相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求于2011年11月21日提交的美國臨時(shí)申請第61/562,302號的權(quán)益，其通過引用以其整體并入本文。

發(fā)明背景

免疫測定用途廣泛，并常用于鑒定感染原。某些免疫測定依賴于宿主對給定感染原的免疫反應(yīng)，例如，通過測定特異性結(jié)合該感染原的一種或多種獨(dú)特抗原的宿主抗體的存在。多種類型的免疫測定系統(tǒng)可用于診斷目的，包括大型、自動化的中央實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)和相對簡易的柜臺檢測。這些免疫測定采用多種檢測形式，例如凝集反應(yīng)測定，沉淀素測定，酶聯(lián)免疫測定，直接熒光測定，免疫組化檢測，補(bǔ)體結(jié)合測定，血清學(xué)試驗(yàn)，免疫電泳測定以及側(cè)向流和通流試驗(yàn)(即快速“條(strip)”檢測)。免疫測定能對多種疾病提供快速、簡便和高效的診斷。然而，本領(lǐng)域仍存在對具有高靈敏度的改進(jìn)的免疫測定的需求。

發(fā)明概述

本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)添加可檢測的Fc結(jié)合分子(例如蛋白A綴合物，蛋白G綴合物，第二抗體綴合物)可用于在免疫測定，例如基于抗原的捕獲或夾心型測定中檢測抗體。這些可檢測的Fc結(jié)合分子可單獨(dú)或與其他可檢測實(shí)體組合用于在免疫測定中檢測抗體。例如，一旦待測抗體被抗體特異性結(jié)合實(shí)體(例如抗原)捕獲，這些Fc結(jié)合分子可用于檢測該抗體。在另一個(gè)實(shí)例中，這些Fc結(jié)合分子可用作可檢測信號的第二來源，例如與其他標(biāo)記的或可檢測的抗體結(jié)合實(shí)體(如抗原)組合。

該發(fā)現(xiàn)可用于本文所述的多種捕獲型測定、相關(guān)方法、組合物以及試劑盒。

因此，某些實(shí)施方式包括用于檢測測試樣品中的抗體的方法，所述方法包含：(a)使所述測試樣品與第一檢測物接觸以形成包含第一檢測物和所述抗體的第一復(fù)合物，其中第一檢測物包含與第一可檢測實(shí)體綴合的Fc結(jié)合分子；(b)使第一復(fù)合物與固定于表面的測試區(qū)域的捕獲實(shí)體接觸，其中所述捕獲實(shí)體能夠與所述抗體特異性結(jié)合；以及(c)檢測來自測試區(qū)域中的第一可檢測實(shí)體的信號的存在，其中所述信號的存在表明測試樣品中存在所述抗體。在某些實(shí)施方式中，第一檢測物固定于表面的綴合區(qū)域，其中所述綴合區(qū)域與表面的測試區(qū)域不重疊。在具體實(shí)施方式中，F(xiàn)c結(jié)合分子是蛋白A、蛋白G或二者。在某些實(shí)施方式中，第一檢測物包含各自與可檢測實(shí)體綴合的蛋白A和蛋白G。在這些實(shí)施方式中，可根據(jù)待測免疫球蛋白的類型調(diào)整蛋白A與蛋白G的比率，從而優(yōu)化信號放大水平。例如，在一些實(shí)施方式中，蛋白A和蛋白G以約10:1至約1:10，更優(yōu)選約5:1至約1:5的比率存在。

在某些實(shí)施方式中，捕獲實(shí)體是抗原或抗原性肽。在具體實(shí)施方式中，所述抗原或抗原性肽來自選自以下的生物體：心絲蟲，例如犬心絲蟲，犬埃里希體(Ehrlichia canis)，伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)，埃氏疏螺旋體(Borrelia afzelii)，伽氏疏螺旋體(Borrelia garinii)，嗜吞噬細(xì)胞無形體(Anaplasma phagocytophilum)，貓白血病毒，細(xì)小病毒，流感A株，流感B株，禽流感病毒，呼吸道合胞體病毒，軍團(tuán)桿菌(Legionella)，腺病毒，輪狀病毒，貓免疫缺陷病毒，人免疫缺陷病毒和甲類鏈球菌(Streptococcus)。

在某些實(shí)施方式中，第一可檢測實(shí)體是金屬納米顆粒，金屬納米殼，熒光團(tuán)或有色乳膠顆粒。在某些實(shí)施方式中，金屬納米顆?；蚪饘偌{米殼選自由金顆粒、銀顆粒、銅顆粒、鉑顆粒、鎘顆粒、復(fù)合顆粒、金空心球、金涂覆二氧化硅納米殼和二氧化硅涂覆金殼組成的組。

本文提供的某些方法進(jìn)一步包含使測試樣品與第二檢測物接觸，其中第二檢測物包含與第二可檢測實(shí)體綴合的抗原或抗原性肽，所述抗原或抗原性肽能夠與抗體特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，第一和第二檢測物固定于綴合區(qū)域，其中綴合區(qū)域與表面測試區(qū)域不重疊。在某些實(shí)施方式中，綴合區(qū)域進(jìn)一步包含對照檢測物。信號放大水平可通過調(diào)整第一檢測物與第二檢測物的比率來選擇。在某些實(shí)施方式中，第一檢測物與第二檢測物的比率為約20:1至約1:20，更優(yōu)選約20:1至約1:1。

在具體實(shí)施方式中，第一和第二可檢測實(shí)體相同。在更具體的實(shí)施方式中，第一和第二可檢測實(shí)體均為金納米顆粒。在其他實(shí)施方式中，第一和第二可檢測實(shí)體不同。

在某些實(shí)施方式中，所述表面是側(cè)向流測定裝置中的流動通道，微孔板的表面或分析轉(zhuǎn)子中的流動通道。

如上所述，某些實(shí)施方式使用與可檢測實(shí)體綴合的第二檢測物，該第二檢測物是抗原或抗原性肽。在這些及相關(guān)實(shí)施方式的一些中，抗原或抗原性肽來自選自由心絲蟲，例如犬心絲蟲，犬埃里希體，沙費(fèi)埃里希體(Ehrlichia chaffeensis)，伊氏埃里希體，伯氏疏螺旋體，埃氏疏螺旋體，伽氏疏螺旋體，嗜吞噬細(xì)胞無形體，扁平無形體(Anaplasma platys)，貓白血病毒，細(xì)小病毒，例如犬細(xì)小病毒，流感A株，流感B株，禽流感病毒，呼吸道合胞體病毒，軍團(tuán)桿菌，腺病毒，輪狀病毒，貓免疫缺陷病毒，人免疫缺陷病毒和甲類鏈球菌組成的組的生物體。

在某些實(shí)施方式中，所述表面是側(cè)向流測定裝置中的流動通道或分析轉(zhuǎn)子中的流動通道。在具體實(shí)施方式中，測試樣品是血液、血清或血漿。

還包括抗體檢測裝置，其包含上樣區(qū)域；綴合區(qū)域，其中所述綴合區(qū)域包含可移動的第一檢測物，所述第一檢測物包括與第一可檢測實(shí)體綴合的Fc結(jié)合分子；以及測試區(qū)域，其中所述測試區(qū)域包含能夠與所述抗體特異性結(jié)合的固定的捕獲實(shí)體；其中所述上樣區(qū)域，綴合區(qū)域和測試區(qū)域被設(shè)置使得在操作中，液體樣品被施加至上樣區(qū)域時(shí)，與綴合區(qū)域和測試區(qū)域流體連通。在某些實(shí)施方式中，所述Fc結(jié)合分子是蛋白A和/或蛋白G。

在某些實(shí)施方式中，捕獲實(shí)體是抗原或抗原性肽。在具體實(shí)施方式中，抗原或抗原性肽來自選自由心絲蟲，例如犬心絲蟲，犬埃里希體，沙費(fèi)埃里希體，伊氏埃里希體，伯氏疏螺旋體，埃氏疏螺旋體，伽氏疏螺旋體，嗜吞噬細(xì)胞無形體，扁平無形體，貓白血病毒，細(xì)小病毒，例如犬細(xì)小病毒，流感A株，流感B株，禽流感病毒，呼吸道合胞體病毒，軍團(tuán)桿菌，腺病毒，輪狀病毒，貓免疫缺陷病毒，人免疫缺陷病毒和甲類鏈球菌組成的組的生物體。

在具體實(shí)施方式中，第一可檢測實(shí)體是金屬納米顆粒、金屬納米殼、熒光團(tuán)或有色乳膠顆粒。在具體實(shí)施方式中，金屬納米顆?；蚪饘偌{米殼選自由金顆粒、銀顆粒、銅顆粒、鉑顆粒、鎘顆粒、復(fù)合顆粒、金空心球、金涂覆二氧化硅納米殼和二氧化硅涂覆金殼組成的組。

在某些實(shí)施方式中，所述裝置進(jìn)一步包含對照區(qū)域，當(dāng)液體樣品施加至上樣區(qū)域時(shí)，該對照區(qū)域與液體樣品流體連通。在某些實(shí)施方式中，對照區(qū)域包含能夠與對照檢測物特異性結(jié)合的固定的結(jié)合配偶體。

在具體實(shí)施方式中，第一檢測物包含與第一可檢測實(shí)體綴合的蛋白A或蛋白G，且所述固定的結(jié)合配偶體是抗蛋白A或抗蛋白G抗體。

某些裝置進(jìn)一步包含位于測試區(qū)域下游的吸收墊(absorbent pad)。在某些裝置中，綴合區(qū)域位于上樣區(qū)域的上游。在某些實(shí)施方式中，綴合區(qū)域位于上樣區(qū)域的下游。在某些實(shí)施方式中，上樣區(qū)域包含血液分離材料。在某些情況下，綴合區(qū)域進(jìn)一步包含可移動的第二檢測物，其中第二檢測物包含與第二可檢測實(shí)體綴合的抗原或抗原性肽，所述抗原或抗原性肽能夠與抗體特異性結(jié)合?？梢哉{(diào)整第一檢測物(例如與第一可檢測實(shí)體綴合的Fc結(jié)合分子，如蛋白A和/或蛋白G)與第二檢測物(與第二可檢測實(shí)體綴合的抗原/抗原性肽)的比率，從而選擇期望的信號放大水平。在某些實(shí)施方式中，第一檢測物與第二檢測物的比率為約20:1至約1:20。在其他實(shí)施方式中，第一檢測物與第二檢測物的比率為約20:1至約1:1。

在具體實(shí)施方式中，第一和第二可檢測實(shí)體相同。在具體實(shí)施方式中，第一和第二可檢測實(shí)體是金納米顆粒。在其他實(shí)施方式中，第一和第二可檢測實(shí)體不同。

在具體實(shí)施方式中，例如檢測抗微生物抗體中，所述抗原或抗原性肽來自選自由心絲蟲，例如犬心絲蟲，犬埃里希體，沙費(fèi)埃里希體，伊氏埃里希體，伯氏疏螺旋體，埃氏疏螺旋體，伽氏疏螺旋體，嗜吞噬細(xì)胞無形體，扁平無形體，貓白血病毒，細(xì)小病毒，例如犬細(xì)小病毒，流感A株，流感B株，禽流感病毒，呼吸道合胞體病毒，軍團(tuán)桿菌，腺病毒，輪狀病毒，貓免疫缺陷病毒，人免疫缺陷病毒和甲類鏈球菌組成的組的生物體。

還包括試劑盒，其包含本文所述的一種或多種檢測裝置和系統(tǒng)，以及使用該裝置或系統(tǒng)檢測測試樣品中的抗體的說明書。某些試劑盒進(jìn)一步包含第二檢測物和將第二檢測物與測試樣品在施加到檢測系統(tǒng)的上樣區(qū)域之前組合的說明書，其中所述第二檢測物包含與第二可檢測實(shí)體綴合的抗原或抗原性肽，所述抗原或抗原性肽能夠與所述抗體特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，說明書規(guī)定將第二檢測物與測試樣品組合，這樣第二檢測物將以與第一檢測物特定的比率存在，以實(shí)現(xiàn)期望的信號放大水平。

還包括檢測測試樣品中的抗體的方法，其包含將測試樣品施加于本文所述的一種或多種檢測裝置或系統(tǒng)的上樣區(qū)域，并檢測來自測試區(qū)域中的第一可檢測實(shí)體的信號的存在或不存在。某些方法進(jìn)一步包含將第二檢測物與測試樣品在施加到檢測系統(tǒng)的上樣區(qū)域之前組合，其中所述第二檢測物包含與第二可檢測實(shí)體綴合的抗原或抗原性肽，所述抗原或抗原性肽能夠與抗體特異性結(jié)合。

