本發(fā)明涉及大氣顆粒物毒性研究領(lǐng)域，特別涉及一種大氣顆粒物毒性的研究方法及其系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

空氣污染嚴重地影響著人體健康。流行病學研究表明，大氣細顆粒物(特別是PM_2.5)由于可以深入人體肺部而危害更大，其人體暴露能夠造成心血管系統(tǒng)發(fā)病率以及死亡率上升，也可顯著增加慢性阻塞性肺病(COPD)、肺功能下降等呼吸系統(tǒng)疾病，大量毒理學研究還發(fā)現(xiàn)大氣細顆粒物可以引起系統(tǒng)炎癥、改變血管收縮狀態(tài)、削弱血管功能、動脈粥狀硬化等。PM_2.5對心血管及呼吸系統(tǒng)的損傷機理還在探索進程中，其進入人體后引起的活性氧簇的生成和氧化應(yīng)激的發(fā)生所受關(guān)注較多。

動物暴露實驗是研究大氣顆粒物毒性的一種重要方法，目前多用小鼠或大鼠進行，具體染毒方式多采用大氣顆粒物濾膜采樣樣品懸液氣管滴注方法，操作比較繁瑣，與實際呼吸暴露存在一定的差距。大氣顆粒物的粒徑越小越容易深入人的肺部，甚至可以進入血液，隨循環(huán)系統(tǒng)分布到身體更多的靶器官。目前，還沒有相關(guān)研究證明進入血液的大氣顆粒物會造成哪些負面影響。此外，大氣顆粒物，特別是PM_2.5的毒性究竟有多大，目前的研究存在一定的差別，主要是由暴露方式、顆粒物組分的差別造成的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了直觀地了解大氣顆粒物(尤其是PM_2.5)的毒性，研究大氣細顆粒物進入血液后會對人體健康造成哪些負面影響，本發(fā)明以大鼠為實驗?zāi)Ｐ停⒘艘环N大氣顆粒物毒性的研究系統(tǒng)及方法。本發(fā)明的主要思路是通過大鼠背部靜脈埋置的導管將采集的不同濃度的大氣顆粒物樣品懸液直接注入血液，通過血液生物標志物檢測、視頻記錄、組織病理分析等手段來研究大氣顆粒物進入血液后對大鼠機體產(chǎn)生的健康影響，從而從活體動物水平上了解大氣顆粒物的毒性。

在本發(fā)明的一方面，提供了一種大氣顆粒物毒性研究方法，包括以下步驟：

1)采集大氣顆粒物并制成一定濃度的懸液；

2)將大氣顆粒物懸液注射到大鼠靜脈中；

3)在一個實驗周期內(nèi)定期從大鼠靜脈抽取血液樣本，對相關(guān)生物標志物進行檢測，同時視頻記錄大鼠日?；顒?，觀察其對外界刺激的反應(yīng)；

4)一個實驗周期結(jié)束后處死大鼠，對大鼠進行解剖并摘取主要臟器進行病理分析。

上述方法，所述大氣顆粒物主要指PM_2.5，將不同濃度的PM_2.5濾膜樣品懸液注射到大鼠血液中，通過注射前后大鼠血液中生物標志物的濃度水平檢測、PM_2.5濾膜樣品懸液成分檢測、組織病理學分析、以及視頻記錄大鼠日?；顒觼硌芯縋M_2.5進入血液后對機體產(chǎn)生的氧化損傷、炎癥反應(yīng)等健康影響。

上述步驟1)中，優(yōu)選采用為四通道大氣細顆粒物采樣器，將PM_2.5采集到Teflon濾膜上，采集流量優(yōu)選16.7L/min；采樣后將PM_2.5從Teflon濾膜上萃取到緩沖液(例如磷酸鹽生理鹽水緩沖液，PBS)中，低溫超聲萃取30分鐘，制備成PM_2.5懸液。用PBS將PM_2.5懸液進行不同程度的稀釋，獲得不同濃度的PM_2.5懸液，合理配置濃度梯度，可研究不同濃度的PM_2.5懸液毒性的差異。

優(yōu)選地，對大氣顆粒物懸液成分進行檢測，以更好地判斷其可能產(chǎn)生的健康影響，檢測內(nèi)容包括但不限于：細菌總量檢測、細菌種類檢測、元素檢測、內(nèi)毒素檢測。其中，細菌總量可以采用q-PCR的方法檢測；細菌種類可以采用高通量基因測序的方法檢測；元素可以采用ICP-MS(電感耦合等離子體質(zhì)譜儀)進行檢測；內(nèi)毒素可以采用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附法)測定。

上述步驟2)中，優(yōu)選使用進行過背部靜脈導管埋置的SD大鼠，將大氣顆粒物懸液通過背部導管注射到大鼠靜脈中。為準確判斷大鼠在注射大氣顆粒物懸液后體內(nèi)產(chǎn)生的健康影響，避免單一的指標可能產(chǎn)生的偏倚或紕漏，上述步驟3)優(yōu)選采用多種生物標志物來綜合表征氧化損傷和炎癥反應(yīng)，例如如下5種標志物：腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)、內(nèi)毒素(Endotoxin)。標志物濃度水平的檢測選用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。

