本發(fā)明涉及一種佛手藥材氫核磁共振譜(¹H-NMR)的建立方法及指紋圖譜，屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

佛手(Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle)，別名枸櫞、枸櫞子、香泡，屬于蕓香科柑橘屬植物，主要分布于熱帶和亞熱帶，我國浙江、江西、福建、廣東、廣西、四川、云南等地均有栽培。佛手根據(jù)出產(chǎn)地不同可分為多個品種：產(chǎn)于廣東、廣西的藥用佛手稱為“廣佛手”；產(chǎn)于浙江金華的稱“金佛手”，產(chǎn)于四川等地稱“川佛手”。佛手具有較高藥用價值，藥理實驗表明其具有解痙、抑制中樞有、抗炎和抗過敏等作用；在臨床上廣佛手、川佛手和金佛手均入藥，然而在研究過程中，大量研究表明，不同產(chǎn)區(qū)、品種佛手化學(xué)成分差異明顯，會影響臨床療效。

隨著質(zhì)子核磁共振技術(shù)(Proton nuclear magnetic resonance，¹H-NMR)發(fā)展，¹H-NMR靈敏度逐步提高，核磁技術(shù)也隨之用于藥物分析中，且該法已被收載于2010年版《中國藥典》附錄中。¹H-NMR指紋譜與傳統(tǒng)HPLC指紋譜相比，可以直接提供結(jié)構(gòu)信息，無需標(biāo)準(zhǔn)品，無須復(fù)雜前處理和預(yù)分離，具有無損測試的特性。為了佛手藥材能夠進一步的得到充分利用，規(guī)范佛手藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證佛手藥材的質(zhì)量，解決佛手藥材質(zhì)量參差不齊的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種佛手氫核磁共振指紋圖譜的建立及其指紋圖譜和使用法，本發(fā)明通過建立佛手的氫核磁共振(¹H-NMR)指紋圖譜，為判別不同來源的佛手藥材及其質(zhì)量提供依據(jù)。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種佛手氫核磁共振指紋圖譜的建立方法，包括如下步驟：

1)、配置樣品溶液：

將作為供試樣本的干佛手(含水率≤2％)粉碎后過60目篩，稱取(精密稱取)佛手樣品粉末8g，加95％(體積濃度)乙醇300mL；進行超聲提取2次(超聲工藝的參數(shù)為：超聲波功率為400W，溫度為30℃)；每次0.8～1.2h(較佳為1h)，合并提取液后過濾，所得濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(控制蒸發(fā)溫度為50℃)旋干溶劑(即，95％乙醇)，得粗浸膏(約為800mg)；

取20mg上述粗浸膏溶解于0.5mL氘代的二甲基亞砜(DMSO-d₆)中，作為供試樣品溶液；

2)、¹H-NMR測試：

利用核磁共振儀(NMR譜儀)采用zg30脈沖序列采集上述供試樣品溶液的¹H-NMR：

測定溫度298K(25℃)，觀測頻率600.13MHz，譜寬5101.1Hz，采樣數(shù)據(jù)點65536，掃描次數(shù)4次，TMS(四甲基硅烷)為內(nèi)標(biāo)；從而獲得供試樣品的氫譜數(shù)據(jù)；

將上述氫譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件(例如為MetresNova軟件)后，獲得供試樣品的¹H-NMR指紋圖譜。

作為本發(fā)明的佛手氫核磁共振指紋圖譜的建立方法的改進：

將所得的¹H-NMR指紋圖譜進行如下2種圖譜處理方式的至少一種：

方式一、分段積分法：將所得的供試樣品的¹H-NMR指紋圖譜應(yīng)用MetresNova軟件進行分段積分，選擇δ0.70～8.14范圍的¹H-NMR圖并以每δ0.04作為1個單位進行分段積分，得到各化學(xué)位移段與之相對應(yīng)的信號峰面積值，以ASCII格式輸出數(shù)據(jù)；

將每個供試樣本的扣除水峰信號和DMSO溶劑峰信號后的所有段的積分以及供試樣本的個數(shù)進行數(shù)據(jù)矩陣；根據(jù)相似度計算原理，利用Excel 2007軟件進行相似度分析，導(dǎo)入SPSS軟件進行聚類分析；

