與表征。本發(fā)明實(shí)施例將微流控芯片技術(shù)與熒光檢測技術(shù)結(jié)合，提出一種基于壓縮通道的微型流式細(xì)胞術(shù)。將骨架蛋白被熒光特異性標(biāo)記的細(xì)胞在壓力作用下變形通過橫截面小于細(xì)胞橫截面的壓縮通道，此細(xì)胞被認(rèn)為可等效為一段溶液，通過檢測熒光亮度，并比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)亮度，即可得到單細(xì)胞蛋白含量。而校準(zhǔn)曲線可以通過直接在壓縮通道中通入不同濃度的熒光分子溶液得到。此方法可用來高通量定量檢測單細(xì)胞蛋白。

本發(fā)明實(shí)施例的具體實(shí)施情況如下：

本技術(shù)方法總流程包括系統(tǒng)設(shè)計(jì)(也即單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)的設(shè)計(jì))、芯片制作(也即單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)中微流控芯片的制備方法)以及單細(xì)胞骨架蛋白檢測(也即單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)的應(yīng)用)，其示意圖如圖1：

圖1為本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方法總流程圖

步驟1，系統(tǒng)設(shè)計(jì)：

圖2為本發(fā)明實(shí)施例單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)設(shè)計(jì)示意圖，整體單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)包括微流控芯片模塊、熒光激發(fā)及檢測模塊和壓力控制模塊。

微流控芯片的核心是基于聚二甲基硅氧烷的雙層壓縮通道，所述壓縮通道的橫截面積小于細(xì)胞的橫截面積，細(xì)胞在壓力的作用下變形擠過壓縮通道。芯片底部有阻光窗口，用于限定光面積。微流控芯片模塊包括一透明基底以及形成于所述基底上的壓縮通道，所述壓縮通道配置為其橫截面積小于待測細(xì)胞的橫截面積，以使細(xì)胞在壓力作用下變形擠過所述壓縮通道。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉，雙層通道的材料包括但不限于聚二甲基硅氧烷，還可以是其它能夠澆注后成型的材料；所述限光窗口的材料可以為金屬，在窗口上受激光以及熒光不能通過，而在窗口內(nèi)可以通過。

熒光激發(fā)及檢測模塊，熒光激發(fā)及檢測模塊包含激發(fā)光產(chǎn)生單元和熒光檢測單元。其中激發(fā)光產(chǎn)生單元包含激發(fā)光源，用于激發(fā)所述細(xì)胞，細(xì)胞受激發(fā)后產(chǎn)生熒光，然后通過熒光檢測單元進(jìn)行檢測。

其中，所述激發(fā)光產(chǎn)生單元和熒光檢測單元共用光路，且光路與基底平面垂直；或者所述激發(fā)光產(chǎn)生單元產(chǎn)生的激發(fā)光光路路位于基底平面，與熒光檢測單元的光路垂直。

所述熒光檢測單元包括光電倍增管(PMT)，以感應(yīng)所述細(xì)胞受激發(fā)后產(chǎn)生的熒光并放大。

熒光激發(fā)及檢測模塊以使特定波長的激發(fā)光分別激發(fā)細(xì)胞內(nèi)被熒光分子標(biāo)記的蛋白以及用于制定校準(zhǔn)曲線時(shí)使用的不同濃度抗體溶液后產(chǎn)生熒光，被光電倍增管(PMT)(作為熒光檢測單元)感應(yīng)放大并記錄。光源設(shè)置于所述透明基底上與壓縮溝道相對(duì)的一側(cè)，或者平行于基底平面，與檢測光路垂直，用于激發(fā)染色細(xì)胞。光電倍增管設(shè)置于所述透明基底上與壓縮通道相對(duì)的一側(cè)，用于對(duì)進(jìn)入壓縮通道的細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測。

壓力控制模塊，通過調(diào)節(jié)流體壓強(qiáng)，使單個(gè)細(xì)胞連續(xù)通過壓縮溝道內(nèi)的金屬窗口進(jìn)行檢測。壓力控制模塊用于提供壓力以使細(xì)胞變形通過壓縮通道。

單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)還可以包括中央控制平臺(tái)，基于自定義軟件實(shí)現(xiàn)各模塊的控制，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理與分析。該中央控制平臺(tái)用于連接和控制所述壓力控制模塊和熒光激發(fā)及檢測模塊，并且對(duì)檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

