本發(fā)明涉及配位化學(xué)領(lǐng)域和化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測大氣細顆粒物在人體內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基的檢測方法。
背景技術(shù)：
大氣細顆粒物成分比較復(fù)雜，其表面吸附了大量有毒有害的金屬和有機物，是人類健康的主要殺手，且由于顆粒粒徑小于等于2.5μm，能通過呼吸作用穿過鼻腔纖毛，進入人體肺部，滲入血液，從而導(dǎo)致心臟病、動脈硬化、、肺癌等疾病的發(fā)生。評價顆粒物致毒的關(guān)鍵在于顆粒物進入呼吸道后造成的體內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥兩個方面。在顆粒物引起呼吸道破裂所產(chǎn)生的活性氧中，超氧陰離子自由基(O2-)，過氧化氫(H2O2)和羥基自由基(·OH)是最重要的三種活性氧自由基，大量研究表明·OH是有毒的氧化代謝副產(chǎn)物，是活性氧誘導(dǎo)生物損傷最關(guān)鍵的部分，被認為和一系列的病理以及毒理學(xué)效應(yīng)有關(guān)。
·OH反應(yīng)活性很強，在液相中的半衰期很短，因此直接檢測·OH非常困難，一般是使用電子自旋共振法，是直接用于檢測未配對電子存在的一種方法。然而，該方法只能直接檢測到不活躍的自由基，而對于活躍·OH的檢測還存在一定的困難。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種檢測大氣細顆粒物在人體內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基(特別是羥基自由基·OH)的檢測方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種具有較好的特異性，產(chǎn)物性質(zhì)較穩(wěn)定的芳香族探針。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述以活性氧自由基為中間體的大氣細顆粒物在健康效應(yīng)上的評價。
本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
一種檢測大氣細顆粒物在人體內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基的方法，包括以下步驟：
步驟一、用PM2.5采樣器采集大氣細顆粒物作為檢驗樣品，選取相應(yīng)的采樣設(shè)備，構(gòu)建質(zhì)量控制和質(zhì)量保證體系，保證所采集PM2.5樣品的科學(xué)性；
步驟二、制備人工肺流體溶液，將檢驗樣品超聲萃取在人工肺流體溶液中；其中，所述人工肺流體溶液包括由磷酸鹽緩沖溶液和作為羥基自由基探針的苯甲酸鈉組成的檢測基液，檢測基液pH值在7.0至7.4之間；所述人工肺流體溶液還包括抗壞血酸鹽、檸檬酸鹽、谷胱甘肽、尿酸四種抗氧化劑；四種抗氧化劑和用于質(zhì)檢的Fe(Ⅱ)均為每次實驗前新鮮配制，所有的溶劑都由milli-Q水制備；
步驟三、反應(yīng)結(jié)束后，將人工肺流體溶液酸化到pH值至1.9～2.1，用液相色譜儀檢測羥基自由基與苯甲酸的加合產(chǎn)物對羥基苯甲酸，從而檢測大氣細顆粒物在人體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基。
作為優(yōu)選方案，步驟二中，將檢驗樣品先加入檢測基液內(nèi)超聲3次，每次15min，然后加入檸檬酸鹽、谷胱甘肽、尿酸，最后加入抗壞血酸鹽引發(fā)反應(yīng)，在42h內(nèi)用錫箔紙遮光并在控制型圓周式振蕩床上振蕩。
作為優(yōu)選方案，步驟三中，采用甲磺酸去鐵胺鹽淬滅劑和硫酸氫鈉溶液終止反應(yīng)，用硫酸將溶液酸化到pH為2。
作為優(yōu)選方案，所述人工肺流體溶液中的抗氧化劑的含量分別為150-250μM抗壞血酸鹽(Asc)、250-350μM檸檬酸鹽(Cit)、50-150μM谷胱甘肽(GSH)、50-150μM尿酸(UA)。
需要說明的是，本發(fā)明的實質(zhì)或者改進在于通過選擇上述組分或采用上述組分進行制備，其技術(shù)問題的解決僅取決于組分的選擇，而組分的含量是本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)或者通過簡單實驗就能夠確定的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述技術(shù)方案進行簡單推導(dǎo)或?qū)嶒灳湍軌蛴枰詫崿F(xiàn)，因此在上述說明中相關(guān)組分未進行明確性限定。
