本發(fā)明屬于分子識(shí)別技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種SERS(表面增強(qiáng)拉曼散射光譜)基底的制備方法，還涉及一種基于無等離子體共振的氧化鈦SERS光譜測試方法。

背景技術(shù)：

表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering，簡稱為SERS)以其高靈敏性、高選擇性、無損分析、可在自然環(huán)境下監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。SERS基底是獲得表面增強(qiáng)信號(hào)的必要前提，為使其成為一種更為安全穩(wěn)定的生物檢測材料，因此需要選擇無毒、穩(wěn)定性強(qiáng)、生物相容性良好的材料作為SERS基底。基底應(yīng)具有可再生性、均一、廉價(jià)、易于制備等特點(diǎn)，且具有良好的SERS活性。常用的貴重金屬基底(金或銀)存在造價(jià)昂貴、生物相容性差、適用面窄等缺點(diǎn)。半導(dǎo)體的SERS研究具有重要的理論和實(shí)際意義，因其具有高的生物相容性、水溶液中的穩(wěn)定性以及對(duì)分析物選擇性增強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在表面增強(qiáng)拉曼基底領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究旨在解決活性基底匱乏的限制，從而發(fā)展新型的SERS活性基底，進(jìn)一步拓寬拉曼光譜的實(shí)用性。

在眾多的半導(dǎo)體氧化物中，TiO₂納米粒子以其結(jié)構(gòu)和化學(xué)性能穩(wěn)定、抗光腐蝕、耐酸堿性、來源豐富且對(duì)生物體無毒等優(yōu)點(diǎn)多被選做SERS基底。但TiO₂作為SERS基底，仍然面臨著靈敏度差、影響因子低于貴重金屬的缺點(diǎn)。趙冰課題組采用半導(dǎo)體氧化鈦?zhàn)鳛镾ERS基底展開了研究，但增強(qiáng)效果仍遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)貴金屬基底。為了獲得更為優(yōu)異的信號(hào)增強(qiáng)效果，研究者們?cè)O(shè)計(jì)了形式多樣的氧化鈦?zhàn)鳛樵鰪?qiáng)基底。例如：雙晶結(jié)構(gòu)的氧化鈦、TiO₂光子微陣列、TiO₂殼層諧振器等。華東理工大學(xué)張金龍教授最近在JACS報(bào)道了通過溶膠凝膠法制備出多孔、大表面積的納米氧化鈦，利用光的多次折射反射，使其增強(qiáng)因子達(dá)到10000以上，但存在著需要用模板制備、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。因此，探索新型、制備簡單、高性能的非金屬基底一直是SERS技術(shù)中最重要的研究熱點(diǎn)之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用無等離子體共振的氧化鈦基底進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜測試的方法，該方法具有操作快速、簡單、檢測靈敏度高、成本低廉、信號(hào)一致性好、易于規(guī)?；葍?yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的另一目的是提供一種制備無等離子體共振的氧化鈦SERS基底的方法。

本發(fā)明的目的可以通過以下措施達(dá)到：

一種利用無等離子體共振的氧化鈦基底進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜測試的方法，其包括如下步驟：

1)將鈦源和堿金屬化合物混合，于100～1000℃下燒結(jié)，燒結(jié)得到的材料在水中分散后進(jìn)行酸洗，然后分離出固體；進(jìn)行水洗和干燥，最后于100～900℃下進(jìn)行熱處理，最終得到無等離子體共振的氧化鈦SERS基底材料

2)將探針分子均勻吸附在所述無等離子體共振的氧化鈦SERS基底材料表面上，在檢測激發(fā)光源作用下進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜測試。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種制備無等離子體共振的氧化鈦SERS基底的方法：將鈦源和堿金屬化合物混合，于100～1000℃下燒結(jié)，燒結(jié)得到的材料在水中分散后進(jìn)行酸洗，然后分離出固體進(jìn)行水洗和干燥，最后于100～900℃下進(jìn)行熱處理，得到能夠應(yīng)用于表面增強(qiáng)拉曼光譜測試的無等離子體共振的氧化鈦SERS基底材料。

本發(fā)明中的鈦源可選自四氯化鈦、硫酸鈦、氧化鈦、鈦酸鈉、偏鈦酸、鈦酸鋇、鈦酸鉀、鈦酸四丁酯、鈦酸異丙酯、鈦酸鍶、鈦酸鋰、鈦酸鎂或前述材料對(duì)應(yīng)的結(jié)晶水合物中的至少一種。

