本發(fā)明涉及一種磁微粒化學發(fā)光法梅毒螺旋體抗體測定試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
梅毒螺旋體抗體作為傳統(tǒng)的傳染病項目，在疾病篩查、輸血和術(shù)前檢查中起著重要的作用，該類傳染病對檢測結(jié)果的準確性要求也很高。目前，醫(yī)院的檢驗流程一般分2步：首先，用甲苯胺紅不加熱血清試驗(toluLized red unheated serum test,TRUST)或TP-ELISA的方法進行初步篩選；然后對篩選為陽性的樣本用TPPA的方法進行確認。由于TRUST針對的不是梅毒特異性抗體，因此特異性較差，因此，越來越多的醫(yī)院開始用TP-ELISA的方法進行初篩。
ELISA作為一種較成熟檢測手段，優(yōu)勢很明顯，即抗原和抗體的特異性很高，并且包被對其生物活性影響很小，所以對待檢抗原和抗體的結(jié)合有著很好的識別作用。從本世紀初開始，同樣是基于免疫反應原理的各種化學發(fā)光法的試劑逐步開始成熟并替代市場上的ELISA產(chǎn)品。
對于梅毒等被檢測物為抗體的項目來說，方法學一般為間接法和雙抗原夾心法。所謂的間接法就是固相連接物為抗原，通過抗原-待檢抗體特異性結(jié)合來識別樣本中的抗體，洗滌后加入示蹤劑標記的二抗，由于信號的強弱與樣本中的待檢抗體量呈正比，這樣通過信號的強弱就能判斷樣本中的待檢抗體的量，通過與定標液或參考值進行對比就能確定待測樣本的陰陽性；雙抗原夾心法原理即固相連接抗原和示蹤劑標記的抗原可以對樣本中的待檢抗體的兩個可變區(qū)進行結(jié)合，信號強則待檢抗體量就多，反之就少。一般來說，由于雙抗原夾心法使用了2個特異性抗原，不但可以同時檢測IgG和IgM，而且結(jié)果的準確性要優(yōu)于間接法，事實上，由于雙抗原夾心法的2個結(jié)合固相的抗原都可以結(jié)合同一個抗體，會導致該抗體不能產(chǎn)生信號從而導致檢測結(jié)果失敗，同時還可能出現(xiàn)兩個示蹤劑標記的抗原結(jié)合同一個抗體的情況(一步法)，使得該抗體不能被結(jié)合至固相，因此使得結(jié)果不準確。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種磁微?；瘜W發(fā)光法梅毒螺旋體抗體測定試劑盒。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
一種梅毒螺旋體抗體測定試劑盒，其特征在于，包括以下組分：
磁分離試劑；
生物素抗原；
酶標試劑，檢測抗原與檢測抗體偶聯(lián)堿磷酶；
陰性對照品
陽性對照品
定標液；
其中生物素抗原和檢測抗原為重組抗原，檢測抗體為鼠單抗二抗；所述定標液中包含待檢抗體。
進一步的，所述的生物素抗原采用以下方法制備：
1)將PD-10透析柱用PH9.0的0.1M的NaHCO3緩沖液20mL進行緩沖體系更換，然后取2mg/mL的抗原0.25mL加入PD-10透析柱中，再加入0.1M的NaHCO3緩沖液補足2.5mL，然后加入3mL 0.1M的NaHCO3緩沖液進行洗脫，將洗脫液收集之后進行濃縮，濃縮至抗原的濃度為2.5mg/mL；
2)稱取2mg的生物素-NHS，并用DMSO進行溶解至終濃度為20mg/mL；
3)按照抗原：生物素的摩爾比1：20的投料量在抗原中加入DMSO溶解的生物素；
4)充分混勻后室溫反應2h；
5)反應完成后按照第1步的操作用PD-10透析柱進行透析除鹽，并收集偶聯(lián)物溶液即為生物素偶聯(lián)抗原；
6)用抗試劑緩沖液生物素偶聯(lián)抗原稀釋至0.5ug/mL作為工作液使用。
進一步的，酶標試劑采用以下方法制備：
1)將檢測抗原和檢測抗體分別用0.1倍PBS進行透析，然后分別用2IT進行活化；
2)將堿磷酶用SMCC進行活化；
3)將活化后的檢測抗原和檢測抗體分別和活化后的堿磷酶進行混合，2～8°反應18小時；
4)將反應物用層析柱進行純化，收集I峰和II峰進行混合后，用抗試劑緩沖液將混合物稀釋后作為工作液使用。
進一步的，磁分離試劑為鏈霉親和素磁微粒。
進一步的，陰性對照品為定標液用緩沖液；陽性對照品為定標液用緩沖液中加入待測抗體使待測抗體的終濃度為1.5ug/ml；定標液為定標液用緩沖液中加入待測抗體使待測抗體的終濃度為1ug/ml。
該梅毒螺旋體抗體測定試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：