方式二、共有峰積分法：

將所得的供試樣品的¹H-NMR指紋圖譜中不重疊的質(zhì)子信號峰作為共有峰，計算積分面積，所得的共有峰面積值，導(dǎo)入SPSS軟件進行主成分分析(PCA)。

作為本發(fā)明的佛手氫核磁共振指紋圖譜的建立方法的進一步改進：

所述步驟1)中，7個供試樣本干佛手的產(chǎn)地分別是：廣東肇慶、廣西桂林、金華赤松鎮(zhèn)、金華羅店鎮(zhèn)、四川樂山、四川蘆山、重慶江津；

所述步驟3)：

方法一的分段積分法，共劃分183積分段；

方法二的共有峰積分法，選取供試樣品的¹H-NMR圖譜中不重疊的20個質(zhì)子信號峰作為共有峰，計算積分面積，積分區(qū)間如下：

獲得20個共有峰面積值，導(dǎo)入SPSS軟件進行PCA分析。

本發(fā)明還同時提供了利用上述方法建立的佛手氫核磁共振指紋圖譜進行佛手品種/品質(zhì)的判斷法：

以所得的金佛手或川佛手氫譜數(shù)據(jù)為對照，分段積分法對待檢樣品所得氫譜數(shù)據(jù)經(jīng)相似度分析(可利用Excel 2007軟件)得到的相關(guān)系數(shù)≥0.95且經(jīng)SPSS軟件進行聚類分析聚為一類的，則待檢佛手樣品為金佛手或川佛手；

以所得的廣佛手氫譜數(shù)據(jù)為對照，分段積分法對待檢樣品所得氫譜數(shù)據(jù)經(jīng)相似度分析(可利用Excel 2007軟件)得到的相關(guān)系數(shù)≥0.95且經(jīng)SPSS軟件進行聚類分析聚為一類的，則待檢佛手樣品為廣佛手。

作為本發(fā)明的佛手品質(zhì)的判斷法的改進：

PCA分析結(jié)果為：9個共有峰δ2.870～2.910、δ3.000～3.050、δ3.050～3.090、δ4.250～4.290、δ6.200～6.260、δ6.570～6.630、δ8.000～8.030、δ3.240～3.260和δ3.090～3.140的峰面積相對大的，佛手質(zhì)量相對好。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：

本發(fā)明建立佛手的氫核磁共振(¹H-NMR)指紋圖譜，為判別不同來源的佛手藥材及其質(zhì)量提供依據(jù)。利用核磁共振儀測定不同產(chǎn)地的佛手，將所得自由衰減信號導(dǎo)入MestReNova軟件進行分段積分，NMR數(shù)據(jù)經(jīng)分段積分處理后分別進行相似度法、聚類分析和主成分分析法評價。結(jié)果顯示金佛手和川佛手的相關(guān)系數(shù)均在0.95以上，而與廣佛手的相似度較低，相關(guān)系數(shù)均在0.86以下；金佛手和川佛手中的檸檬內(nèi)酯相對含量要比廣佛手多；聚類分析結(jié)果也說明廣佛手與金佛手及川佛手能夠明顯分開，而金佛手與川佛手比較相似；主成分分析得到四個主成分，其累計貢獻率達到95.430％，第一主成分主要與δ2.870～2.910、δ3.000～3.050、δ3.050～3.090、δ4.250～4.290、δ6.200～6.260、δ6.570～6.630等六個積分段峰高度正相關(guān)，第2主成分主要反映檸檬內(nèi)酯H-4峰(δ8.000～8.030)的信息，第3和第4主成分因子分別反映δ3.240～3.260和δ3.090～3.140峰的信息。該方法可以快速簡便地區(qū)分不同品種的佛手，可為佛手的質(zhì)量控制及使用提供參考。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細(xì)說明。

