本發(fā)明涉及到一種舒肝丸中木香、厚樸的含量測定方法，屬中藥技術(shù)領(lǐng)域。具體的，涉及一種舒肝丸中和厚樸酚、木香羥內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、厚樸酚四種成分同時(shí)測定的含量測定方法。

背景技術(shù)：

舒肝丸為理氣劑，具有舒肝和胃，理氣止痛之功效。主治肝郁氣滯，胸肋脹滿，胃脘疼痛，嘈雜嘔吐，噯氣泛酸。該藥物由川楝子、醋延胡索、片姜黃、白芍(酒炒)、沉香、枳殼(炒)、木香、砂仁、陳皮、豆蔻仁、茯苓、姜厚樸、朱砂組成，藥效明確。舒肝丸(大蜜丸)標(biāo)準(zhǔn)最早收錄在《中國藥典》1985年版，2000年版中增加水蜜丸規(guī)格，2005年版增加水丸規(guī)格，并對標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂，檢驗(yàn)內(nèi)容同現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，2010年版第二增補(bǔ)本中增加小蜜丸規(guī)格，檢驗(yàn)內(nèi)容同《中國藥典》2005年版，未作修定。該藥物現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《中國藥典》2015年版，記載了該藥物的組方、制法及質(zhì)量控制方法。該藥物所含藥味多，《中國藥典》2015年版中的含量測定項(xiàng)中，樣品經(jīng)過復(fù)雜的處理過程后，僅對白芍中芍藥苷進(jìn)行了含量測定，舒肝丸處方中木香、厚樸中的和厚樸酚、木香羥內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、厚樸酚并未進(jìn)行測定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種同時(shí)測定舒肝丸中木香、厚樸的含量測定方法，本發(fā)明采用高效液相色譜法測定木香、厚樸中和厚樸酚、木香羥內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、厚樸酚四種成分含量。

本發(fā)明含量測定方法采用高效液相色譜法，該方法如下：

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為乙腈-0.05％磷酸，體積比為47∶53；檢測波長為230-240nm，流速為1ml/min，理論板數(shù)按和厚樸酚峰計(jì)算應(yīng)不低于2000-5000；

對照品溶液的制備 取和厚樸酚對照品、木香羥內(nèi)酯對照品、去氫木香內(nèi)酯對照品、厚樸酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml分別各含10、12、25、20μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備 取舒肝丸水蜜丸，研細(xì)，取0.8g，精密稱定；或取小蜜丸或大蜜丸，剪碎，取0.8g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流30-120分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；

測定法 分別精密吸取對照品溶液10μl與供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，測定，即得；

本發(fā)明含量測定方法中，檢測波長優(yōu)選為230nm；理論板數(shù)優(yōu)選為按和厚樸酚峰計(jì)算應(yīng)不低于3000；供試品制備中加熱回流時(shí)間優(yōu)選為90分鐘。

為了驗(yàn)證測定含量方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、專屬性及系統(tǒng)適應(yīng)性，對方法進(jìn)行了以下方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)，以確保該含量測定方法可以作為舒肝丸的質(zhì)量控制。

1儀器與試藥

1.1儀器

高效液相色譜儀：Waters e2695；色譜柱：Thermo Accliam(5μm，4.6mm×250mm)；電子天平：Mettler AE163；Mettler AE240；超純水儀：Integral 10(Millipore)。

1.2試藥與試劑

對照品：和厚樸酚、木香羥內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、厚樸酚(均購自中國食品藥品檢定研究院；制備陰性對照用藥材：川楝子、醋延胡索、白芍(酒炒)、片姜黃、木香、沉香、豆蔻仁、砂仁、姜厚樸、陳皮、枳殼(炒)、茯苓、朱砂購自市場，經(jīng)河北省藥品檢驗(yàn)研究院主任藥師段吉平鑒定為正品。

試劑：甲醇、乙腈(色譜純，Merck公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2方法確定

2.1色譜條件的確定

2.1.1測定波長的選擇 分別稱取和厚樸酚、木香羥內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、厚樸酚對照品適量，用甲醇溶液配制成適宜濃度的對照品溶液，在200nm～400nm進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果表明，厚樸酚與和厚樸酚在210nm波長附近有末端最大吸收，去氫木香內(nèi)酯與木香羥內(nèi)酯在220-240nm波長附近有最大吸收。在200～220nm波長下，對樣品進(jìn)行測定，結(jié)果待測成分與雜質(zhì)峰分離較差，因此選用待測成分響應(yīng)較強(qiáng)且無雜質(zhì)峰干擾的230-240nm作為測定波長，此波長下各待測成分與雜質(zhì)峰分離良好，陰性無干擾，其中230nm效果最好。

