本發(fā)明涉及可用于羅氏全自動免疫分析儀的化學(xué)發(fā)光緩沖液及清洗液，屬于醫(yī)療器械體外診斷試劑領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

電致化學(xué)發(fā)光(ECL)，也稱電化學(xué)發(fā)光，是化學(xué)發(fā)光與電化學(xué)相結(jié)合的一種新穎的研究方法。是通過對電極施加一定的電壓進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)物之間或產(chǎn)物與體系中的某種組分之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使電子躍遷到激發(fā)態(tài)產(chǎn)生激發(fā)態(tài)物質(zhì)，激發(fā)態(tài)物質(zhì)回到基態(tài)產(chǎn)生發(fā)光；或者是發(fā)光物質(zhì)利用電極提供能量直接進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，生成不穩(wěn)定的中間態(tài)物質(zhì)，中間態(tài)物質(zhì)能夠迅速分解產(chǎn)生光輻射。

瑞士Roche公司Cobas e411/e601電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，是應(yīng)用先進(jìn)的電化學(xué)發(fā)光(ECL)技術(shù)的全自動臺式分析儀。已應(yīng)用于甲狀腺，激素，心肌損傷和腫瘤標(biāo)志、傳染病、貧血、骨代謝等廣泛的測定項(xiàng)目。其電化學(xué)發(fā)光體系即為三聯(lián)吡啶釕([Ru(bpy)3²⁺])-三丙胺(TPrA)體系，其配套使用的Procell和Cleancell用量較大，配套原裝試劑特別是Procell價(jià)格昂貴且毒性較大。

化學(xué)發(fā)光緩沖液Procell為三丙胺清洗液，用于維護(hù)電極、運(yùn)送反應(yīng)混合物、清洗鏈霉親和素包被的微粒、產(chǎn)生反應(yīng)信號；化學(xué)發(fā)光清洗液Cleancell，用于每次測量后管道系統(tǒng)和測量池的清洗以及電極維護(hù)。羅氏診斷進(jìn)口注冊證信息顯示Procell配方為：磷酸鹽緩沖液300mmol/L、三丙胺180mmol/L、去垢劑≦0.1％；防腐劑，pH6.8；Cleancell配方為：KOH 176mmol/L(相當(dāng)于pH值13.2)；清潔劑≤1％。三聯(lián)吡啶釕([Ru(bpy)3²⁺])-三丙胺(TPrA)體系是一種常見的ECL體系，其中三聯(lián)吡啶釕是電化學(xué)發(fā)光劑，它和電子供體TPrA在電極陽極表面同時(shí)失去電子發(fā)生氧化反應(yīng)，2價(jià)的[Ru(bpy)3²⁺]標(biāo)記物被氧化成3價(jià)的[Ru(bpy)3³⁺]的標(biāo)記物，TPrA被氧化成陽離子自由基TPrA^+*，TPrA^+*很不穩(wěn)定，自發(fā)地失去一個(gè)質(zhì)子而形成自由基TPrA*，其為強(qiáng)還原劑，將一個(gè)電子給3價(jià)的[Ru(bpy)3³⁺]，使其成為激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)3²⁺，而TPrA自身被氧化成氧化產(chǎn)物。激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)3²⁺衰減時(shí)發(fā)射一個(gè)波長620nm的光子，重新形成基態(tài)的Ru(bpy)3²⁺。這一過程在電極表面周而復(fù)始的進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，使得光信號增強(qiáng)。

由于TprA自身氧化的不可逆性以及兩者之間的相互作用產(chǎn)生的光較弱，該體系通常使用大大過量的TPrA(通常是TPrA：Ru(bpy)3²⁺＝100000μmol/L：1μmol/L)，即100mmol/L，而原裝試劑加入180mmol/L TPrA，超出了常用量，而TPrA毒性標(biāo)識為高毒性，大鼠經(jīng)口LD₅₀＝72mg/kg，其蒸氣或霧對眼、粘膜、上呼吸道和皮膚有強(qiáng)烈的刺激性，對于檢驗(yàn)師的健康影響較大。此外，全自動生化儀在多次使用后，由于清洗效果不佳，從測量池到管道，容易受到反應(yīng)液的污染，長期蛋白質(zhì)沉淀，導(dǎo)致空白吸光度增高，并出現(xiàn)報(bào)警。