某些實(shí)施方式涉及一種或多種捕獲復(fù)合物，其包含捕獲實(shí)體，測試樣品中的抗體，以及第一檢測物，其中捕獲實(shí)體與所述抗體結(jié)合，并且其中第一檢測物包含與第一可檢測實(shí)體綴合的Fc結(jié)合分子，并與所述抗體的Fc區(qū)域結(jié)合。這些及相關(guān)實(shí)施方式中的一些進(jìn)一步包含第二檢測物，其中第二檢測物與所述抗體的可變區(qū)特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，捕獲復(fù)合物固定于表面的測試區(qū)域。

具體地，本申請?zhí)峁┤缦赂黜?xiàng)：

1.用于檢測測試樣品中的抗體的方法，其包含：

(a)使所述測試樣品與第一檢測物接觸以形成包含第一檢測物和所述抗體的第一復(fù)合物，其中第一檢測物包含與第一可檢測實(shí)體綴合的Fc結(jié)合分子；

(b)使第一復(fù)合物與固定于表面的測試區(qū)域的捕獲實(shí)體接觸，其中所述捕獲實(shí)體能夠與所述抗體特異性結(jié)合；以及

(c)檢測來自所述測試區(qū)域中的第一可檢測實(shí)體的信號的存在，其中所述信號的存在表明所述測試樣品中存在所述抗體。

2.項(xiàng)1的方法，其中第一檢測物固定于表面的綴合區(qū)域，并且其中所述綴合區(qū)域與表面的測試區(qū)域不重疊。

3.項(xiàng)1的方法，其中所述Fc結(jié)合分子是蛋白A和/或蛋白G。

4.項(xiàng)1的方法，其中所述捕獲實(shí)體是抗原或抗原性肽。

5.項(xiàng)4的方法，其中所述抗原或抗原性肽來自選自由心絲蟲、犬埃里希體(Ehrlichia canis)、沙費(fèi)埃里希體(Ehrlichia chaffeensis)、伊氏埃里希體(Ehrlichia ewingii)、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、埃氏疏螺旋體(Borrelia afzelii)、伽氏疏螺旋體(Borrelia garinii)、嗜吞噬細(xì)胞無形體(Anaplasma phagocytophilum)、扁平無形體(Anaplasma platys)、貓白血病毒、細(xì)小病毒、流感A株、流感B株、禽流感病毒、呼吸道合胞體病毒、軍團(tuán)桿菌(Legionella)、腺病毒、輪狀病毒、貓免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒和甲類鏈球菌(Streptococcus)組成的組的生物體。

6.項(xiàng)1的方法，其中第一可檢測實(shí)體是金屬納米顆粒、金屬納米殼、熒光團(tuán)或有色乳膠顆粒。

7.項(xiàng)6的方法，其中所述金屬納米顆?；蚪饘偌{米殼選自由金顆粒、銀顆粒、銅顆粒、鉑顆粒、鎘顆粒、復(fù)合顆粒、金空心球、金涂覆二氧化硅納米殼和二氧化硅涂覆金殼組成的組。

8.項(xiàng)1的方法，其進(jìn)一步包含使所述測試樣品與第二檢測物接觸，其中第二檢測物包含與第二可檢測實(shí)體綴合的抗原或抗原性肽，所述抗原或抗原性肽能夠與所述抗體特異性結(jié)合。

9.項(xiàng)8的方法，其中第一和第二檢測物固定于綴合區(qū)域，其中所述綴合區(qū)域與表面的測試區(qū)域不重疊。

10.項(xiàng)2或9的方法，其中所述綴合區(qū)域進(jìn)一步包含對照檢測物。

11.項(xiàng)8的方法，其中第一和第二可檢測實(shí)體相同。

12.項(xiàng)11的方法，其中第一和第二可檢測實(shí)體是金納米顆粒。

13.項(xiàng)8的方法，其中第一和第二可檢測實(shí)體不同。

14.項(xiàng)8的方法，其中所述表面是側(cè)向流測定裝置中的流動通道、微孔板的表面或分析轉(zhuǎn)子中的流動通道。

15.項(xiàng)8的方法，其中所述抗原或抗原性肽來自選自由心絲蟲、犬埃里希體、沙費(fèi)埃里希體、伊氏埃里希體、伯氏疏螺旋體、埃氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體、嗜吞噬細(xì)胞無形體、扁平無形體、貓白血病毒、細(xì)小病毒、流感A株、流感B株、禽流感病毒、呼吸道合胞體病毒、軍團(tuán)桿菌、腺病毒、輪狀病毒、貓免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒和甲類鏈球菌組成的組的生物體。

16.項(xiàng)8的方法，其中第一檢測物與第二檢測物以約20:1至約1:1的比率存在。

17.項(xiàng)16的方法，其中第一檢測物包含與第一可檢測實(shí)體綴合的Fc結(jié)合分子，并且其中所述Fc結(jié)合分子是蛋白A和/或蛋白G。

18.項(xiàng)16的方法，其中第一檢測物包含各自與第一可檢測實(shí)體綴合的蛋白A和蛋白G。

19.項(xiàng)18的方法，其中蛋白A和蛋白G以約10:1至約1:10的比率存在。

20.項(xiàng)1的方法，其中所述表面是側(cè)向流測定裝置中的流動通道或分析轉(zhuǎn)子中的流動通道。

21.項(xiàng)1的方法，其中所述測試樣品是體液、身體器官提取物、血液、血清或血漿。

22.抗體檢測裝置，其包含：

上樣區(qū)域；

綴合區(qū)域，其中所述綴合區(qū)域包含可移動的第一檢測物，所述第一檢測物包括與第一可檢測實(shí)體綴合的Fc結(jié)合分子；以及

測試區(qū)域，其中所述測試區(qū)域包含能夠與所述抗體特異性結(jié)合的固定的捕獲實(shí)體；

其中所述上樣區(qū)域、綴合區(qū)域和測試區(qū)域被設(shè)置使得在操作中，當(dāng)被施加至上樣區(qū)域時(shí)，液體樣品與綴合區(qū)域和測試區(qū)域流體連通。

23.項(xiàng)22的檢測裝置，其中所述Fc結(jié)合分子是蛋白A和/或蛋白G。

24.項(xiàng)22的檢測裝置，其中所述捕獲實(shí)體是抗原或抗原性肽。

25.項(xiàng)24的檢測裝置，其中所述抗原或抗原性肽來自選自由心絲蟲、犬埃里希體、沙費(fèi)埃里希體、伊氏埃里希體、伯氏疏螺旋體、埃氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體、嗜吞噬細(xì)胞無形體、扁平無形體、貓白血病毒、細(xì)小病毒、流感A株、流感B株、禽流感病毒、呼吸道合胞體病毒、軍團(tuán)桿菌、腺病毒、輪狀病毒、貓免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒和甲類鏈球菌組成的組的生物體。

26.項(xiàng)22的檢測裝置，其中第一可檢測實(shí)體是金屬納米顆粒、金屬納米殼、熒光團(tuán)或有色乳膠顆粒。

27.項(xiàng)26的檢測裝置，其中所述金屬納米顆?；蚪饘偌{米殼選自由金顆粒、銀顆粒、銅顆粒、鉑顆粒、鎘顆粒、復(fù)合顆粒、金空心球、金涂覆二氧化硅納米殼和二氧化硅涂覆金殼組成的組。

28.項(xiàng)22的檢測裝置，其中所述裝置進(jìn)一步包含對照區(qū)域，當(dāng)液體樣品施加至上樣區(qū)域時(shí)，所述對照區(qū)域與液體樣品流體連通。

29.項(xiàng)28的檢測裝置，其中所述對照區(qū)域包含能夠與對照檢測物特異性結(jié)合的固定的結(jié)合配偶體。

30.項(xiàng)29的檢測裝置，其中所述第一檢測物包含與第一可檢測實(shí)體綴合的蛋白A或蛋白G，所述固定的結(jié)合配偶體是抗蛋白A或抗蛋白G抗體。

31.項(xiàng)22的檢測裝置，其進(jìn)一步包含位于所述測試區(qū)域下游的吸收墊。

32.項(xiàng)22的檢測裝置，其中所述綴合區(qū)域位于所述上樣區(qū)域的上游。

33.項(xiàng)22的檢測裝置，其中所述綴合區(qū)域位于所述上樣區(qū)域的下游。

34.項(xiàng)22的檢測裝置，其中所述上樣區(qū)域包含血液分離材料。

35.項(xiàng)22的檢測裝置，其中所述綴合區(qū)域進(jìn)一步包含可移動的第二檢測物，其中第二檢測物包含與第二可檢測實(shí)體綴合的抗原或抗原性肽，所述抗原或抗原性肽能夠與所述抗體特異性結(jié)合。

36.項(xiàng)35的檢測裝置，其中第一和第二可檢測實(shí)體相同。

37.項(xiàng)36的檢測裝置，其中第一和第二可檢測實(shí)體是金納米顆粒。

38.項(xiàng)35的檢測裝置，其中第一和第二可檢測實(shí)體不同。

39.項(xiàng)35的檢測裝置，其中所述抗原或抗原性肽來自選自由心絲蟲、犬埃里希體、沙費(fèi)埃里希體、伊氏埃里希體、伯氏疏螺旋體、埃氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體、嗜吞噬細(xì)胞無形體、扁平無形體、貓白血病毒、細(xì)小病毒、流感A株、流感B株、禽流感病毒、呼吸道合胞體病毒、軍團(tuán)桿菌、腺病毒、輪狀病毒、貓免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒和甲類鏈球菌組成的組的生物體。

40.項(xiàng)33的檢測裝置，其中第一可移動檢測物與第二可移動檢測物以約20:1至約1:1的比率存在。

41.項(xiàng)40的檢測裝置，其中第一可移動檢測物包含與第一可檢測實(shí)體綴合的Fc結(jié)合分子，并且其中所述Fc結(jié)合分子是蛋白A和/或蛋白G。

42.項(xiàng)40的檢測裝置，其中第一可移動檢測物包含各自與第一可檢測實(shí)體綴合的蛋白A和蛋白G。

43.項(xiàng)42的檢測裝置，其中蛋白A和蛋白G以約10:1至約1:10的比率存在。

44.試劑盒，其包含項(xiàng)22的檢測系統(tǒng)，以及使用所述系統(tǒng)檢測測試樣品中的抗體的說明書。

45.項(xiàng)44的試劑盒，其進(jìn)一步包含第二檢測物和將第二檢測物與測試樣品在施加到檢測系統(tǒng)的上樣區(qū)域之前組合的說明書，其中所述第二檢測物包含與第二可檢測實(shí)體綴合的抗原或抗原性肽，所述抗原或抗原性肽能夠與所述抗體特異性結(jié)合。

46.項(xiàng)45的試劑盒，其中第一可移動檢測物與第二檢測物以約20:1至約1:1的比率存在。

47.項(xiàng)46的試劑盒，其中第一可移動檢測物包含與第一可檢測實(shí)體綴合的Fc結(jié)合分子，并且其中所述Fc結(jié)合分子是蛋白A和/或蛋白G。

48.項(xiàng)46的試劑盒，其中第一檢測物包含各自與第一可檢測實(shí)體綴合的蛋白A和蛋白G。

49.項(xiàng)48的試劑盒，其中蛋白A和蛋白G以約10:1至約1:10的比率存在。

50.檢測測試樣品中的抗體的方法，其包括將測試樣品施加于項(xiàng)22的檢測系統(tǒng)的上樣區(qū)域，檢測來自測試區(qū)域中的第一可檢測實(shí)體的信號的存在或不存在。

51.項(xiàng)50的方法，其進(jìn)一步包括將第二檢測物與所述測試樣品在施加到檢測系統(tǒng)的上樣區(qū)域之前組合，其中所述第二檢測物包含與第二可檢測實(shí)體綴合的抗原或抗原性肽，所述抗原或抗原性肽能夠與所述抗體特異性結(jié)合。

52.項(xiàng)51的方法，其中第二檢測物被添加至測試樣品，這樣第二檢測物將以與第一可移動檢測物約20:1至約1:1的比率存在。

53.捕獲復(fù)合物，其包含捕獲實(shí)體、測試樣品中的抗體、以及第一檢測物，其中所述捕獲實(shí)體與所述抗體結(jié)合，并且其中第一檢測物包含與第一可檢測實(shí)體綴合的Fc結(jié)合分子并與所述抗體的Fc區(qū)域結(jié)合。

54.項(xiàng)53的捕獲復(fù)合物，其進(jìn)一步包含第二檢測物，其中第二檢測物與所述抗體的可變區(qū)域特異性結(jié)合。

55.項(xiàng)53的捕獲復(fù)合物，其中所述捕獲復(fù)合物固定于表面的測試區(qū)域。

附圖說明

圖1顯示本發(fā)明捕獲復(fù)合物的一個(gè)實(shí)例，其具有被固定于測試表面(例如硝酸纖維素)的捕獲實(shí)體(例如與BSA綴合的抗體特異性抗原)捕獲的感興趣的抗體，與靶抗體的Fc區(qū)域結(jié)合的可檢測的Fc結(jié)合分子-綴合物(例如蛋白A-或蛋白G-膠體金綴合物)，以及任選存在的與感興趣的抗體的可變區(qū)結(jié)合的第二可檢測綴合物(例如抗原-膠體金綴合物)。