圖1_(a)為7批不同來源佛手樣品溶液的典型¹H-NMR指紋圖譜；

_(b)δ7.5～8.5局部放大圖；

A.廣東肇慶；B.廣西桂林；C.金華赤松鎮(zhèn)；D.金華羅店鎮(zhèn)；E.四川樂山；F.四川蘆山；G.重慶江津；H.檸檬內(nèi)酯。

圖2是檸檬內(nèi)酯的分子結(jié)構(gòu)式。

圖3是聚類分析樹狀圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。為能進一步了解本發(fā)明的特征、技術(shù)手段以及所達到的具體目的、功能，解析本發(fā)明的優(yōu)點與精神，藉由以下結(jié)合附圖與具體實施方式對本發(fā)明的詳述得到進一步的了解。

實施例1、

1實驗部分

1.1主要儀器、試劑及材料

主要儀器：Bruker AVANCE III 600型超導(dǎo)傅立葉變換NMR譜儀(瑞士Bruker公司)；AS7240B型超聲器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；BSl24S型1/1萬電子天平(德國Sartorius)；RZ-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮)；

主要試劑和材料：蒸餾水，95％乙醇(分析純，北京化工廠)，DMSO-d₆(Cambridge Isotope公司)。不同產(chǎn)地的佛手(參見表1)。

1.2供試樣品溶液的配置

供試樣本干佛手(含水率≤2％)粉碎后過60目篩，精密稱取佛手樣品粉末8g，加95％乙醇300mL；進行超聲提取2次(超聲工藝的參數(shù)為：超聲波功率為400W，溫度為30℃)，每次1h，合并提取液后過濾得濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(控制蒸發(fā)溫度為50℃)旋干溶劑，得粗浸膏(約為800mg)。取20mg上述粗浸膏，溶解于0.5mL氘代的二甲基亞砜(DMSO-d₆)中。

1.3 ¹H-NMR測試條件

利用核磁共振儀(NMR譜儀)采用zg30脈沖序列采集1.2制備的供試樣品溶液的¹H-NMR圖譜。

測定溫度298K(25℃)，觀測頻率600.13MHz，譜寬5101.1Hz，采樣數(shù)據(jù)點65536，掃描次數(shù)4次，四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)。從而獲得供試樣品的氫譜數(shù)據(jù)；

將上述氫譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件(例如為MetresNova軟件)后，具體為：將經(jīng)NMR儀檢測得到的¹H-NMR自由衰減(FID)信號導(dǎo)入MestReNova軟件進行自動傅立葉轉(zhuǎn)換，手動調(diào)整相位與基線，以內(nèi)標(biāo)物TMS為基準(zhǔn)校正化學(xué)位移，即獲得供試樣品的¹H-NMR指紋圖譜。如圖1所示。

1.4 ¹H-NMR圖譜處理

分段積分法：應(yīng)用MetresNova軟件進行分段積分，選擇δ0.70～8.14范圍的¹H-NMR圖并以每δ0.04作為1個單位進行分段積分，得到各化學(xué)位移段與之相對應(yīng)的信號峰面積值，以ASCII格式輸出數(shù)據(jù)；本試驗共獲得183段積分(扣除水峰信號δ3.26～3.34和DMSO溶劑峰信號δ2.50～2.54)。將獲得的數(shù)據(jù)矩陣(183個變量×7個樣品)，根據(jù)相似度計算原理，利用Excel 2007軟件進行相似度分析，導(dǎo)入SPSS軟件進行聚類分析。

備注說明：上述7個樣品的產(chǎn)地分別是：A.廣東肇慶；B.廣西桂林；C.金華赤松鎮(zhèn)；D.金華羅店鎮(zhèn)；E.四川樂山；F.四川蘆山；G.重慶江津；

共有峰積分法：選取圖1中不重疊的20個質(zhì)子信號峰作為共有峰，計算積分面積，積分區(qū)間見表3，獲得20個共有峰面積值，導(dǎo)入SPSS軟件進行PCA分析。

1.5方法學(xué)考察

1.5.1精密度試驗

取同一份佛手供試樣品溶液(按照1.2制備而得)，在上述¹H-NMR按1.3項測試條件下連續(xù)6次測定指紋圖譜，用MetresNova軟件處理圖譜，采用1.4項下的積分方法得到一系列相對峰面積積分值。計算6組數(shù)據(jù)之間的相關(guān)系數(shù)，分析儀器精密度。分段積分法計算相似系數(shù)結(jié)果均在0.99以上，表明儀器是精準(zhǔn)的。