1)取待測樣本15uL加入生物素抗原30uL，孵育15min；
2)加入磁分離試劑30uL，孵育5min；
3)加入磁-場進行磁分離2min，去上清；
4)洗滌3次，每次300uL洗液，重復步驟3操作；
5)加入酶標試劑60uL，孵育15min；
6)加入磁場進行磁分離2min，去上清；
7)洗滌3次，每次300uL洗液，重復步驟3操作；
8)加入底物200uL，測吸光值。
本發(fā)明所達到的有益效果是：
本發(fā)明通過將間接法和雙抗原夾心法進行結(jié)合，即保證了雙抗原夾心法的特異性，又避免了雙抗原夾心法中2個固相抗原或2個示蹤劑標記抗原結(jié)合同一個抗體而導致無法被檢測的情況，避免了由于假陽或假陰而導致的檢測結(jié)果不準確的情況，因此，兩種方法混合要優(yōu)于單純的間接法和雙抗原夾心法。
具體實施方式
以下對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
一種梅毒螺旋體抗體測定試劑盒，其特征在于，包括以下組分：
磁分離試劑；
生物素抗原；
酶標試劑，檢測抗原與檢測抗體偶聯(lián)堿磷酶；
陰性對照品
陽性對照品
定標液；
其中生物素抗原和檢測抗原為重組抗原，檢測抗體為鼠單抗二抗；所述定標液中包含待檢抗體。
其中，生物素抗原采用以下方法制備：
1)將PD-10透析柱用PH9.0的0.1M的NaHCO3緩沖液20mL進行緩沖體系更換，然后取2mg/mL的抗原0.25mL加入PD-10透析柱中，再加入0.1M的NaHCO3緩沖液2.25mL補足2.5mL，然后加入3mL0.1M的NaHCO3緩沖液進行洗脫，將洗脫液收集之后進行濃縮，濃縮至抗原的濃度為2.5mg/mL，約0.2mL；
2)稱取2mg的生物素-NHS，并用DMSO進行溶解至終濃度為20mg/mL；
3)按照抗原(分子量65KD)：生物素(分子量587)的摩爾比1：20的投料量在抗原中加入DMSO溶解的生物素；
4)充分混勻后室溫反應2h；
5)反應完成后按照第1步的操作用PD-10透析柱進行透析除鹽，并收集3mL偶聯(lián)物溶液即為生物素偶聯(lián)抗原；
6)用抗試劑緩沖液生物素偶聯(lián)抗原稀釋至0.5ug/mL作為工作液使用。
酶標試劑采用以下方法制備：
1)將檢測抗原和檢測抗體分別用0.1倍PBS進行透析，然后分別用2IT進行活化；
2)將堿磷酶用SMCC進行活化；
3)將活化后的檢測抗原和檢測抗體分別和活化后的堿磷酶進行混合，2～8°反應18小時；
4)將反應物用層析柱進行純化，收集I峰和II峰進行混合后，用抗試劑緩沖液將將抗原-堿磷酶和抗體-堿磷酶分別稀釋至0.02ug/ml和0.1ug/ml作為工作液，將兩種濃度的工作液等比例混合后使用，抗原-堿磷酶和抗體-堿磷酶終濃度分別為0.01ug/ml和0.05ug/ml。
磁分離試劑為鏈霉親和素磁微粒。
陰性對照品為定標液用緩沖液；陽性對照品為定標液用緩沖液中加入待測抗體使待測抗體的終濃度為1.5ug/ml；定標液為定標液用緩沖液中加入待測抗體使待測抗體的終濃度為1ug/ml。
本發(fā)明的梅毒螺旋體抗體測定試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：
1)取待測樣本15uL加入生物素抗原30uL，孵育15min；
2)加入磁分離試劑30uL，孵育5min；
3)加入磁場進行磁分離2min，去上清；
4)洗滌3次，每次300uL洗液，重復步驟3操作；
5)加入酶標試劑60uL，孵育15min；
6)加入磁場進行磁分離2min，去上清；
7)洗滌3次，每次300uL洗液，重復步驟3操作；
8)加入底物200uL，測吸光值。
驗證實驗
為了對比3種反應模式的優(yōu)劣，選取20例陰性樣本和20例陽性樣本同時用3種模式進行檢測，檢測結(jié)果如下：
表1三種反應模式的對照
由表1的結(jié)果可以看出，雙抗原夾心法的靈敏度較高，因此陽性測值也較高，而間接法和間接法+雙抗原夾心法混合則要差一些，但是從檢測結(jié)果的陰陽性來看，單純的間接法和雙抗原夾心法都會出現(xiàn)假陽性和假陰性的情況，而間接法和雙抗原夾心兩種方法混合使用則很好的避免了由于假陽或假陰而導致的檢測結(jié)果不準確的情況，因此，兩種方法混合要優(yōu)于單純的間接法和雙抗原夾心法。
最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換，均在本發(fā)明的保護之內(nèi)。