圖2顯示側(cè)向流裝置的一個(gè)實(shí)例，以及根據(jù)本發(fā)明的方法。感興趣的抗體特異性的抗原性肽與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)連接，產(chǎn)生的BSA-肽綴合物在硝酸纖維素上用于捕獲。該相同的抗原性肽進(jìn)一步與膠體金綴合，其在該示例性測定中作為標(biāo)記。通過向綴合物混合物中添加蛋白A/G-金綴合物，產(chǎn)生的信號被進(jìn)一步放大。

圖3顯示隨時(shí)間的萊姆病特異性的側(cè)向流測定的樣品流，其中使用圖2所示的側(cè)向流裝置。在該示例性測定中，一滴血液，血清或血漿(約15-20μL，通過移液管)與四滴膠體金綴合物溶液(約30μL，來自滴瓶)在反應(yīng)管中混合。生成的反應(yīng)混合物的一滴轉(zhuǎn)移至放置于平坦表面的測試盒的樣品部分。血液分離墊從全血中過濾血細(xì)胞(參見圖2)。血漿(或血清)和伯氏疏螺旋體抗體綴合復(fù)合物遷移至包含測試和對照區(qū)域的硝酸纖維素膜。滴加三(3)滴(約60μL，來自滴瓶)Chase緩沖液(施加樣品后一分鐘)，使全部混合物通過硝酸纖維素，向上部吸收墊遷移，該吸收墊持續(xù)地牽引液體。陽性樣品中存在的伯氏疏螺旋體特異性抗體已經(jīng)與金標(biāo)記的抗原綴合物復(fù)合。標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物向測試線遷移，此處固定的抗原通過抗體上的第二結(jié)合位點(diǎn)捕獲標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物。綴合混合物中存在的蛋白A/G-金綴合物與靶抗體的Fc區(qū)域結(jié)合，并放大測試信號。游離的標(biāo)記抗原和剩余反應(yīng)混合物前行至對照線，此處蛋白A-金綴合物被包含雞抗蛋白A抗體的對照捕獲物捕獲。在此情況下，裝置約8分鐘可觀察結(jié)果。測試區(qū)域的一條紅線和對照區(qū)域的第二條紅線的出現(xiàn)，表明伯氏疏螺旋體抗體的存在。僅對照區(qū)域出現(xiàn)一條線表明不存在伯氏疏螺旋體抗體。如果(a)出現(xiàn)測試線，而未形成對照線，或(b)對照線或測試線均未形成，則該測試被視為無效。

發(fā)明詳述

本文所用以下術(shù)語具有如下意思：

本文所用冠詞“一(a)”和“一(an)”是指一個(gè)或多于一個(gè)(即至少一個(gè))冠詞的語法對象。以舉例的方式，“元件”是指一個(gè)元件或多于一個(gè)元件。

本文所用的“大約”指數(shù)量、水平、數(shù)值、數(shù)字、頻率、百分比、尺寸、大小、總數(shù)、重量或長度，其變化多達(dá)參照數(shù)量、水平、數(shù)值、數(shù)字、頻率、百分比、尺寸、大小、總數(shù)、重量或長度的30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。

本說明書自始至終，除非上下文另有要求，詞語“包含(comprise)”、“包含(comprises)”以及“包含(comprising)”將理解為意指包含陳述的步驟或成分，或步驟或成分的群組，但是并不排除任一其他的步驟或成分，或步驟或成分的群組。

本文所用的“由…組成(consisting of)”指包括并且限于，跟隨短語“由……組成(consisting of)”的無論什么。因此，短語“由…組成(consisting of)”表明所列舉的成分為必須的或強(qiáng)制的，并且沒有其他的成分可能存在。本文所用的“基本上由……組成(consisting essentially of)”指包括任意該短語后所列舉的成分并且限于不干擾或促進(jìn)本公開中針對所列舉的成分的指定的活性或作用。因此，短語“基本上由……組成(consisting essentially of)”表明所列舉的成分為必須的或強(qiáng)制的，但是其他的成分為任選的并且取決于它們是否實(shí)質(zhì)地影響所列舉的成分的活性或作用，可以或不可以存在。

術(shù)語“肽”、“多肽”以及“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物及其變體和合成及天然發(fā)生的類似物。因此，這些術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是合成的非天然存在的氨基酸(例如相應(yīng)的天然存在的氨基酸的化學(xué)類似物)的氨基酸聚合物，也適用于天然存在的氨基酸聚合物及其天然存在的化學(xué)衍生物。

“增加的”或“提高的”量任選地是“統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的”量，并且可以包括相對于例如在無可檢測的Fc結(jié)合分子時(shí)進(jìn)行的抗體測試的量或值(例如信號或數(shù)值，如反應(yīng)評分)的約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更大倍數(shù)(包括其間大于1的所有整數(shù)和小數(shù)，例如2.5、3.6、3.7)的增加?！霸黾拥摹被颉疤岣叩摹敝祷蛄恳部砂ㄏ鄬τ诶缭跓o可檢測的Fc結(jié)合分子時(shí)進(jìn)行的抗體測試的量或值的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％或更多的增加。

本文引用的所有出版物、專利和專利申請都以其整體通過引用并入本文。

方法

一方面，本發(fā)明包括用于檢測測試樣品中的抗體的方法。在某些實(shí)施方式中，這些方法涉及，在相關(guān)一部分，使測試樣品與綴合第一可檢測實(shí)體的Fc結(jié)合分子(即可檢測的Fc結(jié)合分子綴合物)接觸，形成第一復(fù)合物，使第一復(fù)合物與固定于表面的測試區(qū)域的捕獲實(shí)體接觸，其中捕獲實(shí)體能夠與所述抗體特異性結(jié)合，以及檢測來自測試區(qū)域中的可檢測的Fc結(jié)合分子綴合物的信號的存在。其中信號的存在表明測試樣品中存在所述抗體。

這些方法的反應(yīng)物可按任意順序或序列接觸。例如，測試樣品可在施加到表面之前與可檢測的Fc結(jié)合分子綴合物混合，或者這兩種反應(yīng)物可分別施加到表面，順序地或同時(shí)，在表面上相同或不同的位置。當(dāng)分別添加時(shí)，反應(yīng)物將在例如通過毛細(xì)管或其他作用在測試表面擴(kuò)散或流通時(shí)彼此接觸。在具體實(shí)施方式中，可檢測的Fc結(jié)合分子綴合物事先固定于表面的綴合區(qū)域，該綴合區(qū)域與表面的測試區(qū)域不重疊。在某些實(shí)施方式中，測試樣品被施加于表面，通過毛細(xì)管或其他作用流過綴合區(qū)域和測試區(qū)域，從而與Fc結(jié)合分子和捕獲實(shí)體接觸。如果樣品中存在感興趣的抗體，其將與可檢測的Fc結(jié)合分子和捕獲實(shí)體形成可檢測的復(fù)合物。在具體實(shí)施方式中，F(xiàn)c結(jié)合分子是蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L或其任意組合，例如其混合物或融合蛋白。

本文提供的某些方法進(jìn)一步包含使測試樣品與第二檢測物分子接觸。在這些實(shí)施方式中，第二檢測物可以是任意適合的抗體結(jié)合實(shí)體，例如與第二可檢測實(shí)體綴合并且能夠與抗體特異性結(jié)合的抗原或抗原性肽。如第二檢測物綴合物和第二可檢測實(shí)體的組合有時(shí)被稱為“可檢測的抗體特異性抗原綴合物”或“可檢測的抗原綴合物”，其包括肽抗原和非肽抗原。在某些實(shí)施方式中，第一和第二可檢測實(shí)體相同，即Fc結(jié)合分子綴合物和可檢測抗原綴合物均與相同類型的可檢測實(shí)體(例如金顆粒)綴合。在其他實(shí)施方式中，第一和第二可檢測實(shí)體不同。在具體實(shí)施方式中，第一和第二可檢測實(shí)體均為金納米顆粒，生成膠體金綴合物(CGC)。在這些及相關(guān)實(shí)施方式中，可檢測的Fc結(jié)合分子可被稱為“Fc結(jié)合分子-CGC”，具體的實(shí)例包括蛋白A-CGC、蛋白G-CGC、蛋白A/G-CGC、以及蛋白L-CGC。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)c結(jié)合分子是能與測試樣品中的抗體的Fc區(qū)域結(jié)合的二抗或其片段，第二檢測物可以是任意適合的抗體結(jié)合實(shí)體，例如抗原或抗原性肽等。

與之前類似，這些方法中的反應(yīng)物可按任意順序或序列接觸。例如，測試樣品可在施加到表面之前與可檢測的Fc結(jié)合分子綴合物、可檢測的抗原綴合物、或其二者混合，或者這三個(gè)反應(yīng)物可分別施加到表面，順序地或同時(shí)，在表面上相同或不同的位置。當(dāng)分別添加時(shí)，反應(yīng)物將在例如通過毛細(xì)管或其他作用在測試表面擴(kuò)散或流通時(shí)彼此接觸。

在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)c結(jié)合分子綴合物固定于表面的綴合區(qū)域，該綴合區(qū)域與測試區(qū)域不重疊，測試樣品和可檢測的抗原綴合物分別或共同施加至表面。在其他實(shí)施方式中，可檢測的抗原綴合物固定于表面的綴合區(qū)域，該綴合區(qū)域與測試區(qū)域不重疊，測試樣品和可檢測的Fc結(jié)合分子綴合物分別或共同施加至表面。在某些實(shí)施方式中，可檢測的Fc結(jié)合分子綴合物與可檢測的抗原綴合物均固定于表面的綴合區(qū)域，該綴合區(qū)域與表面測試區(qū)域不重疊，測試樣品施加至測試區(qū)域。在施加至表面后，測試樣品(單獨(dú)或與其他反應(yīng)物結(jié)合)可通過毛細(xì)管或其他作用在表面流通或擴(kuò)散，通過綴合區(qū)域(如果存在)和測試區(qū)域，從而與可檢測的Fc結(jié)合分子綴合物、可檢測的抗原綴合物和捕獲實(shí)體接觸。如果樣品中存在感興趣的抗體，其將與這些反應(yīng)物形成一個(gè)或多個(gè)可檢測復(fù)合物，從而表明樣品中抗體的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，這些示例性組合并非限制性的，還存在其他可能性。

在某些實(shí)施方式中，綴合區(qū)域進(jìn)一步包含對照檢測物，例如與Fc結(jié)合分子特異性結(jié)合的抗體。其他類型的對照區(qū)域?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。

測試樣品通常是獲自對象的生物學(xué)樣品，其含有或疑似含有感興趣的抗體，例如某感染原特異性的抗體。生物樣品優(yōu)選易于獲得，并可包括源自靜脈血樣品，或甚至源于指血的血液，血清或血漿。來自其他身體部位的組織或其他體液(例如腦脊髓液(CSF)、唾液、胃液分泌、粘液、尿、糞便等)已知含有抗體，可用作測試樣品來源。在其他實(shí)施方式中，樣品是提取自身體器官的組織(例如組織勻漿)或細(xì)胞裂解物。在某些實(shí)施方式中，對象是野生動物(例如鹿或嚙齒動物，如小鼠、花栗鼠、松鼠等)。在其他實(shí)施方式中，對象是實(shí)驗(yàn)室動物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猴、靈長動物等)。在其他實(shí)施方式中，對象是家養(yǎng)或野生動物(例如狗、貓、馬)。在仍其他實(shí)施方式中，對象是人。

抗體，又稱作免疫球蛋白，是免疫系統(tǒng)的Y形的蛋白，其特異性識別外源物體或抗原，例如細(xì)菌、酵母、寄生蟲和病毒組分。抗體的“Y”的每個(gè)尖端包含對抗原上的特定表位特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)，使得這兩種結(jié)構(gòu)精確地相互結(jié)合。當(dāng)暴露于與抗體特異性結(jié)合的抗原(例如微生物抗原)時(shí)，該抗體的產(chǎn)量增加。因此，檢測來自對象樣品中的抗原特異性抗體可表明該對象當(dāng)前是否接觸，或之前是否曾接觸某一微生物，例如病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲。