2.1.2流動相的選擇

樣品處方中藥味多，成分復(fù)雜，雜質(zhì)多，性質(zhì)相近的成分多，流動相以甲醇作有機(jī)相時(shí)，未能得到良好分離，結(jié)合提取方法考察及色譜條件的考察，最終選擇乙腈作為有機(jī)相，根據(jù)各待測成分的極性及出峰時(shí)間，將比例設(shè)為乙腈-0.05％磷酸溶液，體積比為47∶53，分離良好。

2.2對照品溶液的制備

供試品溶液的溶劑為甲醇溶液，故對照品溶液的稀釋選擇甲醇溶液。

2.3供試品溶液的制備方法

供試品溶液的制備 取舒肝丸水蜜丸，研細(xì)，取0.8g，精密稱定；或取小蜜丸或大蜜丸，剪碎，取0.8g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流90分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4提取方式的考察

取同一批樣品(大蜜丸，批號：4015087)適量，分成兩份，分別精密加入甲醇25ml，一份超聲處理(功率400W，頻率40kHz)90分鐘、另一份加熱回流90分鐘，按擬定色譜條件測定。結(jié)果表明加熱回流比超聲處理提取率略高，故選擇加熱回流的提取方式，見表1。

表1不同提取方式的含量測定結(jié)果

2.5提取時(shí)間的考察

取同一批樣品(大蜜丸，批號：4015087)適量，分別加熱回流30min、60min、90min、120min，按擬定色譜條件測定。結(jié)果表明木香含量受回流時(shí)間影響較大，而厚樸含量結(jié)果基本無差別，為確保提取完全，選擇加熱回流90min，見表2。

表2不同提取時(shí)間的含量測定結(jié)果

2.6提取溶劑的考察

取同一批樣品(大蜜丸，批號：4015087)適量，分別以50％、70％的甲醇溶液、甲醇、稀乙醇為提取溶劑，按擬定色譜條件測定。結(jié)果表明以甲醇為提取溶劑，所測得待測成分含量較高，參照藥典方法選擇甲醇作為提取溶劑，見表3。

表3不同提取溶劑的含量測定結(jié)果

3方法學(xué)考察

3.1專屬性試驗(yàn)

按處方比例和制法分別制備不含木香、厚樸的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液，按正文方法測定，并在二極管陣列檢測器上分析色譜峰純度。結(jié)果表明，方中其他藥味不干擾和厚樸酚、木香羥內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、厚樸酚的測定，色譜圖見圖1。

3.2線性關(guān)系考察

分別精密稱取各對照品適量，配制混合對照品溶液(和厚樸酚濃度0.02004mg/ml、木香羥內(nèi)酯濃度0.02493mg/ml、去氫木香內(nèi)酯濃度0.05146mg/ml、厚樸酚濃度0.03978mg/ml)，精密量取混合對照品溶液2ml置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液II。精密量取混合對照品溶液II 5μl、10μl，混合對照品溶液5μl、10μl、20μl注入液相色譜儀，按擬定的色譜條件測定，記錄峰面積。以對照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，對照品的峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果和厚樸酚、木香羥內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、厚樸酚線性方程分別為y＝3.724×106x-5.70×104、y＝1.650×106x-1.55×104、y＝1.131×106x-2.16×104、y＝5.315×106x-3.98×104；線性范圍分別為0.02004～0.4008μg、0.02493～0.4986μg、0.05146～1.0291μg、0.03978～0.7955μg；相關(guān)系數(shù)均為0.9999，表明待測成分線性關(guān)系良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4各待測成分線性關(guān)系考察結(jié)果

3.3重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(大蜜丸，批號：4015087)，剪碎，分別稱取0.64g、0.8g、0.96g各三份，精密稱定，按供試品溶液制備方法制成供試品溶液，按正文方法測定。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好(結(jié)果見表5)。