1.5.2重復(fù)性試驗

按1.2項方法下配置同一批次佛手供試樣品溶液6份，按1.3項下條件測試¹H-NMR指紋圖譜，用1.4項下方法處理圖譜，計算6組數(shù)據(jù)相對峰面積積分值之間的相關(guān)系數(shù)，考察其重復(fù)性情況。相似系數(shù)計算結(jié)果均在0.99以上，表明該方法的重復(fù)性良好。

1.5.3穩(wěn)定性試驗

取同一份佛手供試樣品溶液，分別在0、1、2、3、4、5d按1.3項下條件測試¹H-NMR指紋圖譜，用1.4項下計算6組數(shù)據(jù)相對峰面積積分值之間的相關(guān)系數(shù)，相似系數(shù)計算結(jié)果均在0.99以上，表明供試樣品溶液在6d內(nèi)穩(wěn)定。

2結(jié)果與分析

2.1 ¹H-NMR指紋圖譜

通過MetresNova軟件處理圖譜后可得到7批佛手樣品的¹H-NMR指紋圖譜(圖1)。通過直觀分析，可以看到廣佛手(廣東肇慶、.廣西桂林)、金佛手(金華赤松鎮(zhèn)、.金華羅店鎮(zhèn))、川佛手(四川樂山、四川蘆山、重慶江津)等3個不同品種佛手提取物¹H-NMR的輪廓大致相同，均含有黃酮類、糖類、有機酸類和脂肪酸類成分。但不同基原的一些信號峰的強度存在著一定差異，如在δ3.3～3.6的區(qū)域中，廣佛手在該區(qū)域中的信號峰強度明顯弱于其他2個品種，表明3個基原品種間的化學(xué)成分含量有一定的差異。

已有研究表明檸檬內(nèi)酯(又稱檸檬油素)(參見圖2)在佛手藥材中含量較高，是金佛手、廣佛手和川佛手中的一個主要的次級代謝產(chǎn)物，并且現(xiàn)代藥理實驗證明檸檬內(nèi)酯為佛手藥材的主要有效成分之一，所以可將檸檬油素作為佛手藥材質(zhì)量評價的指標(biāo)之一，本發(fā)明從金佛手提取物中分離出該化合物，其氫譜圖參見圖1，具體的氫譜數(shù)據(jù)如下：¹H-NMR(DMSO-d₆，600.13MHz)δ：8.02(1H，d，J＝9.7Hz，H-4)，6.53(1H，d，J＝2.1Hz，H-6)，6.20(1H，d，J＝9.7Hz，H-3)，6.62(1H，d，J＝2.1Hz，H-8)，3.87和3.91(各3H，s，OCH3×2)，其波譜數(shù)據(jù)與文獻基本一致，可以鑒定該化合物為5，7一二甲基香豆素(檸檬內(nèi)酯)。在¹H-NMR中，共振峰面積或峰高與產(chǎn)生該共振峰的質(zhì)子數(shù)成正比，這是定量的依據(jù)，可利用特征峰相對含量法對成分的含量進行宏觀分析。在檸檬內(nèi)酯氫譜中，檸檬內(nèi)酯的H-4(δ8.02)峰達到基線分離且兩側(cè)基線平坦(參見圖1b)，不受其他信號干擾，符合定量原則，因此，選定δ8.02峰為檸檬內(nèi)酯相對含量的定量峰，從圖中可直觀看出金佛手和川佛手中的檸檬內(nèi)酯相對含量要比廣佛手多。

2.2統(tǒng)計分析

2.2.1相似度評價

7批不同來源的佛手藥材按照1.2項下的方法制備成供試樣品溶液，采用1.3項下的條件測試上面樣品的氫譜，采用分段積分法進行處理¹H-NMR指紋圖譜，對獲得的NMR積分面積數(shù)據(jù)矩陣進行相似度計算。

