本發(fā)明涉及一種測(cè)量單分散上轉(zhuǎn)換納米熒光微粒壽命的裝置及方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，多種熒光材料和標(biāo)記方法的出現(xiàn)使得生物顯微成像技術(shù)迅速發(fā)展。其中，上轉(zhuǎn)換納米熒光材料(Up-conversion Nanoparticles，UCNPs)作為新一代生物發(fā)光標(biāo)記，受到了人們的廣泛關(guān)注。UCNPs使用近紅外激光作為激發(fā)光，可有效避免生物樣品自發(fā)熒光和散射光的干擾，在生物組織內(nèi)具有較深的穿透。其在長(zhǎng)時(shí)間激發(fā)光照射下發(fā)光依然非常穩(wěn)定，無(wú)閃爍，不易光解和光漂白。并且所選用的無(wú)機(jī)材料，化學(xué)穩(wěn)定性好、材料毒性低，在生物體內(nèi)不易形成聚集，因此在深度組織成像、活體小動(dòng)物成像以及腫瘤治療等領(lǐng)域都取得廣泛的應(yīng)用。

雖然UCNPs在生物醫(yī)學(xué)成像以及材料合成方面取得了很大的進(jìn)展，但是由于能級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其熒光發(fā)射過(guò)程尚且不是很清楚。熒光壽命是材料熒光特性的一個(gè)重要參數(shù)，表征了材料處于激發(fā)態(tài)的平均時(shí)間以及衰減到基態(tài)的途徑，并且熒光壽命也受到其所處環(huán)境特性的影響。因此通過(guò)熒光壽命的測(cè)量可以進(jìn)行熒光樣品微結(jié)構(gòu)及其微環(huán)境的研究。

UCNPs具有吸收多個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)光子發(fā)射出一個(gè)短波長(zhǎng)熒光光子的特點(diǎn)，但是其吸收截面比雙光子吸收高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)，主要是由于其熒光壽命較長(zhǎng)的原因。因此，定量測(cè)量和表征不同UCNPs的熒光壽命對(duì)改善其發(fā)光特性具有非常重要的作用。熒光壽命的測(cè)量方法從原理上可以分為兩種，分別是頻域法和時(shí)域法。頻域法通過(guò)調(diào)制激發(fā)光，然后測(cè)量熒光與激發(fā)光的相位差以及其解調(diào)系數(shù)來(lái)計(jì)算熒光壽命。而時(shí)域法則通過(guò)使用短脈沖激光激發(fā)熒光樣品，然后測(cè)量熒光的強(qiáng)度衰減曲線來(lái)計(jì)算熒光壽命。與頻域法相比，時(shí)域法更簡(jiǎn)單，其通過(guò)熒光衰減曲線直觀體現(xiàn)了熒光壽命，且分析方法也比頻域法更為簡(jiǎn)便。時(shí)域測(cè)量法中，時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)技術(shù)(Time-Correlated Single Photon Counting，TCSPC)作為主流方法，與掃描共聚焦顯微鏡結(jié)合緊密，具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高、系統(tǒng)誤差小、易于弱光檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。但是，由于UCNPs材料熒光壽命較長(zhǎng)，一般能達(dá)到數(shù)百微秒甚至毫秒量級(jí)，目前的TCSPC技術(shù)并不能對(duì)這一時(shí)間量級(jí)的熒光壽命進(jìn)行測(cè)量。同時(shí)，單分散狀態(tài)和聚集狀態(tài)的UCNPs材料由于微結(jié)構(gòu)和微環(huán)境的不同，導(dǎo)致其熒光壽命有差異，所以需要一種能夠?qū)畏稚顟B(tài)、長(zhǎng)熒光壽命的UCNPs材料進(jìn)行熒光壽命測(cè)量的裝置及方法亟待提出。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種測(cè)量單分散上轉(zhuǎn)換納米熒光微粒壽命的裝置及方法，對(duì)單分散狀態(tài)的UCNPs材料進(jìn)行了熒光成像和熒光壽命測(cè)量，使用時(shí)域法測(cè)量得到的數(shù)據(jù)直觀、處理簡(jiǎn)便。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種測(cè)量單分散上轉(zhuǎn)換納米熒光微粒壽命的裝置包括：雙光子顯微鏡組件以及電氣控制組件；雙光子顯微鏡組件包括：激光器、多個(gè)光學(xué)鏡、普克爾盒、二維振鏡掃描模塊以及光電倍增管，激光器發(fā)出光束，經(jīng)過(guò)光學(xué)鏡和普克爾盒后進(jìn)入二維振鏡掃描模塊對(duì)樣品進(jìn)行二維掃描，而樣品受激產(chǎn)生的熒光信號(hào)通過(guò)光電倍增管采集；電氣控制組件用于控制雙光子顯微鏡組件工作。