可見，進(jìn)一步的研究可用于羅氏全自動免疫分析儀的化學(xué)發(fā)光緩沖液及清洗液，尤其是降低三丙胺的濃度，并保證檢測結(jié)果的一致性，穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性的緩沖液，以及具有更加優(yōu)異的清洗效果的清洗液，仍然是亟待解決的技術(shù)問題，這也正是本發(fā)明得以完成的基礎(chǔ)所在和動力所倚。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

如上所述，為了進(jìn)一步的研究可用于羅氏全自動免疫分析儀的化學(xué)發(fā)光緩沖液及清洗液，尤其是降低三丙胺的濃度，并保證檢測結(jié)果的一致性，穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性的緩沖液，以及具有更加優(yōu)異的清洗效果的清洗液，本發(fā)明人對此進(jìn)行了深入的研究，在付出大量創(chuàng)造性勞動后，從而完成了本發(fā)明。

本發(fā)明就TPrA與Ru(bpy)3²⁺的相互作用產(chǎn)生的光較弱著手，對Procell配方進(jìn)行改進(jìn)，大大降低TPrA用量，同時(shí)在組方中加入N，N-二[正]丁基氨基乙醇、氯化鈉、PEG 300、丙二酰脲、對甲酚等物質(zhì)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光，減少因三丙胺濃度降低導(dǎo)致的化學(xué)發(fā)光削弱，同時(shí)，保證與原裝試劑的一致性和穩(wěn)定性。

本發(fā)明在Cleancell中加入尿素、硫脲Trixton X-100、MES等成分，增加其對凝結(jié)塊和纖維蛋白等成分的清洗效果，并加入Proclin 300防腐劑，進(jìn)一步維護(hù)電極。

研制改進(jìn)配方的Procell和Cleancell替代原裝的Procell和Cleancell，以降低毒性，提高清洗效果，進(jìn)一步保護(hù)電極，減少成本，具有較大的利潤空間。

具體而言，本發(fā)明涉及如下四個(gè)方面，更具體而言，第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種配套使用的電化學(xué)發(fā)光緩沖液和清洗液，緩沖液組分包括：磷酸二氫鈉，三丙胺，氯化鈉，草酸，Tween 20，Proclin 300；清洗液組分包括：氫氧化鉀，Trixton X-100，MES，Proclin 300。

優(yōu)選的，其中的緩沖液其組分和含量為：磷酸二氫鉀250～350mmol/L，三丙胺60～90mmol/L，氯化鈉1～10mmol/L，草酸3～10mmol/L，Tween 20 0.05～0.2％(w％)，Proclin 300 0.05～0.2％(w％)，pH值6.6～7.0；其中的清洗液組分和含量為：氫氧化鉀150-200mmol/L，Trixton X-100 0.1～1％(w％)，MES 0.1～1％(w％)，Proclin 300 0.1～0.5％(w％)。

第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種配套使用的電化學(xué)發(fā)光緩沖液和清洗液，緩沖液組分包括：磷酸二氫鈉，三丙胺，氯化鈉，PEG 300，Tween 20，Proclin 300，對甲酚；清洗液組分包括：氫氧化鉀，Trixton X-100，MES，尿素，Proclin 300。

優(yōu)選的，其中的緩沖液其組分和含量為：磷酸二氫鉀250～350mmol/L，三丙胺20～30mmol/L，氯化鈉1～10mmol/L，PEG300 1～10mmol/L，Tween 20 0.05～0.2％(w％)，Proclin 3000.05～0.2％(w％)，對甲酚0.1～1mmol/L，pH值6.6～7.0；其中的清洗液組分和含量為：氫氧化鉀150-200mmol/L，Trixton X-100 0.1～1％(w％)，MES/AES 0.1～1％(w％)，尿素0.1～1％(w％)，Proclin300 0.1～0.5％(w％)。

第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種配套使用的電化學(xué)發(fā)光緩沖液和清洗液，緩沖液組分包括：磷酸二氫鈉，三丙胺，N，N-二[正]丁基氨基乙醇，氯化鈉，PEG 300，丙二酰脲，Tween 20，Proclin 300，對甲酚，聚乙烯吡咯烷酮，甲基纖維素；清洗液組分包括：氫氧化鉀，Trixton X-100，MES，硫脲，Proclin 300。