可結(jié)晶片段區(qū)域(Fc區(qū)域)是抗體的尾部區(qū)域，其與細(xì)胞表面的Fc受體和補(bǔ)體系統(tǒng)的某些蛋白相互作用。在IgG、IgA和IgD抗體同種型中，F(xiàn)c區(qū)域由兩個(gè)相同蛋白片段組成，其源自抗體兩個(gè)重鏈的第二和第三恒定區(qū)。IgM和IgE的Fc區(qū)域的每個(gè)多肽鏈中包含三個(gè)重鏈恒定區(qū)(C_H區(qū)2-4)。IgG抗體的Fc區(qū)域具有高度保守的N-糖基化位點(diǎn)。附著于該位點(diǎn)的N-聚糖主要是復(fù)合物類型的核心巖藻糖化的雙觸角結(jié)構(gòu)。另外，少量的這些N-聚糖還具有等分的GlcNAc和α-2,6連接的唾液酸殘基?？贵w的Fab區(qū)域包含決定抗體靶特異性的可變區(qū)，相比之下，每個(gè)物種的所有同類抗體的Fc區(qū)域均相同，它們是恒定不變的。

抗體的“抗原結(jié)合位點(diǎn)”或“結(jié)合部分”指免疫球蛋白分子參與抗原結(jié)合的部分?？乖Y(jié)合位點(diǎn)由重鏈(“H”)和輕鏈(“L”)N末端可變(“V”)區(qū)的氨基酸殘基組成。重鏈和輕鏈V區(qū)中的三個(gè)高度差異化的區(qū)段被稱為“高變區(qū)”，其位于更保守的名為“框架區(qū)”或“FR”的兩側(cè)區(qū)段之間。因此，術(shù)語“FR”指天然發(fā)現(xiàn)的位于免疫球蛋白高變區(qū)之間并與之鄰近的氨基酸序列。在抗體分子中，輕鏈的三個(gè)高變區(qū)和重鏈的三個(gè)高變區(qū)在三維空間上彼此相對分布，形成抗原結(jié)合表面?？乖Y(jié)合表面與被結(jié)合抗原的三維表面互補(bǔ)，每條重鏈和輕鏈的三個(gè)高變區(qū)被稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”。

典型地，抗體包含全部或部分Fc區(qū)域，有助于被Fc結(jié)合分子檢測，抗體還可包含一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，有助于被抗體特異性結(jié)合劑，例如抗原或抗原性肽檢測?？贵w可以屬于例如IgG、IgE、IgD、IgM或IgA類型。通常，檢測IgM和/或IgA抗體，例如用于早期感染檢測。

Fc結(jié)合分子包括特異性結(jié)合抗體的Fc區(qū)域或抗體可變區(qū)外的任意區(qū)域的任意結(jié)合劑。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)c結(jié)合分子不是抗體或其抗原結(jié)合片段。在其他實(shí)施方式中，F(xiàn)c結(jié)合分子是Fc特異性二抗，例如兔抗狗抗體，山羊抗狗抗體。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)c結(jié)合分子是針對測試樣品中待測抗體的二抗。Fc結(jié)合分子的一般性實(shí)例包括多肽、可溶受體、adnectin、小肽、肽模擬物、小分子、適體等，其特異性結(jié)合免疫球蛋白的Fc區(qū)域。Fc結(jié)合分子的具體實(shí)例包括蛋白A、蛋白G、蛋白A/G融合蛋白、蛋白L，及其片段和可變體，其保留與抗體Fc區(qū)域特異性結(jié)合的能力。

蛋白A是40-60kDa的MSCRAMM(識別粘連基質(zhì)分子的微生物表面成分)表面蛋白，于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)細(xì)胞壁中被發(fā)現(xiàn)，由spa基因編碼。野生型蛋白A由五個(gè)同源的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，其折疊成三螺旋束，并能夠分別與抗體的Fc區(qū)域結(jié)合。蛋白A與人IgG1和IgG2以高親和性結(jié)合，并與人IgM、IgA和IgE以中等親和性結(jié)合。

蛋白G是在C型和G型鏈球菌中表達(dá)的免疫球蛋白結(jié)合蛋白(參見，例如Sjobring et al.,J Biol Chem.266:399–405,1991)。蛋白G的核磁共振溶液結(jié)構(gòu)(參見Lian et al.,Journal of Mol.Biol.228:1219-1234,1992)和晶體結(jié)構(gòu)(參見Derrick and Wigley,Journal of Mol.Biol.243:906-918,1994)已經(jīng)解析到了1埃。蛋白A和蛋白G是本領(lǐng)域熟知的，并以多種綴合和非綴合形式可供商購。

還包括全長或野生型蛋白A和蛋白G的功能性變體和片段。在某些實(shí)施方式中，變體多肽包括與蛋白A和/或蛋白G的野生型序列具有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更多的序列相同性或相似性的氨基酸序列。功能性片段可以是多肽片段，其為，例如，野生型蛋白A和/或蛋白G的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、450、500個(gè)或更多的連續(xù)或不連續(xù)殘基。蛋白A和蛋白G的變體和片段通常保持與一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白同種型的Fc區(qū)域的特異性結(jié)合。

序列相同性百分比具有本領(lǐng)域公認(rèn)的含義，有多種方法檢測兩個(gè)多肽或多核苷酸序列之間的相同性。參見，例如Lesk,Ed.,Computational Molecular Biology,Oxford University Press,New York,(1988)；Smith,Ed.,Biocomputing:Informatics And Genome Projects,Academic Press,New York,(1993)；Griffin&Griffin,Eds.,Computer Analysis Of Sequence Data,Part I,Humana Press,New Jersey,(1994)；von Heinje,Sequence Analysis In Molecular Biology,Academic Press,(1987)；以及Gribskov&Devereux,Eds.,Sequence Analysis Primer,M Stockton Press,New York,(1991)。用于比對多核苷酸或多肽的方法被編成計(jì)算機(jī)程序，包括GCG程序包(Devereux et al.,Nuc.Acids Res.12:387(1984))，BLASTP，BLASTN，F(xiàn)ASTA(Atschul et al.,J Molec.Biol.215:403(1990))，以及Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,Wis.53711)，其使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.App.Math.,2:482-489(1981))。例如，可使用利用FASTA算法的計(jì)算機(jī)程序ALIGN，進(jìn)行仿射空位搜索，空位開放罰分為-12，空位擴(kuò)展罰分為-2。

還涉及包含F(xiàn)c結(jié)合多肽的融合蛋白，包括蛋白A融合和蛋白G融合。Fc結(jié)合分子可與另一個(gè)Fc結(jié)合分子的整體或部分融合，或與一個(gè)或多個(gè)異源多肽融合。一個(gè)蛋白A/G融合蛋白的具體實(shí)例將蛋白A的4個(gè)Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域與蛋白G的2個(gè)Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合(參見例如Sikkema,J.W.D.,Amer.Biotech.Lab,7:42,1989；以及Eliasson et al.,J.Biol.Chem.263,4323-4327,1988)，然而，也可使用其他組合方式。融合配偶體(例如肽或其他配基)可用于改進(jìn)純化、改進(jìn)溶解度、提高多肽在宿主細(xì)胞中的表達(dá)、輔助檢測、以及穩(wěn)定多肽等。融合配偶體的實(shí)例包括載體蛋白(例如血清白蛋白，如牛血清白蛋白)、β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、組氨酸標(biāo)簽等。

捕獲實(shí)體可以是與感興趣的抗體特異性結(jié)合的任意結(jié)合劑，該抗體是由本文所述方法和裝置檢測的靶抗體，例如微生物特異性抗體。典型地，捕獲實(shí)體與抗體可變區(qū)特異性結(jié)合，因而包含抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性的一個(gè)或多個(gè)表位。在某些實(shí)施方式中，捕獲實(shí)體不是抗體或其抗原結(jié)合片段。在具體實(shí)施方式中，捕獲實(shí)體是與感興趣的抗體特異性結(jié)合的抗原或抗原性肽。示例性的抗原和抗原性肽如下所述。還包括可溶受體、adnectin、肽模擬物、小分子、適體等，其與感興趣的抗體即由本文所述方法檢測的抗體特異性結(jié)合。

如上所述，捕獲實(shí)體通常附著或固定于測試表面或底材上，例如固體或半固體支持物。附著可以是共價(jià)或非共價(jià)的，并可通過實(shí)現(xiàn)共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的與捕獲實(shí)體結(jié)合的部分促進(jìn)所述附著，例如對附著于載體、支持物或表面的組分具有高親和力的部分。例如，捕獲實(shí)體可以與配體(例如生物素)結(jié)合，與表面結(jié)合的組分可以是相應(yīng)的配體受體(例如親和素)?；蛘撸东@實(shí)體可以與配體受體(例如親和素)結(jié)合，與表面結(jié)合的組分可以是相應(yīng)的配體(例如生物素)。在免疫測定過程中，捕獲實(shí)體可在添加包含抗體的樣品之前或之后附著或固定在測試表面或底材上。

在具體實(shí)施方式中，測試表面是珠、斑點(diǎn)雜交、側(cè)向流測定裝置中的流動通道、或分析轉(zhuǎn)子中的流動通道。例如，捕獲實(shí)體可以附著或固定在多孔膜上，例如PVDF膜(如Immobilon^TM膜)、硝酸纖維素膜、聚乙烯膜、尼龍膜、或相似類型的膜。在其他實(shí)施方式中，測試表面或底材是試管或測試孔，例如適用于ELISA或其他夾心類型測定的平板(如微孔板)中的測試孔。在某些實(shí)施方式中，測試表面或底材是傳感器，例如電化學(xué)、光學(xué)或光電傳感器。

這些測試表面或底材可包含玻璃，基于纖維素的材料，熱塑性聚合物，例如聚乙烯、聚丙烯、或聚酯，由微粒材料組成的燒結(jié)結(jié)構(gòu)(例如玻璃或各種熱塑性聚合物)，或由硝酸纖維素、尼龍、聚砜等組成的澆筑膜。測試表面或底材可以是燒結(jié)的聚乙烯微粒，俗稱多孔聚乙烯，例如來自Chromex Corporation(Albuquerque,NM)，Porex^TM等的0.2-15微米的多孔聚乙烯。所有這些測試表面或底材材料可以適當(dāng)形狀使用，例如薄膜、片狀、或平板，或者它們可以涂覆或粘合或?qū)訅河谶m當(dāng)?shù)亩栊暂d體，例如紙、玻璃、塑料薄膜、或纖維。

將捕獲實(shí)體(例如肽)固定在固相上的適當(dāng)方法包括離子、疏水、共價(jià)相互作用等。與固體或半固體載體、支持物或表面的特異性或半特異性結(jié)合可通過捕獲實(shí)體實(shí)現(xiàn)，其具有與之結(jié)合的使得其與固體或半固體載體、支持物或表面共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的部分。例如，所述部分可以具有對附著于載體、支持物或表面的組分的親和力。在這種情況下，所述部分可以是，例如，與肽的氨基酸基團(tuán)(如6-氨基己酸)結(jié)合的生物素或生物素基或其類似物，而所述組分則是親和素、鏈霉親和素、中性親和素、或其類似物。在另一個(gè)可選的情況下，所述部分具有6個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基(例如6x-His標(biāo)簽)的氨基酸序列，所述載體包含負(fù)載Ni⁺⁺或Co⁺⁺離子的氨三乙酸(NTA)衍生物。除此之外，適當(dāng)?shù)妮d體、支持物和表面包括，但不限于，珠(例如磁珠，膠體顆粒或納米顆粒，如膠體金，或包含二氧化硅的納米顆粒，乳膠，聚苯乙烯，聚碳酸酯，或PDVF)，共聚物乳膠，例如苯乙烯二乙烯基苯，羥基化苯乙烯二乙烯基苯，聚苯乙烯，羧基聚苯乙烯，炭黑珠，未活化的或聚苯乙烯或聚氯乙烯活化的玻璃，環(huán)氧活化的多孔磁玻璃，明膠或多糖顆?；蚱渌鞍最w粒。

如上所述，抗原和抗原性肽可用作捕獲實(shí)體和/或抗體特異性檢測物。選取的抗原或抗原性肽能夠與靶抗體特異性結(jié)合，通常通過該抗體的一個(gè)或兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。因此，本文的術(shù)語“抗原”指能夠被抗體通過抗體的至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合的分子?？乖梢园粋€(gè)或多個(gè)表位，即特別的抗原連續(xù)或非連續(xù)區(qū)域，其與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合。表位可以是線性表位、順序表位、或構(gòu)象表位。

抗原可以是，例如，肽或其修飾形式，或非肽抗原，例如小分子。如上所述，抗原也可以包括可溶受體、adnectin、肽模擬物、小分子、適體等，其與感興趣的抗體特異性結(jié)合。

當(dāng)用作捕獲實(shí)體或“捕獲抗原”時(shí)，抗原或抗原性肽通常是非標(biāo)記的，并固定或附著于測試表面。對于某些實(shí)施方式，捕獲抗原可以與一個(gè)或多個(gè)異源蛋白，例如牛血清白蛋白或多抗原性肽(MAPS)融合或綴合或復(fù)合，以利于附著到測試表面或其他目的。