進一步的，為掌握大鼠血液中各類生物標志物的濃度水平變化情況，更好地分析PM2.5的血液毒性，步驟3)對采血的時間進行了合理規(guī)劃，一個實驗周期(一般為9天)對每只大鼠共采血6次：注射前、注射后1小時、注射后3天、注射后5天、注射后7天、注射后9天。同時利用攝像機對注射和無注射的大鼠在外界擾動下的行為活動進行拍攝記錄，觀察其對外界刺激的反應(yīng)，進而分析顆粒物的毒性。

優(yōu)選地，在步驟2)和3)對大鼠進行注射和取血操作時，應(yīng)注意控制劑量。單次注射劑量不能超過大鼠血液總量的5％，大鼠血液總量在20mL左右，因此單次注射劑量一般不超過1mL；如果需要進行多次注射，則每天注射次數(shù)不能超過1次，每次注射量不能超過0.6mL。單次取血劑量不能超過1mL，如果僅需要在一個實驗周期中的1天進行取血，則當天取血次數(shù)不能超過3次，總?cè)⊙坎荒艹^3mL；如果需要每天進行取血，每天最多取血1次，當天總?cè)⊙坎荒艹^0.3mL；如果需要隔天進行取血，每天最多取血1次，當天總?cè)⊙坎荒艹^0.5mL。

上述步驟2)和3)中，優(yōu)選地，合理安排對大鼠進行導管操作的時間，所有實驗操作盡量保證在大鼠進行導管埋置手術(shù)后10天內(nèi)進行，隨著時間延長，埋置的導管會因為大鼠生長速度較快等原因出現(xiàn)不同程度的堵塞。每次進行導管操作后，應(yīng)向大鼠導管內(nèi)注射50μL封閉液(50％葡萄糖溶液，肝素鈉500IU/mL)，以防止血液凝集堵塞導管。

上述步驟3)中，在采血實驗的同時利用攝像機對大鼠在外界擾動下的行為活動進行拍攝，對注射和無注射的大鼠在同樣外界刺激下在不同時間段的動作行為進行視頻拍攝，包括上午、中午、下午，觀察其對外界刺激的反應(yīng)，進而分析顆粒物的毒性。

上述步驟4)中，一個實驗周期結(jié)束后處死大鼠，對大鼠進行解剖并取五臟(心肝脾肺腎)制作病理切片(HE染色)，借助光學顯微鏡觀察分析顆粒物對組織、器官的毒性。

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種大氣顆粒物毒性研究系統(tǒng)，該研究系統(tǒng)可以實現(xiàn)大氣顆粒物(特別是PM_2.5)的采集及懸液制備，懸液注射進入實驗動物血液以及實驗動物血液樣本的采集，主要包括：大氣顆粒物采樣裝置、懸液制備裝置、注射裝置、血液采樣裝置；其中，所述大氣顆粒物采樣裝置為四通道大氣細顆粒物采樣器；所述懸液制備裝置包括低溫超聲萃取儀和緩沖液；所述注射裝置包括靜脈導管和無菌注射器；所述血液采樣裝置包括無菌注射器；大氣顆粒物采樣裝置采集的大氣顆粒物由懸液制備裝置制成大氣顆粒物懸液，該大氣顆粒物懸液通過注射裝置注射入實驗動物靜脈中，血液采樣裝置定期采集實驗動物的血液樣品進行研究。

通常，上述大氣顆粒物毒性研究系統(tǒng)在運用時，首先通過四通道大氣細顆粒物采樣器將PM_2.5采集到Teflon濾膜上，采集流量16.7L/min；采樣后將PM_2.5從Teflon濾膜上萃取到磷酸鹽生理鹽水緩沖液(PBS)中，低溫超聲萃取30分鐘，制備成PM_2.5懸液；實驗選用進行過背部靜脈導管埋置的SD大鼠，用無菌注射器將PM_2.5懸液通過背部導管注射到大鼠靜脈中；實驗期間使用無菌注射器通過背部導管從大鼠靜脈抽取血液樣本。

需要說明的是，上述研究方法和系統(tǒng)的研究對象并不局限于PM_2.5，若需要研究其他有毒有害物質(zhì)進入血液后可能對機體產(chǎn)生的健康影響，也可借助該方法將所研究物質(zhì)的懸液或溶液注射進入實驗動物血液，并進行血液樣本采集及分析。本發(fā)明提供的研究方法及其系統(tǒng)借助動物模型(大鼠)對大氣顆粒物(PM_2.5)的毒性進行研究分析，主要特點是：

1)本發(fā)明提供了一種大氣顆粒物毒性研究系統(tǒng)，該研究系統(tǒng)可以通過大鼠背靜脈內(nèi)埋置的導管直接將大氣顆粒物懸液注射進入其血液中，同時實現(xiàn)血液樣本的便捷采集；