表5重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3.4回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品(大蜜丸，批號：4015087含量見重復(fù)性結(jié)果)，剪碎，取9份，每份約0.4g，精密稱定，每三份為一組，分別精密加入用溶液配制的低、中、高三個(gè)濃度的混合對照品溶液25ml，低濃度(和厚樸酚：0.001203mg·ml^-1；木香羥內(nèi)酯：0.002493mg·ml^-1；去氫木香內(nèi)酯：0.004117mg·ml^-1；厚樸酚：0.003182mg·ml^-1)；中等濃度(和厚樸酚：0.001503mg·ml^-1；木香羥內(nèi)酯：0.003116mg·ml^-1；去氫木香內(nèi)酯：0.005146mg·ml^-1；厚樸酚：0.003978mg·ml^-1)；高濃度(和厚樸酚：0.001804mg·ml^-1；木香羥內(nèi)酯：0.003740mg·ml^-1；去氫木香內(nèi)酯：0.006175mg·ml^-1；厚樸酚：0.004773mg·ml^-1)。按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按正文方法測定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明本方法回收率良好。見表6～9。

表6和厚樸酚回收率試驗(yàn)結(jié)果

表7木香羥內(nèi)酯回收率試驗(yàn)結(jié)果

表8去氫木香內(nèi)酯回收率試驗(yàn)結(jié)果

表9厚樸酚回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，于0小時(shí)開始測定，以后間隔一段時(shí)間測定一次，記錄峰面積。結(jié)果RSD分別為1.2％、1.5％、1.2％、0.7％，表明供試品溶液至少在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定(結(jié)果見表10)。

表10供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

4樣品測定與限度制定

按擬定方法對34批次樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見表11。

表11木香、厚樸含量測定結(jié)果(部分)

附圖說明

圖1：對照品(A)、樣品(B)、木香陰性樣品(C)、厚樸陰性樣品(D)，色譜圖中1為和厚樸酚，2為木香羥內(nèi)酯，3為去氫木香內(nèi)酯，4為厚樸酚)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為乙腈-0.05％磷酸，體積比為47∶53；檢測波長為230nm；流速為1ml/min，理論板數(shù)按和厚樸酚峰計(jì)算應(yīng)不低于3000；

對照品溶液的制備 取和厚樸酚對照品、木香羥內(nèi)酯對照品、去氫木香內(nèi)酯對照品、厚樸酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml分別各含10、12、25、20μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備 取舒肝丸水蜜丸，研細(xì)，取0.8g，精密稱定；或取小蜜丸或大蜜丸，剪碎，取0.8g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流90分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；

測定法 分別精密吸取對照品溶液10μl與供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

實(shí)施例2

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為乙腈-0.05％磷酸，體積比為47∶53；檢測波長為240nm；流速為1ml/min，理論板數(shù)按和厚樸酚峰計(jì)算應(yīng)不低于4000；

對照品溶液的制備 取和厚樸酚對照品、木香羥內(nèi)酯對照品、去氫木香內(nèi)酯對照品、厚樸酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml分別各含10、12、25、20μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備 取舒肝丸水蜜丸，研細(xì)，取0.8g，精密稱定；或取小蜜丸或大蜜丸，剪碎，取0.8g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流30分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；

測定法 分別精密吸取對照品溶液10μl與供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

實(shí)施例3

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為乙腈-0.05％磷酸，體積比為47∶53；檢測波長為235nm；流速為1ml/min，理論板數(shù)按和厚樸酚峰計(jì)算應(yīng)不低于2000；

對照品溶液的制備 取和厚樸酚對照品、木香羥內(nèi)酯對照品、去氫木香內(nèi)酯對照品、厚樸酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml分別各含10、12、25、20μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備 取舒肝丸大蜜丸，剪碎，取0.8g，精密稱定；或取小蜜丸或大蜜丸，剪碎，取0.8g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流60分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；

測定法 分別精密吸取對照品溶液10μl與供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

實(shí)施例4

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為乙腈-0.05％磷酸，體積比為47∶53；檢測波長為230nm；流速為1ml/min，理論板數(shù)按和厚樸酚峰計(jì)算應(yīng)不低于5000；

對照品溶液的制備 取和厚樸酚對照品、木香羥內(nèi)酯對照品、去氫木香內(nèi)酯對照品、厚樸酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml分別各含10、12、25、20μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備 取舒肝丸濃縮丸，研細(xì)，取0.8g，精密稱定；或取小蜜丸或大蜜丸，剪碎，取0.8g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流120分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；

測定法 分別精密吸取對照品溶液10μl與供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

上述實(shí)施例均按照藥典要求進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示方法準(zhǔn)確可靠、靈敏、專屬，各項(xiàng)指標(biāo)均符合質(zhì)量控制的要求。