本發(fā)明一種測(cè)量單分散上轉(zhuǎn)換納米熒光微粒壽命的裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，對(duì)單分散狀態(tài)的UCNPs材料進(jìn)行了熒光成像和熒光壽命測(cè)量，使用時(shí)域法測(cè)量得到的數(shù)據(jù)直觀、處理簡(jiǎn)便。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，還可做如下改進(jìn)：

作為優(yōu)選的方案，多個(gè)光學(xué)鏡包括：1/2波片、偏振分束器以及1/4波片；激光器發(fā)出光束后經(jīng)過(guò)1/2波片和偏振分束器調(diào)節(jié)光強(qiáng)，再經(jīng)過(guò)1/4波片和普克爾盒后進(jìn)入二維振鏡掃描模塊對(duì)樣品進(jìn)行二維掃描。

采用上述優(yōu)選的方案，1/2波片和偏振分束器調(diào)節(jié)光強(qiáng)，1/4波片和普克爾盒實(shí)現(xiàn)對(duì)光束的高速開(kāi)關(guān)。

作為優(yōu)選的方案，樣品受激產(chǎn)生的熒光信號(hào)由物鏡收集后通過(guò)二向色鏡和濾色片后利用光電倍增管進(jìn)行采集。

采用上述優(yōu)選的方案，避免其他波段的熒光對(duì)實(shí)驗(yàn)造成影響。

作為優(yōu)選的方案，濾色片包括：低通濾色片和帶通濾色片。

采用上述優(yōu)選的方案，更好的避免其他波段的熒光對(duì)實(shí)驗(yàn)造成影響。

作為優(yōu)選的方案，二維振鏡掃描模塊包括：雙檢流計(jì)振鏡、掃描透鏡以及鏡筒透鏡。

采用上述優(yōu)選的方案，檢流計(jì)振鏡的偏轉(zhuǎn)角度與施加電壓成線性正比關(guān)系，因此可將激光光束聚焦到視場(chǎng)內(nèi)任意選擇的位置進(jìn)行熒光信號(hào)隨時(shí)間變化的測(cè)量。

作為優(yōu)選的方案，激光器發(fā)出780nm近紅外激光。

采用上述優(yōu)選的方案，效果更好。

作為優(yōu)選的方案，電氣控制組件包括：主控裝置、數(shù)據(jù)采集卡以及信號(hào)發(fā)生器，主控裝置分別與數(shù)據(jù)采集卡、信號(hào)發(fā)生器、普克爾盒、二維振鏡掃描模塊以及光電倍增管連接，信號(hào)發(fā)生器為主控裝置提供時(shí)鐘信號(hào)，主控裝置為數(shù)據(jù)采集卡、普克爾盒、二維振鏡掃描模塊以及光電倍增管提供觸發(fā)信號(hào)。

采用上述優(yōu)選的方案，電氣控制組件控制雙光子顯微鏡組件進(jìn)行工作。

一種測(cè)量單分散上轉(zhuǎn)換納米熒光微粒壽命的方法，利用測(cè)量單分散上轉(zhuǎn)換納米熒光微粒壽命的裝置進(jìn)行測(cè)量，具體包括以下步驟：

