專利名稱：：一種擬除蟲菊酯類藥物群選性免疫親和層析柱的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明設(shè)計(jì)一種免疫親和層析柱(IAC)的制備方法，特別是一種擬除蟲菊酯類藥物群選性免疫親和層析柱的制備方法，屬于免疫分析
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是一類模擬天然除蟲菊酯化學(xué)結(jié)構(gòu)合成的高效低毒殺蟲劑，多數(shù)品種對(duì)周圍神經(jīng)有影響，也能作用于中樞神經(jīng)。主要中毒表現(xiàn)為頭昏、惡心、全身不適、肌顫等。中毒較重者可有抽搐、肺水腫及意識(shí)障礙。嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)呼吸、循環(huán)衰竭。目前擬除蟲菊酯類藥物的檢測(cè)方法有薄層層析法，高效液相色譜法，酶聯(lián)免疫吸附法，放射免疫測(cè)定法等，這些檢測(cè)方法中大多需要樣品前處理，因此有必要研制性能穩(wěn)定，結(jié)果可靠靈敏的免疫親和柱。目前免疫親和柱的制備方法大概有溴化氰法，過碘酸鈉法，蛋白A法等，免疫吸附劑主要是由惰性基質(zhì)和抗體組成的，惰性基質(zhì)是構(gòu)成IAC疏松空間的主要組分。通常，基質(zhì)需要具有一定的剛性，具有疏松的多孔結(jié)構(gòu)，要求顆粒均勻、大小一致，理化性質(zhì)穩(wěn)定，易于活化，并具有親水性以避免非特異性吸附等特點(diǎn)。普遍用于離線IAC的基質(zhì)主要有瓊脂糖(agarose)、葡聚糖(dextram)、纖維素(cellulose)、聚丙烯酰胺(polyacrylamide)、三丙烯酰胺(trisacryl)、聚甲基丙烯酸酯(polymethacrylate)等。由于這些物質(zhì)多不能耐受壓力，只能在重力作用的低流速條件下使用，常用來(lái)制備離線IAC。目前廣泛使用的商品化的瓊脂糖凝膠(型號(hào)4B，S印harose4B)(S印harose公司)是一種珠狀的瓊脂糖，它具備性質(zhì)獨(dú)特的疏松網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)有序，規(guī)則均一，能容許大分子物質(zhì)自由擴(kuò)散，適合抗體偶聯(lián)和抗原抗體進(jìn)行反應(yīng)。S印harose4B有一定的剛性，可耐受l磅/平方英尺(lpsi)的柱壓；具有良好的親水性；可耐受pH4-9，高濃度的鹽和水溶性有機(jī)溶劑；多糖骨架幾乎不帶電荷使得非特異性吸附大大降低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種擬除蟲菊酯類藥物群選性免疫親和層析柱的制備方法，本發(fā)明利用群特異性抗體的免疫親和層析凈化技術(shù)，能同時(shí)對(duì)擬除蟲菊酯類藥物多種組分進(jìn)行分離凈化，具備了處理多殘留組分的能力。本發(fā)明的技術(shù)方案一種擬除蟲菊酯類藥物群選性免疫親和層析柱的制備方法(1)擬除蟲菊酯類藥物群選型抗體的制備a.3-間苯氧甲酸_酰氯的合成，3-間苯氧甲酸簡(jiǎn)寫為3-PBA:2.2g3-PBA溶于3mL三氯甲烷中，在磁力攪拌器上輕柔攪拌，在K流中加入liiLN，N'_二甲基甲酰胺，然后將加熱溫度調(diào)為65°C，加入lmL亞硫酰氯，反應(yīng)lh后，加入正己烷2mL，然后用氮?dú)獯蹈?