優(yōu)選的，其中的緩沖液其組分和含量為：磷酸二氫鉀250～350mmol/L，三丙胺1～10mmol/L，N，N-二[正]丁基氨基乙醇1～3mmol/L，氯化鈉1～10mmol/L，PEG 300 1～10mmol/L，丙二酰脲1～5mmol/L，Tween 20 0.05～0.2％(w％)，Proclin 300 0.05～0.2％(w％)，對甲酚0.1～1mmol/L，聚乙烯吡咯烷酮0.1～1mmol/L，甲基纖維素0.1～1mmol/L，pH值6.6～7.0；其中的清洗液組分和含量為：氫氧化鉀150-200mmol/L，Trixton X-100 0.1～1％(w％)，MES0.1～1％(w％)，硫脲0.1～1％(w％)，Proclin 300 0.1～0.5％(w％)。

第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及上述緩沖液及清洗液的配制方法，如下：

一、化學(xué)發(fā)光緩沖液的配制：將除三丙胺之外的成分分別稱量加入少量的水中攪拌使溶解，加入三丙胺攪拌靜置待全溶后轉(zhuǎn)移至容量瓶中，定容，搖勻，調(diào)節(jié)pH值，即得。

二、清洗液的配制：按照配方中的成分稱取適當(dāng)?shù)牧?，加水溶解混勻，放冷，轉(zhuǎn)移至容量瓶，定容，搖勻，即得。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但這些例舉性實(shí)施方式的用途和目的僅用來例舉本發(fā)明，并非對本發(fā)明的實(shí)際保護(hù)范圍構(gòu)成任何形式的任何限定，更非將本發(fā)明的保護(hù)范圍局限于此。

實(shí)施例1

A、化學(xué)發(fā)光緩沖液(Procell)的組分與制備：

磷酸二氫鉀 270mmol/L

三丙胺 60mmol/L

氯化鈉 2mmol/L

草酸 5mmol/L

Tween 20 0.05％(w％)

Proclin 300 0.05％(w％)

pH值用NaOH調(diào)至6.6

將除三丙胺之外的其他成分分別稱量加入少量的水中攪拌使溶解，加入三丙胺攪拌靜置待全溶后移至容量瓶中，定容，搖勻即得。

B、清洗液(Cleancell)的組分與制備：

氫氧化鉀150mmol/L

Trixton X-100 0.5％

MES 0.5％

Proclin 300 0.3％

按照配方中的成分稱取適當(dāng)?shù)牧浚铀芙饣靹?，放冷，轉(zhuǎn)移至容量瓶，定容，搖勻即得。

實(shí)施例2

A、緩沖液(Procell)的組分與制備：

磷酸二氫鉀 350mmol/L

三丙胺 25mmol/L

氯化鈉 5mmol/L

PEG 300 5mmol/L

Tween 20 0.1％(w％)

Proclin 300 0.1％(w％)

對甲酚 0.2mmol/L

pH值用NaOH調(diào)至7.0

將除三丙胺之外的其他成分分別稱量加入少量的水中攪拌使溶解，加入三丙胺攪拌靜置待全溶后移至容量瓶中，定容，搖勻即得。

B、清洗液(Cleancell)的組分與制備：

氫氧化鉀 200mmol/L

Trixton X-100 0.2％

AES 0.8％

尿素 0.1％

Proclin 300 0.5％

按照配方中的成分稱取適當(dāng)?shù)牧浚铀芙饣靹?，放冷，轉(zhuǎn)移至容量瓶，定容，搖勻即得。

實(shí)施例3

A、緩沖液(Procell)的組分與制備：

磷酸二氫鉀 300mmol/L

三丙胺 5mmol/L

N，N-二[正]丁基氨基乙醇3mmol/L

氯化鈉 5mmol/L

PEG 300 3mmol/L

丙二酰脲 5mmol/L

Tween 20 0.1％(w％)

Proclin 300 0.05％(w％)