通過本發(fā)明的檢測方法具有如下優(yōu)點及有益效果：
(1)本檢測方法中使用苯甲酸探針是一個單一的探針，不參與活性氧的生產(chǎn)，苯甲酸與·OH反應(yīng)生成對羥基苯酸(p-HBA)，因此這種方法能夠量化任何化學(xué)物種，包括過渡金屬和有機物產(chǎn)生的·OH；
(2)本檢測方法可以測得實際PM2.5在人工肺流體中產(chǎn)生羥基自由基(·OH)的量，進而評估PM2.5的毒理性；
(3)本發(fā)明所述的檢測方法具有測量方便、高效、靈敏度高、檢測限可達10-9～10-11g等優(yōu)點。
附圖說明
以下附圖僅旨在于對本發(fā)明做示意性說明和解釋，并不限定本發(fā)明的范圍。其中：
圖1是實際PM2.5樣品中p-HBA在液相色譜儀中檢測的色譜圖。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和實施例，進一步闡述本發(fā)明。
一種檢測大氣細顆粒物在人體內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基的方法，包括以下步驟：
步驟一、用PM2.5采樣器(具有特氟龍膜)采集大氣細顆粒物作為檢驗樣品，選取相應(yīng)的采樣設(shè)備，構(gòu)建質(zhì)量控制和質(zhì)量保證體系，保證所采集PM2.5樣品的科學(xué)性；
步驟二、制備人工肺流體溶液，將檢驗樣品超聲萃取在人工肺流體溶液中；其中，所述人工肺流體溶液包括由磷酸鹽緩沖溶液和作為羥基自由基探針的苯甲酸鈉組成的檢測基液；
具體為，將配制磷酸鹽緩沖液所需的三種無機鹽(3.3311g氯化鈉，0.5537g磷酸氫二鈉和0.1497g磷酸二氫鉀)和0.0450g苯甲酸鈉(作為·OH探針)加入到經(jīng)酸洗的500mLFEP瓶中，制得人工肺流體(SLF)檢測基液，測得其pH為7.0-7.2之間，冷藏并在一周內(nèi)用完；人工肺流體溶液還包括200μM抗壞血酸鹽(Asc)、300μM(μmol/l)檸檬酸鹽(Cit)、100μM谷胱甘肽(GSH)、100μM尿酸(UA)四種人體內(nèi)常見的抗氧化劑；當然，四種抗氧化劑的含量還可以適當調(diào)整為其他濃度；四種抗氧化劑和用于質(zhì)檢的Fe(Ⅱ)均為每次實驗前新鮮配制，所有的溶劑都由milli-Q水制備；
把特氟龍膜(d＝47mm)采集的實際PM2.5樣品用剪刀剪成約4cm2的大小，剪碎于15ml特氟龍容器里，加入5ml的人工肺流體(SLF)檢測基液，將剩余3mL的檢測基液用滴管沖下剪刀，超聲3次，每次15min，然后加入2ml含檸檬酸鹽、谷胱甘肽、尿酸三種抗氧化劑的人工肺流體，最后加抗壞血酸鹽(抗壞血酸)20μL引發(fā)反應(yīng)，在42h內(nèi)用錫箔紙遮光并在控制型圓周式振蕩床上振蕩；
步驟三、反應(yīng)結(jié)束后取出1ml樣品，經(jīng)0.22μm的濾芯過濾到1.5mL的螺旋自動進樣機中，并注射10μL甲磺酸去鐵胺鹽淬滅劑和50μL0.01M的硫酸氫鈉溶液終止反應(yīng)，用120μL1.0M的硫酸將溶液酸化到pH為2，用高效液相色譜儀進行監(jiān)測。
儀器測試的條件為：
色譜柱：Atlantis dC18，3μm，2.1mm×100mm(i.d.)；流動相：0.9％甲酸水溶液-乙腈(pH＝2)；流速：0.25mL/min；紫外檢測波長：λ1＝256nmλ2＝278nm；進樣量：10μL；在上述色譜條件下，對羥基苯甲酸的相對保留時間為4.05min左右；用化學(xué)工作站外標法自動定量，檢測結(jié)果參考圖1。
本發(fā)明通過采用分子探針技術(shù)分析大氣細顆粒物在人體內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基的強度，基于活性氧自由基的產(chǎn)生，評價大氣細顆粒物對人體的氧化損傷效應(yīng)，從而可以建立基于活性氧自由基水平的人體氧化損傷效應(yīng)的評價方法。
以上所述僅為本發(fā)明示意性的具體實施方式，并非用以限定本發(fā)明的范圍。任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和原則的前提下所作出的等同變化與修改，均應(yīng)屬于本發(fā)明保護的范圍。