用作抗體特異性檢測物時(shí)，抗原或抗原性肽通常與可檢測實(shí)體綴合，從而形成“可檢測抗原綴合物”。在某些實(shí)施方式中，這些可檢測抗原綴合物也與一個(gè)或多個(gè)異源蛋白，例如牛血清白蛋白或MAPS融合或綴合或復(fù)合。如下所述，可檢測抗原綴合物可以設(shè)計(jì)用于直接或間接檢測。

還涉及包含抗原性肽的融合蛋白。抗原性肽可與具有相同或不同結(jié)合特異性(例如具有一個(gè)或多個(gè)相同或不同的表位)的一個(gè)或多個(gè)抗原性肽的全部或部分融合，或與一個(gè)或多個(gè)異源多肽融合。融合配偶體(例如肽或其他部分)可用于改進(jìn)純化、改進(jìn)溶解度、提高多肽在宿主細(xì)胞中的表達(dá)、輔助檢測、穩(wěn)定抗原性肽、促進(jìn)在測試表面的固定等。融合配偶體的實(shí)例包括載體蛋白(例如血清白蛋白，如牛血清白蛋白)、β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、組氨酸標(biāo)簽等。

抗原和抗原性肽，以及其他抗體特異性結(jié)合劑可來自不同來源。具體的實(shí)施方式包括那些來自微生物來源的，包括病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲。具體的實(shí)例包括來自心絲蟲，例如犬心絲蟲，犬埃里希體，伯氏疏螺旋體，埃氏疏螺旋體，伽氏疏螺旋體，嗜吞噬細(xì)胞無形體，貓白血病毒，細(xì)小病毒，例如犬細(xì)小病毒，流感A株，流感B株，禽流感病毒，呼吸道合胞體病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)，軍團(tuán)桿菌，腺病毒，甲類鏈球菌，貓免疫缺陷病毒(FIV)，輪狀病毒等的一種或多種的抗原。用于萊姆病抗體檢測的疏螺旋體(Borrelia)抗原的實(shí)例可見于美國申請13/667,909、美國專利US2011/0136155、以及WO 2011/063003(均以其整體通過引用并入本文)。用于埃里希體抗體檢測的埃里希體抗原的實(shí)例可見于美國申請61/712,578、美國專利2011/0124125和WO2011/063235(均以其整體通過引用并入本文)。

本文所述的方法使用的抗原性肽可通過合成化學(xué)制備(即“合成肽”)。在其他實(shí)施方式中，抗原性肽可用生物方法制造(即通過細(xì)胞機(jī)器，例如核糖體)。在某些實(shí)施方式中，抗原性肽是分離的。本文所用的“分離的”肽是通過合成或生物學(xué)方法制備，然后從用于制備該肽的化學(xué)物質(zhì)和/或細(xì)胞機(jī)器中至少部分地純化。在某些實(shí)施方式中，分離的肽是基本純的。本文所用術(shù)語“基本純”指分子(例如肽)基本不含細(xì)胞物質(zhì)(蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，糖類，核酸等)、培養(yǎng)基、化學(xué)物質(zhì)前體、用于合成該肽的化學(xué)物質(zhì)、或其組合?；炯兊碾木哂猩儆诩s40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％、1％或更少的細(xì)胞物質(zhì)、培養(yǎng)基、其他多肽、化學(xué)物質(zhì)前體、和/或用于合成該肽的化學(xué)物質(zhì)。相應(yīng)地，基本純的分子(例如肽)可以占感興趣的分子的干重至少約60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％。分離的肽可在水中，緩沖液中，或是等待重建的干燥形式，例如，作為試劑盒的一部分。分離的肽可以藥學(xué)上可接受的鹽的形式存在。能夠與本發(fā)明的肽形成鹽的適當(dāng)?shù)乃岷蛪A為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括無機(jī)和有機(jī)酸和堿。

如果感興趣的抗體，或其抗原結(jié)合片段與捕獲實(shí)體或抗體特異性檢測物以可檢測的水平反應(yīng)(例如在側(cè)向流測定、蛋白質(zhì)印跡、或ELISA測定中)，并且在相似條件下不與無關(guān)多肽或試劑以統(tǒng)計(jì)上顯著的方式可檢測地反應(yīng)，則被稱為與捕獲實(shí)體或抗體特異性檢測物(例如抗原或抗原性肽)“特異性結(jié)合”、“免疫性結(jié)合”、和/或“免疫性反應(yīng)”。術(shù)語“特異性結(jié)合”也可指捕獲實(shí)體或抗體特異性檢測物對感興趣的抗體比對樣品中的其他抗體具有更高的親和力(例如更高程度的選擇性)。

本文所用的免疫性結(jié)合通常指非共價(jià)相互作用，其發(fā)生在免疫球蛋白分子和該免疫球蛋白特異性的抗原之間。結(jié)合，例如免疫性結(jié)合相互作用的強(qiáng)度或親和力可用相互作用的解離常數(shù)(K_d)來表示，其中，K_d越小代表親和力越高。可利用本領(lǐng)域已知的方法對選取的多肽的免疫性結(jié)合性能進(jìn)行定量(參見例如Davies et al.,Annual Rev.Biochem.59:439-473,1990)。在某些示例性的實(shí)施方式中，抗體對捕獲實(shí)體或抗體特異性檢測物(例如抗原或抗原性肽)具有至少約0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、或50nM的親和力。作為另一個(gè)實(shí)例，捕獲實(shí)體或抗體特異性檢測物對抗體的親和力是對樣品中其他抗體親和力的至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍或更高。

相似地，如果Fc結(jié)合分子與Fc區(qū)域以可檢測的水平反應(yīng)，并且在相似條件下不與無關(guān)多肽或試劑以統(tǒng)計(jì)上顯著的方式可檢測地反應(yīng)，則被稱為與免疫球蛋白的Fc區(qū)域“特異性結(jié)合”。在某些示例性的實(shí)施方式中，F(xiàn)c結(jié)合分子對選取的免疫球蛋白同種型的Fc區(qū)域具有至少約0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、或50nM的親和力。某些Fc結(jié)合分子相對于其他Fc結(jié)合分子，對一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白同種型具有更強(qiáng)或更弱的親和力。

該親和力或特異性程度可通過多種常規(guī)程序來確定，包括，例如競爭結(jié)合研究。在ELISA測定中，陽性反應(yīng)被定義為比一個(gè)對照或一組對照的均值高2或3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的值。

如前所示，某些檢測物分子，例如Fc結(jié)合分子、抗原、和/或抗原性肽與可檢測實(shí)體綴合。綴合通常通過共價(jià)結(jié)合實(shí)現(xiàn)?？蓹z測實(shí)體包括“直接可檢測實(shí)體”，例如金屬納米顆粒、金屬納米殼、彩色乳膠顆粒、放射性同位素和熒光團(tuán)，以及“間接可檢測實(shí)體”，其經(jīng)常依賴于配體-受體相互作用產(chǎn)生信號。在前一情況下，檢測物分子(例如抗原性肽，F(xiàn)c結(jié)合分子，如蛋白A/G)與直接可檢測實(shí)體綴合。在后一情況下，檢測物分子與配體綴合，然后所述配體與其配體受體相互作用，配體受體與直接可檢測實(shí)體綴合，或反之亦然。配體的實(shí)例包括生物素(例如通過半胱氨酸或賴氨酸殘基)，脂質(zhì)分子(例如通過半胱氨酸殘基)，以及載體蛋白(例如血清白蛋白)。與配體(例如生物素)連接可用于將檢測物與配體受體(例如親和素，鏈霉親和素或中性親和素)結(jié)合。親和素、鏈霉親和素、中性親和素繼而可與直接可檢測實(shí)體(例如可視的信號部分，如膠體金，熒光配基，或酶，例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)連接?；蛘?，檢測物分子可與配體受體，例如親和素、鏈霉親和素或中性親和素融合或連接，從而有利于與相應(yīng)配體的結(jié)合，其繼而與直接可檢測實(shí)體連接。其他配體-受體對的實(shí)例是本領(lǐng)域熟知的，可類似地使用。

直接可檢測實(shí)體(或信號配基)的實(shí)例包括放射性同位素、熒光團(tuán)、染料、酶、納米顆粒、彩色乳膠顆粒、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、發(fā)光染料、以及其他本文所述和本領(lǐng)域已知的。

可用作直接可檢測實(shí)體的放射性同位素的實(shí)例包括³²P、³³P、³⁵S、³H、和¹²⁵I。這些放射性同位素具有不同的半衰期、衰變類型和能級，可對其進(jìn)行調(diào)整以滿足特定方案的要求。例如，³H是低能量放射體，其產(chǎn)生較低的背景水平，然而較低的能量也導(dǎo)致放射自顯影和其他測量的時(shí)間較長。

可用作直接可檢測實(shí)體的熒光團(tuán)或熒光物的實(shí)例包括熒光素、四甲基羅丹明、德克薩斯紅、以及很多其他的熒光團(tuán)或熒光物(例如Haugland,Handbook of Fluorescent Probes-9th Ed.,2002,Molec.Probes,Inc.,Eugene OR；Haugland,The Handbook:A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies-10th Ed.,2005,Invitrogen,Carlsbad,CA)。還包括發(fā)光染料或其他可檢測染料。染料發(fā)出的光可以是可見光或不可見光，例如紫外或紅外光。在示例性實(shí)施方式中，染料可以是熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)染料；噸染料(xanthene dye)，例如熒光素和羅丹明；在α或β位具有氨基的染料(例如萘胺染料，1-二甲氨基萘基-5-磺酸，1-苯胺基-8-萘磺酸和2-對-甲苯胺基-6-萘磺酸)；含有3-苯基-7-異氰酸酯香豆素的染料；吖啶，例如9-異硫氰酸酯吖啶和吖啶橙；芘，苯并惡二唑和芪；含有3-(ε-羧甲基)-3′-乙基-5,5′-二甲基氧雜甲花青(CYA)；6-羧基熒光素(FAM)；5(6)-羧基羅丹明110(R110)；6-羧基羅丹明6G(R6G)；N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)；6-羧基-X-羅丹明(ROX)；6-羧基-4′,5′-二氯-2′,7′-二甲氧基熒光素(JOE)；ALEXA FLUOR^TM；Cy2；德克薩斯紅和羅丹明紅；6-甲氧基-2′,4,7,7′-四氯熒光素(TET)；6-甲氧基-2′,4,4′,5′,7,7′-六氯熒光素(HEX)；5-甲氧基-2′,4′,5′,7′-四氯熒光素(ZOE)；NAN；NED；Cy3；Cy3.5；Cy5；Cy5.5；Cy7；以及Cy7.5；IR800CW，ICG，Alexa Fluor 350；Alexa Fluor 488；Alexa Fluor 532；Alexa Fluor 546；Alexa Fluor 568；Alexa Fluor 594；Alexa Fluor 647；Alexa Fluor680，或Alexa Fluor 750。

非常小的顆粒，稱為納米顆粒，也可用作直接可檢測實(shí)體。這些顆粒通常尺寸為1-1000nm，包括不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，例如金和銀顆粒，以及量子點(diǎn)。當(dāng)被成角度入射的白光輻射時(shí)，40-120nm的銀或金納米顆粒會散射出高強(qiáng)度的單色光。散射光的波長取決于顆粒尺寸。四到五種緊密接近的不同的顆粒各自會散射出單色光，當(dāng)其重迭時(shí)，會產(chǎn)生特定而唯一的顏色。衍生納米顆粒，例如銀或金顆?？膳c一系列分子結(jié)合，包括蛋白質(zhì)、抗體、小分子、受體配體和核酸。納米顆粒的具體實(shí)例包括金屬納米顆粒和金屬納米殼，例如金顆粒、銀顆粒、銅顆粒、鉑顆粒、鎘顆粒、復(fù)合顆粒、金空心球、金涂覆二氧化硅納米殼和二氧化硅涂覆金殼。還包括二氧化硅、乳膠、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、PDVF納米顆粒、以及任意這些材料的有色顆粒。

量子點(diǎn)也可用作直接可檢測實(shí)體。量子點(diǎn)是直徑1-5nm的熒光晶體，可被大范圍波長的光所激發(fā)。被具有適當(dāng)波長的光激發(fā)時(shí)，這些晶體發(fā)光，例如單色光，其波長取決于它們的化學(xué)成分和尺寸。量子點(diǎn)，例如CdSe、ZnSe、InP、或InAs，具有獨(dú)特的光學(xué)性能，這些和類似的量子點(diǎn)可從多種商業(yè)渠道獲得(例如，NN-Labs,Fayetteville,AR；Ocean Nanotech,Fayetteville,AR；Nanoco Technologies,Manchester,UK；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。