對甲酚 0.1mmol/L

聚乙烯吡咯烷酮 0.1mmol/L

甲基纖維素 0.1mmol/L

pH值用NaOH調(diào)至6.8

將除三丙胺之外的其他成分分別稱量加入少量的水中攪拌使溶解，加入三丙胺攪拌靜置待全溶后移至容量瓶中，定容，搖勻即得。

B、清洗液(Cleancell)的組分與制備：

氫氧化鉀 180mmol/L

Trixton X-100 0.8％

MES 0.2％

硫脲 0.5％

Proclin 300 0.5％

按照配方中的成分稱取適當(dāng)?shù)牧?，加水溶解混勻，放冷，轉(zhuǎn)移至容量瓶，定容，搖勻即得。

實(shí)施例4

一、測定準(zhǔn)確性驗(yàn)證試驗(yàn)

1、將實(shí)施例1所配置的Procell和Cleancell置于羅氏的Elecsys2010電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)相應(yīng)的位置上進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，取30位患者血清進(jìn)行試驗(yàn)，對比與原裝配套試劑Procell、Cleancell檢測結(jié)果的相關(guān)性。

結(jié)果顯示，自配實(shí)施例1的Procell、Cleancell與原裝Procell、Cleancell性能一致性良好。

2、將實(shí)施例2所配置的Procell和Cleancell置于羅氏的Elecsys2010電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)相應(yīng)的位置上進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，取30位患者血清進(jìn)行試驗(yàn)，對比與原裝配套試劑Procell、Cleancell檢測結(jié)果的相關(guān)性。

結(jié)果顯示，自配實(shí)施例2Procell、Cleancell與原裝Procell、Cleancell性能一致性良好。

3、將實(shí)施例3所配置的Procell和Cleancell置于羅氏的Elecsys2010電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)相應(yīng)的位置上進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，取30位患者血清進(jìn)行試驗(yàn)，對比與原裝配套試劑Procell、Cleancell檢測結(jié)果的相關(guān)性。

結(jié)果顯示，自配實(shí)施例3Procell、Cleancell與原裝Procell、Cleancell性能一致性良好。

綜上可以看出，表明自配試劑在極大降低了三丙胺濃度的情況下，同時(shí)仍能完成全自動分析儀上的免疫測試，滿足與原裝試劑一致性的金標(biāo)準(zhǔn)，并且結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可見本發(fā)明的改進(jìn)配方的Procell、Cleancell具有相當(dāng)優(yōu)異的安全性和可靠性。

實(shí)施例5

二、Cleancell清洗效果驗(yàn)證試驗(yàn)

Cleancell的作用主要是每次測量后管道系統(tǒng)和測量池的清洗以及電極維護(hù)，本發(fā)明在原裝試劑的配方基礎(chǔ)上，改進(jìn)配方，以改進(jìn)其對管道和測量池的清洗作用，對其中的反應(yīng)液主要是殘留的蛋白進(jìn)行清洗，首先將大量空白血清與促甲狀腺素試劑盒反應(yīng)，再將以上反應(yīng)液分裝于空白比色杯中，靜置30min，倒掉，使用自配Cleancell與原裝配套試劑在相同的加入量的情況下進(jìn)行比色杯清洗(各進(jìn)行20組平行試驗(yàn))，清洗后加入等量的水，搖勻，在蛋白質(zhì)最大吸收波長280nm下，測試吸光度，觀察結(jié)果。

1.將實(shí)施例1中所配置的Cleancell按照以上驗(yàn)證方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見下表：

2.將實(shí)施例2中所配置的Cleancell按照以上驗(yàn)證方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見下表：

3.將實(shí)施例3中所配置的Cleancell按照以上驗(yàn)證方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見下表：

綜上可以看出，自配實(shí)施例1-3，改進(jìn)配方的Cleancell較原裝配套試劑的Cleancell的蛋白清洗效果更優(yōu)，因此本發(fā)明的改進(jìn)配方的Cleancell，清洗作用增強(qiáng)。從而使得，本發(fā)明配套使用的電化學(xué)發(fā)光緩沖液和清洗液將會更具有實(shí)際的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例的用途僅用于說明本發(fā)明而非意欲限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。此外，也應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動、修改和/或變型，所有的這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍之內(nèi)。