步驟2，芯片制作：

制作流程包括SU 8-5種子層的制作，SU 8-5壓縮通道層制作，SU 8-25細(xì)胞通道層制作，PDMS的澆注、翻模，鉻的濺射，AZ 1500掩膜的制作，鉻窗口的形成以及PDMS與石英的鍵合，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉，SU8-5、SU8-25以及AZ1500在本實(shí)施例中僅起到例示性作用，可以替代的選擇其它的負(fù)性光刻膠進(jìn)行制作。

為本發(fā)明實(shí)施例單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)中微流控芯片制作流程圖，流程包括：子步驟A2，SU 8-5種子層的制作：

載玻片在丙酮、乙醇和去離子水中依次清洗，烘干后表面均勻旋轉(zhuǎn)涂敷一層SU-8 5，曝光形成種子層。

子步驟B2，SU 8-5壓縮通道層制作：

種子層上再均勻涂敷一層SU 8-5，使用掩模板對(duì)準(zhǔn)曝光，見圖4中子圖A。

子步驟C2，SU 8-25細(xì)胞通道層制作：

在SU 8-5上均勻涂敷一層SU 8-25，使用掩模板對(duì)準(zhǔn)曝光，見圖4中子圖B；顯影，見圖4中子圖C。

子步驟D2，PDMS的澆注、翻模：

在陽模上澆注PDMS，見圖4中子圖D，經(jīng)固化、翻模得到有壓縮溝道的PDMS層，在溝道兩端打孔，見圖4中子圖E。

子步驟E2，鉻的濺射

石英片在丙酮、乙醇和去離子水中依次清洗，烘干后表面均勻?yàn)R射一層鉻，見圖4中子圖F。

子步驟F2，AZ 1500掩膜的制作

在濺射有鉻的石英片上均勻涂敷一層AZ 1500，放上掩模板對(duì)準(zhǔn)曝光，見圖4中子圖G；顯影，見圖4中子圖H。

子步驟G2，鉻窗口的形成

經(jīng)腐蝕處理后，被AZ 1500覆蓋的部分被保護(hù)，沒有AZ 1500的區(qū)域被腐蝕掉，最后將多余的AZ 1500洗掉，形成帶有鉻窗口的石英襯底，見圖4中子圖I。

子步驟H2，PDMS與石英的鍵合：

將PDMS器件清潔后，與石英片鍵合，形成器件，見子圖J。

步驟3.單細(xì)胞骨架蛋白檢測

應(yīng)用上述系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞檢測檢測，包括制備經(jīng)過免疫熒光試劑染色的細(xì)胞懸液；在壓力控制模塊作用下，細(xì)胞懸液中的細(xì)胞通過微流控芯片模塊的壓縮通道；在所述壓縮通道內(nèi)，細(xì)胞受激產(chǎn)生熒光，通過所述熒光激發(fā)及檢測模塊被逐一檢測；通過檢測熒光亮度，并比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)亮度，得到單細(xì)胞蛋白含量。

一般的，可以包括實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備，數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理三個(gè)步驟，其中實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備主要是準(zhǔn)備濃度為10⁶個(gè)/ml的經(jīng)過免疫熒光試劑染色的細(xì)胞懸液以及其他測量前的準(zhǔn)備工作，數(shù)據(jù)采集包括細(xì)胞信號(hào)檢測和校準(zhǔn)曲線繪制，前者是將已被熒光標(biāo)記骨架蛋白的細(xì)胞注入微流控器件入口，細(xì)胞在出口負(fù)壓作用下吸入壓縮通道，由于壓縮溝道橫截面小于細(xì)胞橫截面，處于變形狀態(tài)的細(xì)胞完全填充入壓縮通道，并在經(jīng)過鉻窗口時(shí)被PMT逐一檢測。后者是將已知濃度的熒光一抗試劑注入微流控器件入口，并使其充滿整個(gè)溝道，熒光信號(hào)通過鉻窗口后PMT檢測。數(shù)據(jù)處理是將在線測量的原始數(shù)據(jù)在軟件平臺(tái)進(jìn)行處理，并通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到單細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的濃度。

圖5應(yīng)用本實(shí)施例的單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)進(jìn)行單細(xì)胞骨架蛋白檢測流程圖，流程包括：

子步驟A3，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：

首先進(jìn)行樣本制備，主要是準(zhǔn)備濃度為10⁶個(gè)/ml的經(jīng)過免疫熒光試劑染色的細(xì)胞懸液。細(xì)胞采用免疫熒光染色方法，染色步驟與參數(shù)包括：

染色子步驟1：磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)制備細(xì)胞濃度為10⁶個(gè)/ml的細(xì)胞懸液100μl。