本發(fā)明中的堿金屬化合物選自硼酸鋰、硼酸鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈉、碳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化銫、過氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、硝酸銣、氯化銫、氯化銣或前述材料對(duì)應(yīng)的結(jié)晶水合物中的至少一種。

本發(fā)明中的鈦源和堿金屬化合物的用量分別以二氧化鈦和堿金屬氧化物計(jì)，其摩爾比為0.1～20：1，優(yōu)選1～10：1。

本方法中鈦源和堿金屬化合物可通過直接混合、捏合、加水或其他溶劑形成漿體后干燥除溶等多種方式混合。

本發(fā)明中的燒結(jié)溫度范圍為100～1000℃，優(yōu)選為850～1000℃，，達(dá)到燒結(jié)溫度后保溫1～24h,燒結(jié)時(shí)的升溫速率為1～20℃/min。

經(jīng)過燒結(jié)后得到的鈦酸鹽需進(jìn)一步在酸性質(zhì)子溶劑環(huán)境下進(jìn)行浸漬等處理得到鈦酸。例如：燒結(jié)得到的材料在水中分散后加酸進(jìn)行浸漬酸洗，然后分離出固體進(jìn)行水洗和干燥，得到鈦酸。

浸漬得到的鈦酸選自二鈦酸、三鈦酸、四鈦酸、六鈦酸、八鈦酸或無定形鈦酸中的至少一種。

酸洗中的酸可選自甲酸、乙酸、鹽酸、草酸、硫酸、硝酸、氫碘酸、高氯酸、氯酸中的至少一種。酸洗中燒結(jié)得到的材料與酸的固液比為1g/L～100g/L；所述酸的pH值為1～6，優(yōu)選2～4；所述浸漬時(shí)間為1～24h。用酸度計(jì)控制溶液的pH值，使pH在2-4范圍內(nèi)變化。離子選擇性電極實(shí)時(shí)測定液相中K⁺離子的浸出量。當(dāng)K⁺離子的浸出量基本不變化時(shí)，即達(dá)到平衡。

酸洗后通過過濾或離心等方法分離出固體，分離出的固體進(jìn)一步水洗至中性，然后在飽和氯化鈉溶液氣氛中干燥到恒重。

本發(fā)明的熱處理的溫度為100～900℃，優(yōu)選500～800℃，達(dá)到熱處理溫度后保溫1～48h，達(dá)到熱處理前的加熱速率為1～30℃/min。

本發(fā)明中的探針分子選自亞甲基藍(lán)、巰基苯甲酸、羅丹明B、羅丹明R6G、吡啶或細(xì)胞色素C。

本發(fā)明中表面增強(qiáng)拉曼光譜測試方法可按現(xiàn)有技術(shù)中通用的測試方法進(jìn)行，本法中的檢測激發(fā)光源波長是300～1000nm，具體可根據(jù)探針分子的性質(zhì)以及探針分子與基底材料的相互影響程度進(jìn)行選擇。

在表面增強(qiáng)拉曼光譜測試前需先將探針分子均勻吸附在基底材料表面，一種方法為：將探針分子溶解于溶劑或緩沖溶液中得到探針分子溶液，將氧化鈦SERS基底材料與探針分子溶液混合吸附后離心并洗滌，低溫干燥，得到表面吸附探針分子的氧化鈦。

一種具體的吸附方法為：用KH₂PO₄和Na₂HPO₄·12H₂O配制成1/15M濃度的pH＝7.4的PBS緩沖液。稱取一定量的探針分子粉末，分別將其溶解PBS緩沖液中，超聲5min，得到探針分子溶液，并分別稀釋到相應(yīng)濃度。采用微量進(jìn)樣器吸取探針分子溶液滴加到相應(yīng)的氧化鈦基底上，并用蓋玻片蓋住，然后在4℃條件下干燥一段時(shí)間后，得到進(jìn)行拉曼測試的表面吸附探針分子的氧化鈦。

另一種具體的吸附方法為：將氧化鈦溶解在由PBS稀釋的探針分子溶液中，將混合溶液在37℃下恒溫保持2h。然后在4 000r/s的速度下離心10min。去離子水洗3次。離心的目的是洗去氧化鈦表面物理吸附的探針分子。此時(shí)，得到了表面吸附探針分子的氧化鈦，進(jìn)行拉曼測試。