檢測信號的存在可通過適于被測定所使用的標(biāo)記或可檢測實(shí)體的任意方式來實(shí)現(xiàn)。例如，檢測步驟可包括可視化地檢查捕獲復(fù)合物的顏色變化，或檢查捕獲復(fù)合物的物理化學(xué)變化。物理化學(xué)變化可以隨著氧化反應(yīng)或其他化學(xué)反應(yīng)出現(xiàn)。它們可經(jīng)肉眼，使用分光光度計(jì)等檢測。

當(dāng)信號比陰性對照的信號強(qiáng)時(shí)，通常表明感興趣的抗體存在；然而，并非所有的測試均需要陰性對照。在某些情況下，但也不必然，陽性信號的強(qiáng)度可被量化，當(dāng)強(qiáng)度相對于對照在統(tǒng)計(jì)上顯著時(shí)，表明抗體的存在。在某些情況下，關(guān)于具體測試類型的常規(guī)知識和經(jīng)驗(yàn)確定何時(shí)信號為陽性或陰性，從而表明感興趣抗體的存在或不存在。

作為一個(gè)實(shí)例，來自某些側(cè)向流測定裝置的信號可根據(jù)反應(yīng)性評分來測量，分值為0-5(包括中間的小數(shù)點(diǎn)值)，信號越強(qiáng)，越呈陽性，分值越高。陰性對照的分值通常接近于0，例如約0.25或更低。

檢測信號可進(jìn)行優(yōu)化，例如，通過調(diào)整各反應(yīng)物的比率。一個(gè)實(shí)例包括如下調(diào)整(i)可檢測的Fc結(jié)合分子綴合物和(ii)可檢測抗原/抗原性肽綴合物的比率：(i):(ii)的比率(例如摩爾比率)為約1:200、1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、或200:1，包括中間的所有比率和比率范圍。在某些實(shí)施方式中，可檢測的Fc結(jié)合分子綴合物與可檢測抗原/抗原性肽綴合物的比率為約20:1至約1:20，優(yōu)選約20：1至約1:1，更優(yōu)選約16:1至約2:1。在某些實(shí)施方式中，可檢測綴合物中的Fc結(jié)合分子是蛋白A、蛋白G、蛋白A/G融合蛋白、蛋白L、或其片段和變體，其保留與抗體Fc區(qū)域特異性結(jié)合的能力。

在某些實(shí)施方式中，蛋白A和蛋白G的混合物被用作Fc結(jié)合分子綴合物，其中各蛋白A和蛋白G分子與可檢測實(shí)體綴合。在某些實(shí)施方式中，蛋白A和蛋白G均用作可檢測的Fc結(jié)合分子綴合物，可根據(jù)待測免疫球蛋白的類型改變蛋白A與蛋白G的比率，從而優(yōu)化檢測信號。如上所述，蛋白A和蛋白G對不同免疫球蛋白類型(例如IgG、IgE、IgD、IgM、或IgA)的Fc區(qū)域具有不同的結(jié)合親和力。相應(yīng)地，蛋白A與蛋白G的比率可基于希望檢測的免疫球蛋白類型進(jìn)行調(diào)整。舉例來說，如果希望主要檢測IgM免疫球蛋白，可以使蛋白A與蛋白G的比率較低(即，相對于蛋白A綴合物，蛋白G綴合物的含量較高)。另一方面，如果希望主要檢測IgG免疫球蛋白，可以使蛋白A與蛋白G的比率較高(即，相對于蛋白G綴合物，蛋白A綴合物的含量較高)。蛋白A與蛋白G綴合物的典型比率(例如摩爾比率)包括，但不限于，1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、和20:1。在某些實(shí)施方式中，蛋白A綴合物與蛋白G綴合物的比率為約10:1至約1:10，優(yōu)選約5：1至約1:5，更優(yōu)選約2:1至約1:2。在一個(gè)實(shí)施方式中，蛋白A綴合物與蛋白G綴合物的比率為約1:1。

在某些實(shí)施方式中，可通過調(diào)整蛋白A與蛋白G與可檢測抗原/抗原性肽綴合物的量的比率，進(jìn)一步優(yōu)化檢測信號。例如，在某些實(shí)施方式中，蛋白A綴合物與蛋白G綴合物與可檢測抗原/抗原性肽綴合物的比率(例如摩爾比率)可以為約20:20:1至約1:1:20，約10:10:1至約2:2:1，或約4:2:1至約1:2:1。

用抗原檢測特異性抗體的免疫測定實(shí)驗(yàn)方案是本領(lǐng)域已知的。例如，可使用常規(guī)的夾心測定，或常規(guī)的競爭測定形式。對于某些適當(dāng)類型的測定的討論，參見Current Protocols in Immunology(Coligan et al.,editors,John Wiley&Sons,Inc)。在某些實(shí)施方式中，檢測步驟包含進(jìn)行側(cè)向流免疫測定。在某些實(shí)施方式中，檢測步驟包含進(jìn)行ELISA測定。在其他實(shí)施方式中，檢測步驟包含在分析轉(zhuǎn)子中旋轉(zhuǎn)樣品。在其他實(shí)施方式中，檢測步驟包含用光化學(xué)、光學(xué)、或光電傳感器測定樣品。

特別有用的測定形式是側(cè)向流免疫測定形式。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，包括Fc結(jié)合分子(例如蛋白A和/或G)的報(bào)告物或檢測物分子以及任選地抗體特異性抗原被可檢測實(shí)體(例如膠體金)標(biāo)記，然后干燥并置于玻璃纖維墊上(上樣墊或綴合墊)。未標(biāo)記的抗原或抗原性肽(即捕獲實(shí)體)固定于膜上，例如硝酸纖維素或PVDF(聚偏氟乙烯)膜(例如Immobilon^TM膜)。當(dāng)樣品(血液，血清等)溶液被施加到上樣墊(或流經(jīng)綴合墊)時(shí)，其溶解標(biāo)記的檢測物，其隨后與樣品中的抗體(如果存在)結(jié)合。產(chǎn)生的復(fù)合物隨后經(jīng)毛細(xì)管作用轉(zhuǎn)運(yùn)至下一個(gè)膜(包含捕獲實(shí)體的PVDF或硝酸纖維素)。如果針對捕獲實(shí)體的抗體存在，則其與膜上的檢測物和診斷捕獲實(shí)體復(fù)合，從而產(chǎn)生信號(例如可見或可視化的條帶)。

作為另一個(gè)非限制性實(shí)例，樣品墊不附著檢測分子(即可檢測的Fc結(jié)合分子，可檢測的抗原綴合物)，即，樣品墊不包含預(yù)先固定檢測物分子的綴合區(qū)域。所有其他組分與前述基本相同，未標(biāo)記的抗原或抗原性肽(即捕獲實(shí)體)固定于膜上，例如硝酸纖維素或PVDF(聚偏氟乙烯)膜(例如Immobilon^TM膜)。測試樣品(血液，血清等)與一種或多種檢測物分子預(yù)先混合，然后施加到樣品墊上。可替換地，測試樣品和檢測物分子分別地，同時(shí)或順序施加到樣品墊上。其他組合對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。無論其混合或施加的順序，樣品中的抗體與檢測物分子產(chǎn)生的復(fù)合物隨后通過毛細(xì)管作用轉(zhuǎn)運(yùn)至下一個(gè)膜(包含捕獲實(shí)體的PVDF或硝酸纖維素膜)。如果針對捕獲實(shí)體的抗體存在，則其與膜上的檢測物和診斷捕獲實(shí)體復(fù)合，從而產(chǎn)生信號(例如可見或可視化的條帶)。

在具體實(shí)施方式中，方法包括使測試樣品與蛋白A和/或蛋白G-膠體金綴合物(CGC)接觸，形成第一復(fù)合物，將第一復(fù)合物與固定在硝酸纖維素膜或PVDF膜的測試區(qū)域上的肽抗原接觸，該肽抗原來自微生物來源，與感興趣的抗體特異性結(jié)合(例如抗細(xì)菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗真菌抗體)。肽抗原可以與BSA綴合或合成為MAPS。測試區(qū)域中來自蛋白A-CGC和/或蛋白G-CGC的信號的存在表明測試樣品中抗體的存在。

某些方法進(jìn)一步包括使測試樣品與肽抗原-CGC綴合物接觸，其包含相同的上述肽抗原。在某些實(shí)施方式中，蛋白A/G-CGC或二抗-CGC或其組合以及肽抗原-CGC以不與測試區(qū)域重疊的方式固定在膜(或單獨(dú)但連接的膜)的綴合區(qū)域。在其他實(shí)施方式中，蛋白A/G-CGC或二抗-CGC或其組合以及肽抗原-CGC不固定在膜上，而是與測試樣品一起施加在表面，同時(shí)或順序地施加。來自蛋白A/G-CGC和/或二抗-CGC以及肽抗原-CGC的組合信號表明測試樣品中存在抗體，并且該信號通常比來自單用肽抗原-CGC(即沒有蛋白A-CGC、蛋白G-CGC或二抗-CGC)進(jìn)行的測試的信號要強(qiáng)。在具體實(shí)施方式中，肽抗原是疏螺旋體抗原(天然存在或合成的，例如與天然存在的抗原相同或相似)，測試樣品來自疑似患有萊姆病的對象。陽性信號表明樣品中存在萊姆病特異性抗體。在其他實(shí)施方式中，肽抗原是埃里希體抗原(天然存在或合成的，例如與天然存在的抗原相同或相似)，對象疑似患有埃里希體病，一種由無形小體科，埃里希體屬和無形體屬的細(xì)菌造成的蜱傳播的細(xì)菌感染。

用于篩查血液制品或其他生理學(xué)或生物學(xué)液體的另一種測定是酶聯(lián)免疫吸附法，即ELISA。通常在ELISA中，捕獲實(shí)體(即抗體特異性抗原)直接或通過捕獲基質(zhì)(例如抗體)吸附在微量測試孔表面。然后用適當(dāng)?shù)脑噭?，例如牛血清白蛋?BSA)、熱滅活的正常山羊血清(NGS)或NLOTTO(脫脂奶粉的緩沖溶液，其還包含防腐劑，鹽及消泡劑)封閉表面上剩余的非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)。然后用疑似含有感興趣的抗體的生物樣品孵育測試孔。樣品可以不經(jīng)稀釋而施加，或更多時(shí)候經(jīng)稀釋，通常用含有少量(0.1-5％重量計(jì))蛋白，例如BSA、NGS或BLOTTO的緩沖溶液。經(jīng)足夠長時(shí)間孵育，使得特異性結(jié)合發(fā)生后，洗滌測試孔，去除未結(jié)合的蛋白，然后用一種或多種檢測物分子孵育，包括Fc結(jié)合分子(例如蛋白A和/或蛋白G)以及任選的其他抗體特異性抗原(通常與捕獲實(shí)體相同)，其與酶或其他標(biāo)記通過標(biāo)準(zhǔn)程序綴合并溶解在封閉緩沖液中。標(biāo)記可選自多種酶，包括辣根過氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶等。充足的時(shí)間使得特異性結(jié)合再次發(fā)生，然后再次洗滌測試孔，去除未結(jié)合的綴合物，并添加酶的適宜底物。由此出現(xiàn)顏色，測試孔內(nèi)含物的光學(xué)密度經(jīng)可視化或儀器確定(在適宜的波長測量)。臨界OD值可限定為至少50份血清樣品的平均OD+3標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，樣品采集自來自萊姆病并非其地方病的區(qū)域的個(gè)體，或以其他常規(guī)定義來限定。在非常特定的測定的情況下，可以O(shè)D+2SD作為臨界值。進(jìn)行ELISA測定的條件是本領(lǐng)域熟知的。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，任意數(shù)量的常規(guī)蛋白測定形式，特別是免疫測定形式，可設(shè)計(jì)用于本文所述的不同實(shí)施方式。本發(fā)明并不因此受到具體測定形式選取的限制，并可包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的測定形式。

諸如“包含抗體的樣品”或“檢測樣品中的抗體”的措辭無意排除不包含抗體或未檢測到抗體的樣品或測定(例如檢測嘗試)?？傮w來說，本發(fā)明涉及確定樣品中是否存在響應(yīng)傳染性微生物感染所產(chǎn)生的抗體的測定，無論其是否被檢測。

使抗原/肽和抗體反應(yīng)以便其特異性反應(yīng)的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。參見，例如Current Protocols in Immunology(Coligan et al.,editors,John Wiley&Sons,Inc)。

裝置和組合物

另一方面，本發(fā)明包括用于檢測樣品中的抗體的裝置。某些實(shí)施方式包括抗體檢測裝置或抗體檢測系統(tǒng)，其包含上樣區(qū)域、綴合區(qū)域和測試區(qū)域。綴合區(qū)域通常不與測試區(qū)域重疊，然而，上樣區(qū)域和這兩個(gè)區(qū)域經(jīng)過設(shè)置，使得操作中，當(dāng)施加到上樣區(qū)域時(shí)，樣品與綴合區(qū)域和測試區(qū)域液體流通。通常，測試樣品通過毛細(xì)管作用流經(jīng)或與綴合區(qū)域和測試區(qū)域連通。綴合區(qū)域包含與第一可檢測實(shí)體(即可檢測的Fc結(jié)合分子綴合物，例如蛋白A和/或蛋白G綴合物，或Fc特異性二抗綴合物)綴合的可移動的Fc結(jié)合分子，測試區(qū)域包含能與抗體特異性結(jié)合的固定的捕獲實(shí)體。這些特征在本文別處有述。