，反?fù)進(jìn)行3次該操作，得1.5mL深棕色的液體即為3-PBA-酰氯；b.3-間苯氧甲酸縮Y-氨基丁酸的合成將0.79gY-氨基丁酸預(yù)先溶于10mL2mol/L的K0H溶液中，加入2.65mL吡啶，于冰水浴中冷卻，將上述1.5mL3-PBA-酰氯溶液于10min內(nèi)加入Y-氨基丁酸溶液中，激5烈攪拌40min，并監(jiān)測(cè)其pH的變化情況，直到pH降低到7時(shí)，反應(yīng)結(jié)束；然后加入lmLlmol/LNaOH溶液，強(qiáng)力攪拌，反應(yīng)進(jìn)行15min后停止，使用6mol/LHCl酸化至pH<7，用10mL二氯甲烷液液萃取2次，萃取液合并后與20mL水進(jìn)行分配，收集有機(jī)相，過裝有5g無(wú)水硫酸鎂的漏斗，收集流出液并濃縮，結(jié)晶出來(lái)的晶體3-間苯氧甲酸縮y_氨基丁酸，簡(jiǎn)寫為3-PBA-y-AJDS，轉(zhuǎn)移到具塞瓶中，fC保存；c.3-PBA-y-AJDS與載體蛋白偶聯(lián)制備免疫原4.2iiL、0.032mmol/L氯甲酸異丁酯逐滴加入預(yù)先冷卻至13。C的溶液，溶液中包含0.032mmol/L的半抗原3-PBA-y-AJDS和9.8iiL、0.041mmol/L三丁胺，溶劑是0.5mL的二惡烷，在12-14"攪拌反應(yīng)45min，所產(chǎn)生的混合酸酐溶液逐滴加入至pH7.5、含54mgBSA蛋白、水二惡烷v/v為5:1的1.5mL水-二惡烷溶液中，混合物在4t:反應(yīng)5h，使用lmol/LNaOH調(diào)整pH始終在7.5，交聯(lián)物超濾凈化，然后進(jìn)行冷凍干燥，制得免疫原；免疫原按常規(guī)免疫方法制備抗體；經(jīng)ELISA鑒定，抗體的檢測(cè)限為0.5-1yg/kg;與氟胺氰菊酯，甲氰菊酯，A-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，氯氰菊酯及溴氰菊酯的交叉反應(yīng)率分別為100%，18%，76%，39%，8%，7%;(2)載體與抗體的偶聯(lián)a.偶聯(lián)將CNBr活化的proteinA-S印harose4B膠體(Pharmacia公司)從4°C冰箱中取出，回復(fù)至室溫，小心將膠體打散；取出20mL打散后膠體，用pH7.4、0.Olmol/L的PBS緩沖溶液充分洗滌，去除其保存液；之后，用pH7.4、0.Olmol/L的PBS緩沖溶液將膠體稀釋至40mL，使其充分懸浮，平均分配到2個(gè)50mL的離心管中；將29.7mg抗體用PBS緩沖溶液稀釋到20mL，然后分別取lOmL加入到含有膠體的離心管；室溫下小心攪拌30min，而后1000rpm離心10min回收所得載體與抗體偶聯(lián)的膠體；b.測(cè)定偶聯(lián)率用pH7.4、0.Olmol/L的PBS緩沖溶液多次洗滌載體與抗體偶聯(lián)的膠體以除去未結(jié)合的抗體，分管收集淋洗流出液，用紫外掃描儀檢測(cè)流出液在280nm下的紫外吸收，直到在該波長(zhǎng)下無(wú)吸收為止；計(jì)算洗滌液中的蛋白濃度，進(jìn)而推算抗體的偶聯(lián)率，公式如下彼勝細(xì)、偶聯(lián)前抗體總量一洗滌液中抗體重量^丄偶聯(lián)率(％)=-X100%(公式1)偶聯(lián)前抗體總量(3)封閉活化位點(diǎn)，加固抗體與基質(zhì)支持物的連接用pH8.2、0.2mol/L的三乙胺緩沖液充分洗滌膠體，使膠體溶液微環(huán)境處于三乙胺緩沖體系中，隨后往離心管中加用PH8.2、0.lmol/L三乙胺緩沖液新鮮配制的偶聯(lián)劑鄰苯二甲酸二甲酯DMP50mL(PierceChemical公司)，之后，室溫下顛倒混勻45min，然后將離心管置于1000rpm下離心lOmin回收膠體，用20mmol/L二乙胺水溶液50mL封閉未反應(yīng)的偶聯(lián)劑位點(diǎn)，室溫靜置5min;(4)裝免疫親和柱IAC柱將空柱用大量pH7.4、0.Olmol/LPBS緩沖液洗滌，將疏水的篩板置于底部；用大量PBS溶液充分洗滌膠體，更換其緩沖體系為PBS，之后將膠體小心蕩起，平均分裝于聚丙烯小柱(GE公司)內(nèi)，按lmL柱床體積/柱，小心地以流線式灌入，避免產(chǎn)生過多氣泡；然后將頂部濾片加上，小心將其推送至膠體表面；在頂部篩板上加0.5cm高的S印harose4B膠體；用大量PBS溶液沖洗，以去除柱床中的氣泡；最后用含有質(zhì)量濃度0.01%疊氮鈉的PBS6從冰箱中取出制備的IAC柱3支，PBS平衡后，將含8000ng的6種菊酯農(nóng)藥氟胺氰菊酯，A-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，甲氰菊酯，氯氰菊酯，溴氰菊酯的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶解于40mLPBS-甲醇，PBS:甲醇體積比80:20，連續(xù)加到IAC柱上，自然重力下流出，然后用20mLPBS、20mL水洗滌，最后用4mL甲醇洗脫，收集流出液，揮干溶劑，正己烷復(fù)溶后，用氣相_電子捕獲檢測(cè)器GC-ECD(氣相-電子捕獲檢測(cè)器)檢測(cè)；按下列公式計(jì)算每種動(dòng)態(tài)柱容量和絕對(duì)柱容量；空白對(duì)照柱按照上述(1)_(4)進(jìn)行，只是不加抗體溶液；(6)洗脫液的選擇將總體積為lOmL含有氟胺氰菊酯，A-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，甲氰菊酯，氯氰菊酯和溴氰菊酯各100ng的含有10%甲醇的PBS溶液連續(xù)加到IAC柱上，依次用20mLPBS、水洗滌柱，最后分別用不同比例的PBS溶液-甲醇溶液，醋酸溶液-甲醇，檸檬酸緩沖液-甲醇，甲醇溶液進(jìn)行洗滌；收集洗脫液，用GC-ECD測(cè)定，計(jì)算回收率；(7)上樣溶液和再生介質(zhì)確定由于擬除蟲菊酯類藥物的弱極性，在溶劑中加入一定比例助溶劑甲醇來(lái)改變其水溶性；上樣液選擇PBS，PBS-甲醇(9:1，v/v)，PBS-甲醇(8:2，v/v)，PBS-甲醇(75:25，v/v)，PBS-甲醇(7:3，v/v)，PBS-甲醇(6:4，v/v)，PBS-甲醇(5:5，v/v);上樣液初選為PBS-甲醇(8:2，v/v);將含有50ng的氟胺氰菊酯，入-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，甲氰菊酯，氯氰菊酯或溴氰菊酯的40mL溶液(PBS-甲醇8:2，v/v)連續(xù)加到IAC柱上，依次用PBS-甲醇(9:1，v/v)，PBS-甲醇(8:2，v/v)，PBS-甲醇(75:25，v/v)，PBS-甲醇(7:3，v/v)，水-甲醇(9:1，v/v)，水-甲醇(8:2，v/v)，水-甲醇(75:25，v/v)，水-甲醇(7:3，v/v)進(jìn)行洗滌，測(cè)定回收率；再生溶液初選為PBS;(8)重復(fù)使用和柱容量用氟胺氰菊酯和溴氰菊脂標(biāo)準(zhǔn)品為代表化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定，時(shí)間為2個(gè)月，考察免疫親和柱在此期間連續(xù)使用20次的動(dòng)態(tài)柱容量的變化。一次使用包括加樣、洗滌、洗脫和再生。20X甲醇的PBS(0.01M，pH7.4)溶液作為上樣溶液。洗脫液用4mL甲醇洗脫，再生用PBS(O.OIM，pH7.4)溶液，GC-ECD測(cè)定柱容量變化。