2)該系統(tǒng)方法可以借助大鼠日?；顒犹卣?、大氣顆粒物懸液成分檢測、血液中生物標志物的濃度水平變化以及組織病理分析多角度研究大氣顆粒物(PM_2.5)的毒性，間接地對比研究不同濃度及來源的大氣顆粒物(PM_2.5)的毒性；

3)不同于現(xiàn)有的暴露方法，該系統(tǒng)方法大氣顆粒物(PM_2.5)暴露簡單、可控，而且可以在單個活體動物水平上觀察其毒性；

4)不同于現(xiàn)有的大氣顆粒物(PM_2.5)毒性的研究，該系統(tǒng)方法考慮顆粒物的組分包括生物成分對健康的負面影響；

5)該系統(tǒng)方法能夠回答顆粒物進入血液后可對活體組織、器官產(chǎn)生何種毒性等。

附圖說明

圖1是實施例1進行PM_2.5毒性研究的流程示意圖。

圖2顯示了實施例1注射PM2.5懸液后各組大鼠血液中白介素6的濃度變化。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖，通過實施例對本發(fā)明的大氣細顆粒物(PM_2.5)毒性研究系統(tǒng)和方法做進一步闡述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明及所附的權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)，各種替換和修改都是可能的。因此，本發(fā)明不應(yīng)局限于實施例所公開的內(nèi)容，本發(fā)明要求保護的范圍以權(quán)利要求書界定的范圍為準。

實施例1：

對PM_2.5毒性研究的流程如圖1所示，具體步驟如下：

1.選取12只體重、年齡相近，生理狀態(tài)基本一致的已經(jīng)做好背部靜脈導管埋置的雄性SD大鼠，隨機分成四組(高劑量注射組、中劑量注射組、低劑量注射組、對照組)，每組3只大鼠。

2.使用四通道大氣細顆粒物采樣器采集PM_2.5濾膜樣品，采樣流量16.7L/min，采樣時間24h，所用濾膜為Teflon濾膜。

3.采樣結(jié)束后，取一張濾膜置于15mL無菌離心管中，加入6mL磷酸鹽生理鹽水緩沖液(PBS)，低溫超聲萃取30min，此萃取液懸液用作高劑量組注射；將高劑量組所注射懸液用PBS分別稀釋10倍和100倍，分別用作中劑量組和低劑量組注射；取一張未采樣的空白濾膜，按照相同方法低溫超聲萃取30min，用作對照組注射。同時對懸液成分進行檢測，包括細菌總量檢測(q-PCR)、細菌種類檢測(高通量測序)、元素檢測(ICP-MS)、內(nèi)毒素檢測(ELISA)。

4.注射PM2.5懸液前，對每只大鼠取血0.3mL，然后注射懸液1mL，注射后1h、3d、5d、7d、9d分別對每只大鼠取血0.3mL，血樣-20℃凍存。其中，注射和取血使用1mL無菌注射器(配有23G無菌平頭針)通過大鼠背部靜脈埋置導管進行。為保證大鼠在實驗操作過程中不會過度掙扎干擾實驗，對大鼠進行導管操作時，對大鼠進行遮擋視線并固定后肢。合理安排對大鼠進行導管操作的時間，所有實驗操作盡量保證在大鼠進行導管埋置手術(shù)后10天內(nèi)進行，隨著時間延長，埋置的導管會因為大鼠生長速度較快等原因出現(xiàn)不同程度的堵塞。每次注射或取血前要用一只無菌注射器將導管內(nèi)的封閉液(50％葡萄糖注射液，含500IU/mL肝素)吸出，每次注射或取血后要向?qū)Ч軆?nèi)注入50μL封閉液(50％葡萄糖溶液，肝素鈉500IU/mL)，以防止血液凝集堵塞導管。取血后，對血樣進行生物標志物濃度檢測，主要采用ELISA法，檢測的生物標志物包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、8羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)、內(nèi)毒素(Endotoxin)。

5.注射后每天對大鼠的日?；顒舆M行視頻記錄。

6.第9天取血后處死大鼠，解剖，取五臟(心肝脾肺腎)用福爾馬林溶液固定，之后做HE染色病理切片。

7.結(jié)合視頻記錄、懸液成分檢測、血樣生物標志物檢測以及HE染色病理切片分析結(jié)果，探究PM_2.5進入血液后對機體造成的氧化損傷及炎癥反應(yīng)。

結(jié)果分析：

視頻記錄發(fā)現(xiàn)，注射懸液之后，高劑量組大鼠與對照組相比活動明顯遲鈍、嗜睡，但在3-5天后日常活動恢復正常，與對照組無異。血樣檢測發(fā)現(xiàn)，高劑量組大鼠注射懸液1h后，表征氧化損傷和炎癥反應(yīng)的生物標志物濃度較對照組和低劑量組明顯升高，以白介素6(IL-6)為例，如圖2所示，注射1h后，高劑量組大鼠血液中白介素6的濃度是是注射前的2倍，相比之下其他各組變化并不顯著。