1)利用雙光子顯微鏡組件對(duì)樣品進(jìn)行掃描成像；

2)從成像結(jié)果中找到視場(chǎng)中存在的UCNPs材料所在準(zhǔn)確位置；

3)對(duì)找到的每個(gè)單分散的UCNPs的熒光強(qiáng)度分布進(jìn)行二維高斯擬合，從而找到其準(zhǔn)確的中心位置；

4)計(jì)算該中心位置對(duì)應(yīng)的檢流計(jì)振鏡的控制電壓；

5)通過(guò)輸出相應(yīng)電壓值將檢流計(jì)振鏡翻轉(zhuǎn)到特定角度，使光束能夠聚焦在玻片上對(duì)應(yīng)的單個(gè)納米熒光微粒的位置；

6)控制信號(hào)發(fā)生器發(fā)出一個(gè)單脈沖信號(hào)對(duì)普克爾盒進(jìn)行控制，利用普克爾盒對(duì)光束的脈沖進(jìn)行調(diào)制，用于激發(fā)出UCNPs材料的熒光信號(hào)；

7)信號(hào)發(fā)生器對(duì)普克爾盒發(fā)出單脈沖信號(hào)的同時(shí)，對(duì)主控制裝置也發(fā)出同步信號(hào)；

8)主控制裝置在同步信號(hào)的觸發(fā)下，控制數(shù)據(jù)采集卡開(kāi)始采集光電倍增管的電信號(hào)數(shù)據(jù)，采集到合適數(shù)量的數(shù)據(jù)點(diǎn)后停止采集；

9)重復(fù)步驟6)-8)，對(duì)同一納米熒光微粒采取N組數(shù)據(jù)，對(duì)N組數(shù)據(jù)進(jìn)行平均，得到該納米熒光微粒熒光發(fā)射的有效數(shù)據(jù)。

本發(fā)明一種測(cè)量單分散上轉(zhuǎn)換納米熒光微粒壽命的方法對(duì)單分散狀態(tài)的UCNPs材料進(jìn)行了熒光成像和熒光壽命測(cè)量，使用時(shí)域法測(cè)量得到的數(shù)據(jù)直觀、處理簡(jiǎn)便。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的雙光子顯微鏡組件的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的電氣控制組件的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的樣品掃描成像圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的單分散的UCNPs圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的熒光增長(zhǎng)和衰減的全過(guò)程圖。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例提供的熒光衰減曲線的擬合圖。

其中：1激光器、21/2波片、3偏振分束器、41/4波片、5普克爾盒、6反射鏡、7二維振鏡掃描模塊、71雙檢流計(jì)振鏡、72掃描透鏡、73鏡筒透鏡、8二向色鏡、9濾色片、10光電倍增管、11物鏡、12載物臺(tái)、13主控裝置、14數(shù)據(jù)采集卡、15信號(hào)發(fā)生器；

a、熒光強(qiáng)度曲線、b擬合得到的曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。

為了達(dá)到本發(fā)明的目的，一種測(cè)量單分散上轉(zhuǎn)換納米熒光微粒壽命的裝置的其中一些實(shí)施例中，

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種測(cè)量單分散上轉(zhuǎn)換納米熒光微粒壽命的裝置包括：雙光子顯微鏡組件以及電氣控制組件。

如圖1所示，雙光子顯微鏡組件包括：激光器1、1/2波片2、偏振分束器3、1/4波片4、普克爾盒5、反射鏡6、二維振鏡掃描模塊7、二向色鏡8、濾色片9、光電倍增管10以及物鏡11。二維振鏡掃描模塊7包括：雙檢流計(jì)振鏡71、掃描透鏡72以及鏡筒透鏡73。

激光器發(fā)出780nm近紅外激光。

激光器1發(fā)出光束后經(jīng)過(guò)1/2波片2和偏振分束器3調(diào)節(jié)到合適的光強(qiáng)，再經(jīng)過(guò)1/4波片4和普克爾盒5后通過(guò)反射鏡6反射進(jìn)入二維振鏡掃描模塊7對(duì)載物臺(tái)12上的樣品進(jìn)行二維掃描。