在某些實(shí)施方式中，裝置進(jìn)一步包含對照區(qū)域，當(dāng)液體樣品施加至上樣區(qū)域時(shí)，其與液體樣品流體連通。同樣的，液體樣品通過毛細(xì)管作用流經(jīng)或與對照區(qū)域連通。在某些實(shí)施方式中，對照區(qū)域包含能夠與對照檢測物特異性結(jié)合的固定的結(jié)合配偶體。作為一個(gè)實(shí)例，對照區(qū)域包含抗蛋白A抗體、抗蛋白G抗體、或能與蛋白A或蛋白G反應(yīng)的任意哺乳動物IgG。

某些裝置進(jìn)一步包含位于測試區(qū)域下游的吸收墊。在某些裝置中，綴合區(qū)域位于上樣區(qū)域的上游。在某些實(shí)施方式中，綴合區(qū)域位于上樣區(qū)域的下游。在某些實(shí)施方式中，上樣區(qū)域包含血液分離材料(blood separator material)。

在某些情況下，綴合區(qū)域進(jìn)一步包含可移動的第二檢測物，其中第二檢測物包含與第二可檢測實(shí)體綴合的抗原或抗原性肽，所述抗原或抗原性肽能夠與抗體特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，第一(例如可檢測的Fc結(jié)合分子)和第二(例如可檢測的抗原綴合物)檢測物具有相同類型的可檢測實(shí)體。在其他實(shí)施方式中，第一和第二檢測物具有不同類型的可檢測實(shí)體。在具體實(shí)施方式中，調(diào)整第一檢測物與第二檢測物的比率(例如摩爾比率)，從而獲得期望的信號放大水平。例如，第一檢測物(例如可檢測的Fc結(jié)合分子，如蛋白A/蛋白G)與第二檢測物(例如可檢測的抗原綴合物)的比率可以是約1:200、1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、或200:1，包括中間的所有比率和比率范圍。在某些實(shí)施方式中，可檢測的Fc結(jié)合分子綴合物與可檢測抗原/抗原性肽綴合物的比率為約20:1至約1:20，優(yōu)選約20：1至約1:1，更優(yōu)選約16:1至約2:1。在蛋白A和蛋白G綴合物均被用作可檢測的Fc結(jié)合分子的實(shí)施方式中，可如上所述，根據(jù)待測免疫球蛋白的類型調(diào)整蛋白A綴合物與蛋白G綴合物的比率，從而優(yōu)化檢測信號。蛋白A綴合物與蛋白G綴合物的適當(dāng)比率(例如摩爾比率)包括，但不限于，1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、和20:1。在某些實(shí)施方式中，蛋白A綴合物與蛋白G綴合物的比率為約10:1至約1:10，優(yōu)選約5：1至約1:5，更優(yōu)選約2:1至約1:2。在一個(gè)實(shí)施方式中，蛋白A綴合物與蛋白G綴合物的比率為約1:1。

進(jìn)行特定結(jié)合測定尤其是免疫測定的裝置是已知的，并且可以很容易地經(jīng)過調(diào)整而用于本方法。通常，固相測定比需要分離步驟，例如沉淀，離心、過濾、層析或磁力的異質(zhì)測定方法容易操作，因?yàn)樵噭┓蛛x更快，更簡便。固相測定裝置包括微孔板、流通測定裝置(例如側(cè)向流免疫測定裝置)、浸測片(dipstick)、以及免疫毛細(xì)管或免疫層析免疫測定裝置。

在某些實(shí)施方式中，裝置是側(cè)向流免疫測定裝置。在某些實(shí)施方式中，裝置是適于ELISA測定的微孔板。在其他實(shí)施方式中，裝置適用于分析轉(zhuǎn)子。在其他實(shí)施方式中，裝置包含電化學(xué)、光學(xué)或光電傳感器。

在某些實(shí)施方式中，側(cè)向流裝置由樣品/血液分離墊、硝酸纖維素膜、以及上部的置于殼體內(nèi)的芯(wick)構(gòu)成。硝酸纖維素膜具有測試線或區(qū)域和任選的對照線或區(qū)域，所述測試線或區(qū)域包含捕獲實(shí)體，例如未標(biāo)記的抗體特異性抗原(例如肽抗原或非肽抗原)，所述對照線或區(qū)域含有能與Fc結(jié)合分子反應(yīng)的抗體(如下所述)。疑似含有感興趣的抗體的樣品可與可檢測的Fc結(jié)合分子綴合物預(yù)先混合，然后施加到側(cè)向流測定裝置?；蛘卟活A(yù)先混合，樣品和Fc結(jié)合分子可以任意順序，同時(shí)或順序施加到測定裝置。

可替換地，硝酸纖維素膜如上制備，并進(jìn)一步具有包含可檢測的Fc結(jié)合分子綴合物的綴合線或區(qū)域，其中綴合區(qū)域和測試區(qū)域不重疊。在某些實(shí)施方式中，疑似含有感興趣的抗體的樣品施加到側(cè)向流測定裝置。在其他實(shí)施方式中，疑似含有感興趣的抗體的樣品可與特異性結(jié)合抗體(通常與捕獲實(shí)體具有相同的結(jié)合特異性)的可檢測的抗原綴合物預(yù)先混合，然后施加到側(cè)向流測定裝置。與之前類似，不預(yù)先混合，樣品和可檢測的抗原綴合物可以任意順序，同時(shí)或順序施加到測定裝置。

在某些實(shí)施方式中，側(cè)向流裝置由樣品/血液分離墊、硝酸纖維素膜、以及上部的置于殼體內(nèi)的芯構(gòu)成(參見例如圖2)。硝酸纖維素膜具有測試線或區(qū)域、任選的對照線或區(qū)域、以及綴合線或區(qū)域，所述測試線或區(qū)域包含捕獲實(shí)體，例如未標(biāo)記的抗體特異性抗原(例如肽抗原或非肽抗原)，所述對照線或區(qū)域含有能與Fc結(jié)合分子反應(yīng)的抗體(如下所述)，所述綴合線或區(qū)域包含與抗體(通常與捕獲實(shí)體具有相同的結(jié)合特異性)特異性結(jié)合的可檢測的抗原綴合物。綴合區(qū)域和測試區(qū)域通常不重疊。疑似含有感興趣的抗體的樣品可與可檢測的Fc結(jié)合分子綴合物預(yù)先混合，然后施加到側(cè)向流測定裝置。也可以不預(yù)先混合，樣品和Fc結(jié)合分子可以任意順序，同時(shí)或順序施加到測定裝置。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，兩開口裝置也可用于順序施加測試樣品、綴合物和Chase緩沖液。

在某些側(cè)向流裝置中，硝酸纖維素膜具有測試線或區(qū)域、任選的對照線或區(qū)域、和綴合線或區(qū)域，所述測試線或區(qū)域包含捕獲實(shí)體，例如未標(biāo)記的抗體特異性抗原(例如肽抗原或非肽抗原)，所述對照線或區(qū)域含有能與Fc結(jié)合分子反應(yīng)的抗體(如下所述)，所述綴合線或區(qū)域包含可檢測的Fc結(jié)合分子和與抗體(通常與捕獲實(shí)體具有相同的結(jié)合特異性)特異性結(jié)合的可檢測的抗原綴合物。然后，疑似含有感興趣的抗體的樣品可被施加到側(cè)向流測定裝置。

在一個(gè)用于萊姆病特異性抗體檢測的示例性裝置中，側(cè)向流裝置由樣品/血液分離墊、硝酸纖維素膜、以及上部的置于殼體內(nèi)的芯構(gòu)成(參見例如圖2)。硝酸纖維素膜具有測試線或區(qū)域以及對照線或區(qū)域，所述測試線或區(qū)域包含模擬或模仿疏螺旋體抗原(參見例如美國申請12/948,209)混合物，所述對照線或區(qū)域包含任意蛋白A-或蛋白G-反應(yīng)免疫球蛋白(例如，抗蛋白A IgG，鼠、人或其他蛋白A-反應(yīng)IgG等)。疑似含有伯氏疏螺旋體抗體的樣品可與膠體金綴合的蛋白A和/或G(蛋白A/G-CGC)，或(ii)蛋白A/G-CGC和疏螺旋體抗原膠體金綴合物(疏螺旋體抗原-CGC)的混合物混合。然后，該樣品綴合物混合物可被施加到側(cè)向流測定裝置。

可替換地，側(cè)向流裝置如上構(gòu)成，但硝酸纖維素墊具有與測試區(qū)域分離的一個(gè)或多個(gè)綴合區(qū)域。所述綴合區(qū)域可包括，例如，(i)僅蛋白A/G-CGC，(ii)僅疏螺旋體抗原-CGC，或(iii)蛋白A/G-CGC和疏螺旋體抗原-CGC組合。此處或本申請其他地方所用的疏螺旋體抗原、埃里希體抗原或任意抗原或抗原性肽包括分別模擬或模仿天然疏螺旋體抗原、天然埃里希體抗原或任意天然抗原的合成肽混合物。在某些實(shí)施方式，例如(i)或(iii)中，測試樣品單獨(dú)施加到側(cè)向流裝置上，不進(jìn)行預(yù)先混合。在其他實(shí)施方式，例如(i)中，樣品可與疏螺旋體抗原-CGC預(yù)先混合，然后施加到側(cè)向流裝置上。在某些實(shí)施方式，例如(ii)中，樣品可與蛋白A/G-CGC預(yù)先混合，然后施加到側(cè)向流裝置上。然而，這些示例性的組合并非限制性的，其他可能對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。

在通過樣品/血液分離墊并遷移至任選的綴合線和測試線的過程中，形成捕獲復(fù)合物，其包含蛋白A/G-CGC、樣品中的抗體、以及任選的疏螺旋體抗原-CGC。根據(jù)情況(例如任選地使用疏螺旋體抗原-CGC)，固定的和未標(biāo)記的疏螺旋體抗原、抗體以及標(biāo)記的蛋白A/G-CGC形成復(fù)合物或夾心。疏螺旋體抗原-CGC存在時(shí)，未標(biāo)記疏螺旋體抗原、抗體、標(biāo)記的疏螺旋體抗原-CGC以及標(biāo)記的蛋白A/G-CGC形成復(fù)合物或夾心。向后一復(fù)合物中添加蛋白A/G-CGC進(jìn)一步放大了來自標(biāo)記疏螺旋體抗原-CGC的信號。在某些實(shí)施方式中，可如本文所述且本領(lǐng)域已知，通過調(diào)整所有反應(yīng)物的比率實(shí)現(xiàn)放大的增加。

在一個(gè)用于埃里希體特異性抗體檢測的示例性裝置中，側(cè)向流裝置由樣品/血液分離墊、硝酸纖維素膜、以及上部的置于殼體內(nèi)的芯構(gòu)成。硝酸纖維素膜具有包含埃里希體抗原的測試線或區(qū)域，以及包含任意蛋白A-或蛋白G-反應(yīng)性免疫球蛋白(例如抗蛋白A IgG)的對照線或區(qū)域。疑似含有埃里希體(例如犬埃里希體、沙費(fèi)埃里希體，伊氏埃里希體)抗體的樣品可與膠體金綴合的蛋白A和/或G(蛋白A/G-CGC)，或(ii)蛋白A/G-CGC和埃里希體抗原膠體金綴合物(埃立克體抗原-CGC)的混合物混合。然后，該樣品綴合物混合物可被施加到側(cè)向流測定裝置。

可替換地，側(cè)向流裝置如上構(gòu)成，但硝酸纖維素墊具有與測試區(qū)域分離的一個(gè)或多個(gè)綴合區(qū)域。綴合區(qū)域可包括，例如，(i)僅蛋白A/G-CGC，(ii)僅埃里希體抗原-CGC，或(iii)蛋白A/G-CGC和埃里希體抗原-CGC組合。在某些實(shí)施方式，例如(i)或(iii)中，測試樣品單獨(dú)施加到側(cè)向流裝置上，不進(jìn)行預(yù)先混合。在其他實(shí)施方式，例如(i)中，樣品可與埃里希體抗原-CGC預(yù)先混合，然后施加到側(cè)向流裝置上。在某些實(shí)施方式，例如(ii)中，樣品可與蛋白A/G-CGC預(yù)先混合，然后施加到側(cè)向流裝置上。然而，這些示例性的組合并非限制性的，其他可能對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。