本發(fā)明通過借助氧化鈦或吸附分子在可見光照射下會(huì)發(fā)生電子轉(zhuǎn)移的特性，從而增強(qiáng)表面增強(qiáng)拉曼散射信號(hào)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)氧化鈦晶須增強(qiáng)效果明顯優(yōu)于商業(yè)氧化鈦P25。通過改變混料比、燒結(jié)溫度、離子交換PH、熱處理溫度，水合條件來探索對(duì)增強(qiáng)效果的影響。本發(fā)明的SERS基底易于制備、成本低、結(jié)構(gòu)易控和適于生物醫(yī)學(xué)檢測等優(yōu)點(diǎn)，在拉曼檢測中可增強(qiáng)被檢測分子的拉曼信號(hào)10⁴倍。

與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明有以下突出的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果：

1)本發(fā)明的氧化鈦晶須制備方法簡單、方便，原材料價(jià)格低廉，且具有良好的生物相容性。

2)本發(fā)明與原來的貴重金屬基底相比，具有耐酸堿性、來源豐富且對(duì)生物體無毒等優(yōu)點(diǎn)。

3)本發(fā)明拓寬了SERS技術(shù)的應(yīng)用范圍，為真正能使SERS能應(yīng)用到生物化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。

4)本發(fā)明的氧化鈦基底可被廣泛應(yīng)用于先進(jìn)材料、表面處理、電化學(xué)、生物傳感、生物化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域等方面。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中氧化鈦材料的掃描電子顯微鏡圖；

圖2為實(shí)施例1中細(xì)胞色素C吸附在樣品P1、W1上的SERS圖；

圖3為實(shí)施例2中亞甲基藍(lán)吸附在樣品W2上的SERS圖、亞甲基藍(lán)本身的Raman圖；

圖4為實(shí)施例3中細(xì)胞色素C吸附在樣品W3、W4上的SERS圖；

圖5為實(shí)施例4中細(xì)胞色素C吸附在樣品W5、W6上的SERS圖；

圖6為實(shí)施例5中氧化鈦材料的掃描電子顯微鏡圖；

圖7位實(shí)施例5中細(xì)胞色素C吸附在樣品M5、P1上的SERS圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明

實(shí)施例1

反應(yīng)原料為水合氧化鈦TiO₂·nH₂O和碳酸鉀，將其放入捏和機(jī)中混合攪拌2h，取少量樣品測其TiO₂固含量，TiO₂與K₂O二者的摩爾比例為2：1，加入適量的水均勻攪拌形成非流動(dòng)型漿體，放置在薄瓷片上在90℃下干燥10小時(shí)。然后在馬弗爐中，用溫控儀控制溫度波動(dòng)為±2℃，加熱速率為2℃/min，燒結(jié)至950℃后保溫5小時(shí)，自然降溫，將制備好的K₂Ti₄O₉放入蒸餾水中，超聲分散后作為后續(xù)水合過程的初始材料。將分散好的K₂Ti₄O₉材料投入到適量去離子水中進(jìn)行強(qiáng)磁力攪拌，并不斷滴定0.1M的鹽酸，用酸度計(jì)控制溶液的pH值，離子選擇性電極實(shí)時(shí)測定液相中K⁺離子的浸出量。當(dāng)K⁺離子的浸出量基本不變化時(shí)，即達(dá)到平衡，抽濾出中間產(chǎn)物，用水洗至中性，過濾，在飽和氯化鈉溶液氣氛中干燥到恒重，取適量樣品放入馬弗爐中，加熱速率為3℃/min，升溫至500℃后保溫4小時(shí)，自然降溫，得到氧化鈦樣品記為W1，氧化鈦形貌圖見圖1。以商業(yè)用的氧化鈦P25和銳鈦礦型氧化鈦納米晶作為對(duì)照，樣品分別記為P1和N1。

用KH₂PO₄和Na₂HPO₄·12H₂O配制成1/15M濃度的pH＝7.4的PBS緩沖液。稱取一定量細(xì)胞色素C粉末，分別將其溶解PBS緩沖液中，超聲5min，得到5×10^-4M的細(xì)胞色素C溶液，并分別稀釋到相應(yīng)濃度。將10mg的氧化鈦溶解在20mL由PBS稀釋的細(xì)胞色素C溶液中，將混合溶液在37℃下恒溫保持2h。然后在4 000r/s的速度下離心10min。去離子水洗3次。離心的目的是洗去氧化鈦表面物理吸附的細(xì)胞色素C分子。此時(shí)，得到了表面吸附細(xì)胞色素C的氧化鈦，進(jìn)行拉曼測試。