本實(shí)施例中使用60倍物鏡11，樣品受激產(chǎn)生的熒信號(hào)由同一物鏡12收集后通過(guò)二向色鏡8和濾色片9后用光電倍增管10采集信號(hào)。為了避免其他波段的熒光對(duì)實(shí)驗(yàn)造成影響，濾色片9包括一個(gè)680nm低通濾色片和一個(gè)500nm～550nm的帶通濾色片。由于檢流計(jì)振鏡71的偏轉(zhuǎn)角度與施加電壓成線性正比關(guān)系，因此可將激光光束聚焦到視場(chǎng)內(nèi)任意選擇的位置進(jìn)行熒光信號(hào)隨時(shí)間變化的測(cè)量。

如圖2所示，電氣控制組件包括：主控裝置13、數(shù)據(jù)采集卡14以及信號(hào)發(fā)生器15，主控裝置13分別與數(shù)據(jù)采集卡14、信號(hào)發(fā)生器15、普克爾盒5、二維振鏡掃描模塊7以及光電倍增管10連接，信號(hào)發(fā)生器15為主控裝置13提供時(shí)鐘信號(hào)，主控裝置13為數(shù)據(jù)采集卡15、普克爾盒5、二維振鏡掃描模塊7以及光電倍增管10提供觸發(fā)信號(hào)。

主控裝置13還與計(jì)算機(jī)連接，計(jì)算機(jī)與激光器1連接，計(jì)算機(jī)作為上位機(jī)，負(fù)責(zé)整個(gè)控制系統(tǒng)的控制及監(jiān)控，主控裝置13作為下位機(jī)，接收上位機(jī)的控制命令并解析控制指令，同步系統(tǒng)協(xié)調(diào)其他子單元工作。主控裝置13內(nèi)設(shè)有內(nèi)部同步控制器。二維振鏡掃描模塊7由雙檢流計(jì)振鏡71等構(gòu)成，主要實(shí)現(xiàn)聚焦激光對(duì)樣品面的逐點(diǎn)遍歷掃描。光電倍增管10實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)到電信號(hào)的轉(zhuǎn)換，數(shù)據(jù)采集卡15實(shí)現(xiàn)電信號(hào)的高速采集，計(jì)算機(jī)接收數(shù)據(jù)采集卡15采集的數(shù)據(jù)，進(jìn)行光電信號(hào)到圖像數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換，最終實(shí)時(shí)顯示掃描圖像。

一種測(cè)量單分散上轉(zhuǎn)換納米熒光微粒壽命的方法，利用測(cè)量單分散上轉(zhuǎn)換納米熒光微粒壽命的裝置進(jìn)行測(cè)量，具體包括以下步驟：

1)利用雙光子顯微鏡組件對(duì)樣品進(jìn)行掃描成像，如圖3所示；

2)從成像結(jié)果中找到視場(chǎng)中存在的UCNPs材料所在準(zhǔn)確位置，如圖所示，從成像結(jié)果中可以看出，熒光材料處于很好的分散狀態(tài)；

3)如圖3所示，對(duì)找到的每個(gè)單分散的UCNPs的熒光強(qiáng)度分布進(jìn)行二維高斯擬合，從而找到其準(zhǔn)確的中心位置；

4)計(jì)算該中心位置對(duì)應(yīng)的檢流計(jì)振鏡的控制電壓；

5)通過(guò)輸出相應(yīng)電壓值將檢流計(jì)振鏡翻轉(zhuǎn)到特定角度，使光束能夠聚焦在玻片上對(duì)應(yīng)的單個(gè)納米熒光微粒的位置；

6)控制信號(hào)發(fā)生器15發(fā)出一個(gè)單脈沖方波信號(hào)對(duì)普克爾盒5進(jìn)行控制，利用普克爾盒5的電光調(diào)制特性對(duì)光束的脈沖進(jìn)行調(diào)制，將激光調(diào)制為一個(gè)2KHz的單脈沖方波，用于激發(fā)出UCNPs材料的熒光信號(hào)；

7)信號(hào)發(fā)生器對(duì)普克爾盒發(fā)出單脈沖方波信號(hào)的同時(shí)，對(duì)主控制裝置13也發(fā)出同步信號(hào)；