染色子步驟2：加入100μl4％多聚甲醛固定15分鐘；

染色子步驟3：用含有0.2％吐溫的PBS清洗3次，加入用PBS配置的含0.2％皂苷的透膜液100μl，透膜15分鐘；

染色子步驟4：用含有0.2％吐溫的PBS清洗3次，加入一抗：0.2％皂苷＝1∶100，4℃下避光保存過夜；

染色子步驟5：用含有0.2％吐溫的PBS清洗3次，上樣液重懸至細(xì)胞濃度為106個(gè)/ml。

熒光顯微鏡連接PMT和信號(hào)放大器，并將微流控器件裝載在顯微鏡載物臺(tái)上固定。檢查器件溝道完整后將壓縮通道部分中的鉻窗口移到視野中心位置。從微流控器件的出口注入上樣液填充器件溝道，除去溝道中的氣泡，將壓力控制器通過管子接入器件出口位置。

子步驟B3，數(shù)據(jù)采集

數(shù)據(jù)采集包括細(xì)胞信號(hào)檢測和校準(zhǔn)曲線繪制，前者是將已被熒光標(biāo)記骨架蛋白的細(xì)胞懸液通過注射器注入溝道入口，調(diào)節(jié)壓力控制器使細(xì)胞在出口負(fù)壓作用下被吸入壓縮通道，由于壓縮溝道橫截面小于細(xì)胞橫截面，處于變形狀態(tài)的細(xì)胞完全填充入壓縮通道，并在經(jīng)過鉻窗口時(shí)被PMT逐一檢測。后者是將已知一定濃度的熒光一抗試劑通過注射器注入溝道入口，并使其充滿整個(gè)溝道，熒光信號(hào)通過鉻窗口后被PMT檢測。

子步驟C3，數(shù)據(jù)處理：

數(shù)據(jù)處理是將對(duì)子步驟B3原始數(shù)據(jù)在軟件平臺(tái)進(jìn)行處理，細(xì)胞在壓縮溝道內(nèi)的長度L與鉻窗口寬度W的關(guān)系為：

其中是細(xì)胞完全填充如壓縮溝道后，從剛進(jìn)入鉻窗口到鉻窗口被細(xì)胞完全覆蓋的時(shí)間，t_上升對(duì)應(yīng)PMT收集到的信號(hào)上升時(shí)間。是細(xì)胞從鉻窗口被細(xì)胞完全覆蓋到細(xì)胞剛要離開隔窗口的時(shí)間，t_保持對(duì)應(yīng)PMT收集到的信號(hào)平臺(tái)時(shí)間(如圖6所示)。由此可以換算出細(xì)胞直徑大小。再根據(jù)由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的熒光信號(hào)與蛋白濃度的關(guān)系，可以得到單細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的濃度

此外，上述對(duì)各元件和方法的定義并不僅限于實(shí)施例中提到的各種具體結(jié)構(gòu)、形狀或方式，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可對(duì)其進(jìn)行簡單地更改或替換，例如：

(1)壓力驅(qū)動(dòng)部分不局限于出口用負(fù)壓抽，可以使用從入口泵入的正壓方式，還可以使用重力、電致驅(qū)動(dòng)等；

(2)細(xì)胞密度不局限于10⁶個(gè)/ml，可以用實(shí)驗(yàn)需求的細(xì)胞密度來代替；

(3)樣品處理部分的試劑類型，濃度，時(shí)間等條件均可以用其他合適的參數(shù)進(jìn)行替換；

(4)微流控器件中的壓縮通道截面不局限為矩形，可以替換為梯形，圓形等結(jié)構(gòu)溝道入口也不局限于圓形，可以替換為正方形、三角形等；

(5)檢測對(duì)象不限于骨架蛋白，也可以其他可以被熒光染色的胞漿蛋白；

(6)通過增加不同類型的配套濾光片以及PMT，可以同時(shí)檢測不同波段的熒光信號(hào)，做到多個(gè)蛋白的同時(shí)檢測；

(7)限定激發(fā)區(qū)域的窗口不限于金屬材料，也可以使用其他不透光材料，或者使用透鏡會(huì)聚激發(fā)光束；

(8)激發(fā)光路與熒光光路不限于特定角度。

至此，已經(jīng)結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述。依據(jù)以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)對(duì)本發(fā)明基于微流控技術(shù)的單細(xì)胞蛋白檢測系統(tǒng)有了清楚的認(rèn)識(shí)。

以上所述的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。