在通過樣品/血液分離墊并遷移至任選的綴合線和測試線的過程中，形成捕獲復(fù)合物，其包含蛋白A/G-CGC、樣品中的抗體、以及可選的埃里希體抗原-CGC。根據(jù)情況(例如可選的使用埃里希體抗原-CGC)、固定的和未標(biāo)記的埃里希體抗原、抗體以及標(biāo)記的蛋白A/G-CGC形成復(fù)合物或夾心。埃里希體抗原-CGC存在時(shí)，未標(biāo)記的埃里希體抗原、抗體、標(biāo)記的埃里希體抗原-CGC以及標(biāo)記蛋白A/G-CGC形成復(fù)合物或夾心。向后一復(fù)合物中添加蛋白A/G-CGC進(jìn)一步放大了來自標(biāo)記的埃里希體抗原-CGC的信號。在某些實(shí)施方式中，可如本文所述且本領(lǐng)域已知，通過調(diào)整所有反應(yīng)物的比率實(shí)現(xiàn)放大的增加。

在一個(gè)適于ELISA的微孔板的實(shí)施方式中，捕獲實(shí)體固定在表面，例如96孔ELISA板或等同固相上，其在堿性涂覆緩沖液中，以最適濃度4℃孵育過夜，涂覆鏈霉親和素或等同生物素結(jié)合化合物，例如親和素或中性親和素。經(jīng)過適當(dāng)次數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)洗滌緩沖液洗滌后，最適濃度的生物素化形式的Fc結(jié)合分子以及任選的用作捕獲實(shí)體的相同抗原溶于常規(guī)封閉緩沖液，被施加到每個(gè)測試孔。然后添加樣品，測定過程如本文所述且本領(lǐng)域已知。

另一方面，本發(fā)明提供與樣品中的抗體檢測相關(guān)的組合物。某些實(shí)施方式涉及一種或多種捕獲復(fù)合物，其包含捕獲實(shí)體、測試樣品中的抗體、以及第一檢測物，其中捕獲實(shí)體與抗體結(jié)合，并且其中第一檢測物包含與第一可檢測實(shí)體綴合的Fc結(jié)合分子，并與抗體的Fc區(qū)域結(jié)合。某些實(shí)施方式進(jìn)一步包含第二檢測物，其中第二檢測物與抗體的可變區(qū)域特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，捕獲復(fù)合物固定在表面，例如固體或半固體支持物的測試區(qū)域。例如，在某些實(shí)施方式中，固體支持物是珠(例如膠體顆?；蚣{米顆粒)、側(cè)向流免疫測定裝置中的流動通道、分析轉(zhuǎn)子中的流動通道、或試管或測試孔(例如平板中的)。這些和相關(guān)實(shí)施方式的示例參見圖1，包括任選的第二檢測物綴合物和任選的測試表面。

在具體實(shí)施方式中，復(fù)合物包含感興趣的抗體(例如抗微生物抗體，如抗病毒、抗細(xì)菌、抗真菌、或抗寄生蟲抗體)、蛋白A-和/或蛋白G-綴合物、固定的抗體特異性抗原、以及任選的抗原綴合物。在某些實(shí)施方式中，蛋白A-和/或蛋白G-綴合物包含金納米顆粒(例如，蛋白A-CGC或蛋白G-CGC“膠體金綴合物”)，抗原綴合物包含金納米顆粒(例如抗原-CGC)。在某些實(shí)施方式中，抗原綴合物或抗原-CGC包含微生物抗原，例如病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲抗原，如本文所述且本領(lǐng)域已知。在具體實(shí)施方式中，抗原綴合物或抗原-CGC包括萊姆病特異性抗原，例如疏螺旋體抗原(如上所述)。在其他實(shí)施方式中，抗原綴合物或抗原-CGC包括埃里希體病特異性抗原，例如埃里希體抗原。

試劑盒

另一方面，發(fā)明提供試劑盒。在某些實(shí)施方式中，試劑盒包含本文所述的發(fā)明的裝置或系統(tǒng)。在某些實(shí)施方式中，試劑盒包含發(fā)明的2、3、4、或更多個(gè)裝置或系統(tǒng)。

用于特定類型測定的試劑也可在發(fā)明的試劑盒中提供。因此，試劑盒可包括多種納米顆粒、珠(例如適于凝集反應(yīng)或側(cè)向流測定)、或平板(例如適于ELISA測定的平板)。在其他實(shí)施方式中，試劑盒包含裝置，例如側(cè)向流免疫測定裝置，分析轉(zhuǎn)子，或電化學(xué)、光化學(xué)、或光電傳感器。多種納米顆粒、珠、平板和裝置可用于進(jìn)行免疫測定。例如，它們可用于檢測抗體-肽復(fù)合物的形成，所述復(fù)合物包含來自樣品的抗體、抗原性肽(標(biāo)記和/或未標(biāo)記)、以及Fc結(jié)合分子。

在某些實(shí)施方式中，抗原(或不同抗原的混合物)與可檢測實(shí)體例如金納米顆粒綴合，該相同抗原(或抗原混合物)也附著或固定于平板、硝酸纖維素測試表面、或其他測試表面或裝置上，并且Fc結(jié)合分子與可檢測實(shí)體例如金納米顆粒綴合。在具體試劑盒中，抗原性肽與金納米顆粒綴合，并任選地與BSA綴合，該相同抗原(不含金顆粒，但任選地與BSA綴合)固定在硝酸纖維素表面上限定的測試區(qū)域或條帶上，蛋白A和/或蛋白G與金納米顆粒綴合，任選地作為包含側(cè)向流測定裝置的試劑盒的一部分。在某些實(shí)施方式中，蛋白A-和/或蛋白G-金顆粒綴合物固定在硝酸纖維素表面上的單獨(dú)區(qū)域，即綴合區(qū)域，其不與測試區(qū)域重疊。

另外，試劑盒可包括各種稀釋劑和緩沖液、標(biāo)記的綴合物或其他用于檢測特異性結(jié)合抗原或抗體的試劑，以及其他信號產(chǎn)生試劑，例如酶底物、輔因子和發(fā)色團(tuán)。試劑盒的其他組分可由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地確定。這些組分可以包括涂覆試劑，對Fc結(jié)合分子例如蛋白A和/或蛋白G特異性的多克隆或單克隆捕獲抗體，或者兩種或更多種所述抗體的混合物，按照標(biāo)準(zhǔn)純化或半純化的抗原或抗體的提取物，單克隆抗體檢測物抗體，綴合有指示分子的抗鼠、抗狗、抗雞或抗人抗體，用于比色比較的指示圖，一次性手套，去污說明書，上樣棒或容器，樣品制備杯等。在一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒包含緩沖液或其他試劑，其適于構(gòu)成可形成肽-抗體復(fù)合物的反應(yīng)介質(zhì)。

該試劑盒為臨床實(shí)驗(yàn)室提供便捷、有效的方式，以診斷如本文別處所述且本領(lǐng)域已知的微生物菌劑，尤其是病原微生物菌劑引起的感染。例如，某些自身免疫性疾病與某些類型的抗體有關(guān)。因此，在已知的疾病相關(guān)抗體/抗原組合的范圍內(nèi)，本發(fā)明可提供對該疾病靈敏而準(zhǔn)確的診斷。具體的試劑盒提供對疏螺旋體，例如伯氏疏螺旋體進(jìn)行檢測，從而輔助萊姆病診斷。

在某些實(shí)施方式中，試劑盒進(jìn)一步包含說明書。例如，在某些實(shí)施方式中，試劑盒包含說明書，其指導(dǎo)如何使用該試劑盒檢測抗體，例如微生物抗原的抗體(例如疏螺旋體抗原，埃里希體抗原)，或診斷疾病，例如微生物相關(guān)疾病(例如萊姆病，埃里希體病)。在某些實(shí)施方式中，試劑盒包含說明書，其指導(dǎo)如何使用多種珠、平板或裝置(例如側(cè)向流裝置)檢測針對微生物抗原，例如疏螺旋體抗原或埃里希體抗原的抗體，或診斷微生物相關(guān)疾病，例如萊姆病(萊姆疏螺旋體病)或埃里希體病。在某些實(shí)施方式中，試劑盒提供說明書，用于將可檢測的Fc結(jié)合分子、抗體特異性的可檢測抗原綴合物或抗原性肽綴合物、以及測試樣品在施加到檢測系統(tǒng)(例如側(cè)向流測定裝置，微孔板，分析轉(zhuǎn)子)的上樣區(qū)域之前，以任意順序組合。在某些實(shí)施方式中，試劑盒包括說明書，用于將可檢測抗原綴合物或抗原性肽綴合物與測試樣品組合，這樣可檢測抗原綴合物或抗原性肽綴合物將以與可檢測的Fc結(jié)合分子特定的比率存在，以實(shí)現(xiàn)期望的信號放大水平。試劑盒還可提供說明書，用于優(yōu)化緩沖液，優(yōu)化不同組分(例如Fc結(jié)合分子，抗原或抗原性肽，測試樣品)的比率，優(yōu)化混合及加樣步驟的順序(例如，加樣前混合所有組分，僅混合某些組分，其他單獨(dú)加樣)。

本發(fā)明的肽、包含肽的組合物和裝置、試劑盒和方法具有多種優(yōu)點(diǎn)。例如，它們使得對感興趣抗體的檢測以及相關(guān)疾病的診斷簡便、廉價(jià)、快速、靈敏和準(zhǔn)確，無顯著的假陽性或背景信號。由此可對抗體含量非常低，甚至其他方式無法檢測的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確而靈敏的診斷。

實(shí)施例

實(shí)施例1：蛋白A增強(qiáng)萊姆病特異性側(cè)向流測定中對抗體的特異性檢測

檢測陰性樣品、萊姆病陽性樣品、以及低含量的萊姆病陽性樣品時(shí)，通過測試以確定添加蛋白A-CGC(膠體金綴合物)對萊姆病特異性側(cè)向流測定的影響。目的在于保持足夠的測定靈敏度的同時(shí)，就蛋白A-CGC對潛在假信號的影響進(jìn)行觀察和分級。相對于蛋白A-CGC陰性對照的不同蛋白A-CGC濃度進(jìn)行測試。該測試中進(jìn)行的側(cè)向流測定與圖2和3中所示的相似。結(jié)果見下表1，以反應(yīng)評分示出(數(shù)值范圍0-5，較高的數(shù)值代表陽性結(jié)果)。

表1：測試結(jié)果總結(jié)(反應(yīng)評分)

如表1所示，添加蛋白A-CGC使所有測試的萊姆病陽性樣品的信號得到放大，尤其能夠檢測“低”陽性的樣品。沒有蛋白A-CGC時(shí)，低陽性的樣品無法檢測，顯示與陰性樣品類似的反應(yīng)評分(約0.25或更低)。相反，以1X濃度和1:2稀釋添加蛋白A-CGC使信號顯著放大，反應(yīng)評分約3.5。因此，蛋白A-CGC顯著改善萊姆病特異性側(cè)向流測定中對靶抗體的檢測。

實(shí)施例2：蛋白A增強(qiáng)應(yīng)激生物樣品側(cè)向流測定中對抗體的特異性檢測

通過測試以確定添加蛋白A-CGC(膠體金綴合物)對預(yù)先應(yīng)激的48BSA(牛血清白蛋白)/DAG IgG綴合物混合物的影響。綴合物混合物在35℃的保溫箱中預(yù)先應(yīng)激15天。該實(shí)驗(yàn)測試蛋白A-CGC存在或不存在時(shí)的應(yīng)激和非應(yīng)激樣品。該測試中進(jìn)行的側(cè)向流測定與圖2和3中所示的相似。結(jié)果見下表1，以反應(yīng)評分示出(數(shù)值范圍0-5，較高的數(shù)值代表陽性結(jié)果)。結(jié)果如下表2所示。

表2：應(yīng)激樣品對比非應(yīng)激樣品的測試結(jié)果總結(jié)

如上表2所示，相對于不存在蛋白A-CGC，向側(cè)向流測定混合物中添加蛋白A-CGC，使第15天的應(yīng)激(35℃)生物樣品的信號得到放大，可見反應(yīng)評分由0.75增至1.75。第15天的非應(yīng)激樣品(2-8℃)也輕微地受到添加蛋白A-CGC的影響，可見反應(yīng)評分由2.25增至2.75。同時(shí)，陰性樣品不受蛋白A-CGC添加的影響。

如果作為參考文獻(xiàn)引述的文獻(xiàn)中的任何定義與本文的定義不一致，以本本文的定義為準(zhǔn)。盡管根據(jù)當(dāng)前優(yōu)先實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行了描述，應(yīng)當(dāng)理解的是，在不背離發(fā)明主旨的情況下，可進(jìn)行對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的不同變化和修改。相應(yīng)地，發(fā)明僅由下述權(quán)利要求書限定。