8)主控制裝置13在同步信號(hào)的觸發(fā)下，控制數(shù)據(jù)采集卡14開(kāi)始采集光電倍增管10的電信號(hào)數(shù)據(jù)，采集到合適數(shù)量的數(shù)據(jù)點(diǎn)后停止采集；

9)重復(fù)步驟6)-8)，對(duì)同一納米熒光微粒采取10組數(shù)據(jù)，對(duì)10組數(shù)據(jù)進(jìn)行平均，得到該納米熒光微粒熒光發(fā)射的有效數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)采集卡14在最高采樣頻率5MHz的采樣速度下，一共采集15000個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)后停止采集數(shù)據(jù)，即數(shù)據(jù)的采集方式為觸發(fā)開(kāi)始，完成采集設(shè)定的數(shù)據(jù)后自動(dòng)停止。在脈沖激光的激發(fā)下，熒光材料發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度開(kāi)始迅速上升，在激光光信號(hào)關(guān)閉后開(kāi)始衰減。通過(guò)控制數(shù)據(jù)采集卡14采集合適的采樣點(diǎn)數(shù)，可以將熒光信號(hào)增長(zhǎng)和衰減的過(guò)程都記錄下來(lái)，以供后期的數(shù)據(jù)處理。對(duì)同一個(gè)熒光點(diǎn)重復(fù)采集10組數(shù)據(jù)后取平均，便得到該點(diǎn)熒光發(fā)射的有效數(shù)據(jù)。如圖5所示，圖5為熒光增長(zhǎng)和衰減的全過(guò)程。

由于熒光發(fā)射本身的隨機(jī)特性，單次測(cè)量的結(jié)果噪聲較大，所以需要對(duì)每個(gè)熒光微粒一共重復(fù)采集10組數(shù)據(jù)，并對(duì)這10組數(shù)據(jù)取平均。

本實(shí)施例中，使用的激發(fā)光脈沖為2kHz，即激光脈沖持續(xù)的時(shí)間為500μs，在500μs之后激發(fā)光即被關(guān)閉，熒光強(qiáng)度在此時(shí)便開(kāi)始衰減，所以就得到了熒光開(kāi)始衰減的準(zhǔn)確時(shí)間點(diǎn)。數(shù)據(jù)采集卡14的采樣頻率為5MHz，即每個(gè)采樣點(diǎn)的時(shí)間間隔為0.2μs，所以根據(jù)熒光開(kāi)始衰減的時(shí)間點(diǎn)計(jì)算，舍棄采集數(shù)據(jù)的前2500個(gè)點(diǎn)，即舍棄熒光強(qiáng)度的上升過(guò)程，并對(duì)余下的數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性最小二乘法的指數(shù)擬合。

曲線擬合的目的是利用數(shù)學(xué)模型來(lái)描述采集得到的數(shù)據(jù)，通過(guò)改變模型中的相關(guān)參數(shù)使計(jì)算衰減曲線N_c(t_k)與實(shí)際測(cè)得的衰減曲線N(t_k)盡可能符合，擬合的好壞可以用下式進(jìn)行評(píng)價(jià)：

${\mathrm{\χ}}^2=\underset{k=1}{\overset{n}{\Σ}}\frac{1}{{\mathrm{\σ}}_k^2}{\[N\left(t_k\right)-N_c\left(t_k\right)\]}^2$

其中，n為數(shù)據(jù)的組致，為第k個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的方差。由于我們所擬合的數(shù)據(jù)為1組，所以當(dāng)χ²值越接近于1時(shí)，擬合的結(jié)果就越理想。

通過(guò)使用上述理論進(jìn)行擬合，得到衰減曲線的擬合結(jié)果如圖6所示，a為熒光強(qiáng)度曲線，b為擬合得到的曲線。

本發(fā)明一種測(cè)量單分散上轉(zhuǎn)換納米熒光微粒壽命的方法對(duì)單分散狀態(tài)的UCNPs材料進(jìn)行了熒光成像和熒光壽命測(cè)量，使用時(shí)域法測(cè)量得到的數(shù)據(jù)直觀、處理簡(jiǎn)便。

以上的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。