用所述方法制備的擬除蟲菊酯類藥物群選性免疫親和層析柱的應(yīng)用實(shí)際樣品處理肉類組織經(jīng)研缽磨碎，添加水平每kg肉添加5，20或50iig的擬除蟲菊酯類藥物的試樣，取樣本5g，加無(wú)水硫酸鈉10g，混勻溶于30mL石油醚-乙醚溶液中，石油醚乙醚體積比為1:1，渦旋lmin后，超聲提取10min，離心，上清液揮干，溶于正己烷20mL和乙腈30mL的介質(zhì)中，液液分配，將乙腈層濃縮，溶于20mL上樣溶液中，上樣溶液為甲醇:PBS體積比2:8，PBS為pH7.4、0.01M;動(dòng)態(tài)柱容量(ngfeil)=上樣,頓農(nóng)度(ng/ml)X上樣液體積(ml)艦鵬積(ml)X100%(公式2)絕對(duì)往容量=檢測(cè)條件GC-ECD:檢測(cè)器300°C;進(jìn)樣口280°C;不分流進(jìn)樣；載氣高純氮；色譜柱DM-5，30mX0.32mmI.D，O.25iim(Dikma);程序升溫初始60。C維持lmin，25。C/min升至175°C，10°C/min升至300°C，300。C維持5min。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明利用群特異性抗體的免疫親和層析凈化技術(shù)，能同時(shí)對(duì)擬除蟲菊酯類藥物多種組分進(jìn)行分離凈化，具備了處理多殘留組分的能力。本發(fā)明利用實(shí)驗(yàn)所獲得的抗體與ProteinA-S印harose4B偶聯(lián)，裝填免疫親和層析柱。ProteinA特異地與抗體的重鏈恒定區(qū)(Fc)結(jié)合，將其可變區(qū)釋放出來(lái)，使得抗體定向地偶聯(lián)到基質(zhì)載體上，其結(jié)合區(qū)手臂充分地展開，有利于和目標(biāo)分子結(jié)合。與常用的spharose4B相比，后者依靠基質(zhì)骨架上游離的羥基非特異性地與抗體相連，由于結(jié)合的非特異性，抗體的結(jié)合部位也可被埋沒，使得只有部分結(jié)合部位裸露，在相同的膠體量和抗體量下，定向結(jié)合的ProteinA載體使得IAC柱有更高的柱容量。圖1洗脫液體積的選擇。圖2上樣溶液中甲醇組分的比例的選擇。圖320次使用期間小柱的柱容量變化曲線。圖46種菊酯在氣相色譜上的分離。1、甲氰菊酯，2、入-氯氟氰菊酯，3、氟氯氰菊酯，4、氯氰菊酯，5、氟胺氰菊酯，6、溴氰菊酯。具體實(shí)施例方式(1)擬除蟲菊酯類藥物群選型抗體的制備a.3-PBA-酰氯的合成2.2g3-PBA溶于3mL三氯甲烷中，在磁力攪拌器上輕柔攪拌，在K流中加入liiLN，N'-二甲基甲酰胺，然后將加熱溫度調(diào)為65t:，加入約lmL亞硫酰氯，反應(yīng)1小時(shí)后，加入正己烷2mL，然后用氮?dú)獯蹈桑磸?fù)進(jìn)行3次該操作，最后約1.5mL深棕色的液體即為3-PBA-酰氯。b.將0.79gY-氨基丁酸預(yù)先溶于10mL2M的K0H溶液中，加入2.65mL吡啶，于冰水浴中冷卻，將上述1.5mL3-PBA-酰氯溶液于10min內(nèi)加入Y-氨基丁酸溶液中，激烈攪拌40min，并監(jiān)測(cè)其pH的變化情況，直到pH降低到7時(shí)，反應(yīng)結(jié)束。然后加入lmL1MNaOH，強(qiáng)力攪拌，觀察pH的變化情況，反應(yīng)進(jìn)行15min后停止，使用6NHC1酸化至pH<7，用10mL二氯甲烷液液萃取2次。萃取液合并后與20mL水進(jìn)行分配，收集有機(jī)相，過裝有約5g無(wú)水硫酸鎂的漏斗，收集流出液并濃縮，結(jié)晶出來(lái)的晶體轉(zhuǎn)移到具塞瓶中，4t:保存。c.與載體蛋白的偶聯(lián)氯甲酸異丁酯(4.2iiL，0.032mM)逐滴加入預(yù)先冷卻的溶液(13°C)，溶液中包含0.032mM的半抗原3-PBA-y-AJDS和三丁胺(9.8yL，0.041mM)，溶劑是0.5mL的二惡烷，在12-14t:下攪拌反應(yīng)45min，所產(chǎn)生的混合酸酐溶液逐滴加入蛋白溶液(BSA54mg)于1.5mL水/二惡烷(5:1，v/v)pH7.5，混合物在4。C反應(yīng)5h，使用1MNaOH調(diào)整pH始終在7.5，交聯(lián)物超濾凈化，(PM10，000膜)，然后進(jìn)行冷凍干燥。