選擇金華赤松鎮(zhèn)佛手的圖譜作為對照指紋圖譜，計算7批樣品的相關(guān)系數(shù)值，結(jié)果顯示金華赤松鎮(zhèn)佛手與金華羅店鎮(zhèn)佛手及3個川佛手的相關(guān)系數(shù)均在0.9529～0.9981間(參見表1)，而金華羅店鎮(zhèn)佛手與2個廣佛手的相似度較低，相似度為0.7969～0.8581，提示金佛手與川佛手的化學(xué)成分非常相似，而金佛手與廣佛手的化學(xué)成分存在一定差異。

表1、7批佛手的來源產(chǎn)地和相似度評價結(jié)果(Sample source and the similarity of 7batches raw materials of Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle)

2.2.2聚類分析和主成分分析評價

2.2.2.1聚類分析

采用分段積分法，以不同產(chǎn)地佛手藥材的峰面積積分值歸一化后為原始數(shù)據(jù)，SPSS19.0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)，以夾角余弦為樣品相似度的距離公式，聚類分析結(jié)果見圖3。由圖3可知，佛手藥材被分為2大類，一類包括廣佛手A(廣東肇慶)和B(廣西桂林)；另外一類類包括金佛手C(金華赤松鎮(zhèn))、D(金華羅店鎮(zhèn))和川佛手E(四川樂山)、F(四川蘆山)、G(重慶江津)。因此，通過聚類分析得到的各產(chǎn)地佛手之間的相關(guān)性與相似度分析的結(jié)果一致，它們之間相互驗證。

2.1.2.2 ¹H-NMR共有峰主成分分析

主成分分析法是一種應(yīng)用廣泛的多元統(tǒng)計方法，用于簡化數(shù)據(jù)，快速實現(xiàn)模式或關(guān)系的可視化識別。SPSS19.0軟件對原始數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以主成分的特征值及貢獻率為依據(jù)，對7個不同產(chǎn)地佛手藥材的20個共有峰進行主成分分析，結(jié)果見表2和表3。

表2、抽取的主成分特征值及貢獻率(The characteristic value and contribution of principal components)

表3、主成分因子載荷矩陣(Loading matrix of principal component factor)

由表2可知，主成分個數(shù)的提取原則為其對應(yīng)的特征值大于1，故取前4個作為主成分，其累計貢獻率達到95.43％，它代表了所研究譜峰的95.43％的信息量。其中，第一主成分特征值為11.281，貢獻率為56.406％，是佛手藥材最重要的成分群。由表3可以看出，第1主成分因子與3～5、15、18、19號特征峰高度正相關(guān)，提示δ2.870～2.910、δ3.000～3.050、δ3.050～3.090、δ4.250～4.290、δ6.200～6.260、δ6.570～6.630這六個積分段峰對不同樣品的區(qū)分評價貢獻較大；第2主成分因子與20號特征峰高度正相關(guān)，說明第2主成分反映的主要是δ8.000～8.030峰的信息，即第2主成分主要反映檸檬內(nèi)酯H-4峰(參見圖2)的信息；第3和第4主成分因子分別與7號和6號特征峰高度正相關(guān)，提示它們分別反映δ3.240～3.260和δ3.090～3.140峰的信息。上述高度正相關(guān)的特征峰在佛手藥材的質(zhì)量控制中有相對重要的作用。

綜上所述，運用聚類分析和主成分分析，可實現(xiàn)快速分析，發(fā)揮各自優(yōu)勢，互相驗證和補充，多角度綜合評判佛手藥材的質(zhì)量。

實施例2、將事先已知產(chǎn)地的如下3種佛手：佛手①(產(chǎn)地為金華赤松鎮(zhèn))、佛手②(產(chǎn)地為四川樂山)、佛手③(產(chǎn)地為廣東肇慶)，按照實施例1的步驟1.2～步驟1.4進行檢測，

所得結(jié)果分別為：佛手①和佛手②相關(guān)系數(shù)為0.96，聚類分析歸為一類；佛手③歸為另外一類。

將上述結(jié)果與實施例1步驟2.2所得的相似度評價和聚類分析結(jié)果進行比對，比對所得結(jié)果為：佛手①和佛手②為金佛手或川佛手；佛手③為廣佛手。

依據(jù)上述比對結(jié)果，我們得知：采用本發(fā)明的方法可有效對金佛手或川佛手與廣佛手進行區(qū)分。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。