待測樣品由用Horiba公司的HR800顯微激光共聚焦拉曼光譜儀測量。測試條件為：激光波長514.5nm，物鏡放大倍數(shù)50倍，信號(hào)采集時(shí)間為10s，對(duì)同一個(gè)樣品分別選擇3個(gè)不同的區(qū)域采集信號(hào)，并取平均值以確定Raman峰強(qiáng)度，其中細(xì)胞色素C在P1、W1、N1上的增強(qiáng)效果見圖2。

實(shí)施例2

反應(yīng)原料為水合氧化鈦TiO₂·nH₂O和碳酸鉀，將其放入捏和機(jī)中混合攪拌2h，取少量樣品測其TiO₂固含量，TiO₂與K₂O二者的摩爾比例為3：1，加入適量的水均勻攪拌形成非流動(dòng)型漿體，放置在薄瓷片上在90℃下干燥10小時(shí)。然后在馬弗爐中，用溫控儀控制溫度波動(dòng)為±2℃，加熱速率為3℃/min，分別燒結(jié)900℃。后保溫4小時(shí)，自然降溫，將制備好的K₂Ti₄O₉放入蒸餾水中，超聲分散后作為后續(xù)水合過程的初始材料。其他操作步驟如實(shí)施例1，得到不同燒結(jié)溫度的氧化鈦基底材料，記為W2。配置1×10^-2M的亞甲基藍(lán)溶液，然后分別稀釋到相應(yīng)濃度。采用微量進(jìn)樣器亞甲基藍(lán)乙醇溶液(濃度稀釋至1×10^-3M)滴到相應(yīng)的氧化鈦樣品上。使用蓋玻片蓋住，并在4℃條件下干燥一段時(shí)間，進(jìn)行拉曼測試。亞甲基藍(lán)本體的拉曼圖和W2增強(qiáng)效果見圖3。

實(shí)施例3

四鈦酸鉀前驅(qū)體的制備操作步驟如實(shí)施例2，將分散好的K₂Ti₄O₉材料，分成等質(zhì)量的兩份，投入到適量去離子水中進(jìn)行強(qiáng)磁力攪拌，分別滴定PH＝1、PH＝4的鹽酸，用酸度計(jì)控制溶液的pH值，離子選擇性電極實(shí)時(shí)測定液相中K⁺離子的浸出量。待體系穩(wěn)定達(dá)到平衡后抽濾出中間產(chǎn)物，用水洗至中性，在飽和氯化鈉溶液氣氛中干燥，至恒重，取適量樣品放入馬弗爐中，加熱速率為3℃/min，燒結(jié)至500℃后保溫4小時(shí)，自然降溫。得到氧化鈦基底材料，分別記為W3、W4。其他操作步驟如實(shí)施例1，不同PH下離子交換的氧化鈦基底材料，增強(qiáng)效果見圖4。

實(shí)施例4

四鈦酸鉀前驅(qū)體的制備操作步驟如實(shí)施例2，將分散好的K₂Ti₄O₉材料，投入到適量去離子水中進(jìn)行強(qiáng)磁力攪拌，滴定0.1M的鹽酸，用酸度計(jì)控制溶液的pH值，離子選擇性電極實(shí)時(shí)測定液相中K⁺離子的浸出量。待體系穩(wěn)定達(dá)到平衡后抽濾出中間產(chǎn)物，用水洗至中性，在飽和氯化鈉溶液氣氛中干燥至恒重，取適量樣品放入馬弗爐中分別升至500℃、800℃，恒溫2h，進(jìn)行熱處理，得到氧化鈦基底材料，記為W5和W6。其他操作步驟如實(shí)施例1，增強(qiáng)效果見圖5。

對(duì)比例1

將硫酸氧鈦在熱水中強(qiáng)烈攪拌后水解得到水合氧化鈦(TiO₂·nH₂O)；將水合氧化鈦和碳酸鉀，按TiO₂/K₂O摩爾比約1.5～2進(jìn)行混料；混合物在烘箱中90℃下干燥10h；然后將混合物在810℃下煅燒2h得到二鈦酸鉀。經(jīng)水蒸氣水合12h之后，用0.1M鹽酸溶液進(jìn)行離子交換；將得到的產(chǎn)物用蒸餾水過濾、洗滌，80℃干燥24h；將干燥后的產(chǎn)品放入馬弗爐中，500℃煅燒，恒溫2h，進(jìn)行熱處理，得到氧化鈦基底材料標(biāo)記為M5。樣品的形貌見圖6，其他操作步驟如實(shí)施例1，增強(qiáng)效果見圖7。