d.免疫原經(jīng)常規(guī)流程制備抗體。經(jīng)ELISA鑒定，抗體的檢測(cè)限為0.5_1yg/kg。與氟胺氰菊酯，甲氰菊酯，A-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，氯氰菊酯和溴氰菊酯的交叉反應(yīng)率為100%，18%，76%，39%，8%，7%。[OO53](2)載體與抗體的偶聯(lián)a偶聯(lián)將CNBr活化的proteinA-S印harose4B膠體從4"C冰箱中取出，回復(fù)至室溫。小心將膠體打散，取出20mL打散后的膠體，用PBS充分洗滌，去除其保存液。之后，用PBS溶液將膠體稀釋至40mL，使其充分懸浮，平均分配到2個(gè)50mL的離心管中。將事先抗血清純化好的抗體(29.7mg)用PBS稀釋到20mL，然后分別取10mL加入到含有膠體的離心管。室溫下小心攪拌約30min，而后低速離心(1000rpm)10min回收膠體。b.測(cè)定偶聯(lián)率用PBS緩沖液多次洗滌膠體以除去未結(jié)合的抗體，分管收集淋洗流出液，用紫外掃描儀檢測(cè)流出液在280nm下的紫外吸收，直到在該波長(zhǎng)下無(wú)吸收為止。計(jì)算洗滌液中的蛋白濃度，進(jìn)而推算抗體的偶聯(lián)率，公式如下趣勝啦,。八偶聯(lián)前抗體總量一洗滌液中抗體重量、,偶聯(lián)率(％)=-X100%(公式1)偶聯(lián)前抗體總量多克隆抗體溶液與溴化氰活化的ProteinA-S印harose4B偶聯(lián)后，用大量的PBS洗去未結(jié)合的抗體分子，將收集的洗滌液進(jìn)行紫外測(cè)定，偶聯(lián)結(jié)果如下表1。利用上述公式，計(jì)算偶聯(lián)上的抗體量為27.2mg，偶聯(lián)率為91.6%。表1抗體偶聯(lián)率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(3)封閉活化位點(diǎn)，加固抗體與基質(zhì)支持物的鏈接用0.2M的三乙胺緩沖液(pH8.2)充分洗滌膠體，使其溶液微環(huán)境處于三乙胺緩沖體系中，將膠體裝于離心管中，隨后往離心管中加偶聯(lián)劑DMP(dimethylpimelimidate)50mL(O.1M，用pH8.2三乙胺緩沖液新鮮配制)，之后，室溫下顛倒混勻45min。然后將離心管置于1000rpm下離心10min回收膠體，用二乙胺水溶液50mL(20mM)封閉未反應(yīng)的交聯(lián)劑位點(diǎn)，室溫靜置5min。(4)裝柱將空柱用大量PBS緩沖液洗滌，將疏水的篩板置于底部。用大量PBS溶液充分洗滌膠體，更換其緩沖體系為PBS，之后將膠體小心蕩起，平均分裝于聚丙烯小柱內(nèi)，按lmL柱床體積/柱，小心地以流線式灌入，避免產(chǎn)生過多氣泡。然后將頂部濾片加上，小心將其推送至膠體表面。在頂部篩板上加約0.5cm高的S印harose4B膠體。用大量PBS溶液沖洗，以去除柱床中的氣泡。最后用含有0.01%疊氮鈉的PBS溶液保存小柱，膠體上方留約0.3cm高的緩沖液，于4t:冰箱中保存待用。(5)測(cè)定柱容量從冰箱中取出制備的IAC柱3支，PBS平衡后，將含8000ng的6種菊酯農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶解于40mLPBS-甲醇(80-20，v/v)連續(xù)加到IAC柱上，自然重力下流出，然后用20mLPBS、20mL水洗滌，最后用4mL甲醇洗脫，收集流出液，揮干溶劑，正己烷復(fù)溶后，用GC-ECD檢測(cè)。按下列公式計(jì)算動(dòng)態(tài)柱容量和絕對(duì)柱容量?！?，插處六，n上樣,物濃度(ngM)X上樣液體積(ml)、動(dòng)態(tài)柱谷量(ng/ml)=-—B^-n-^X100%(公式2)動(dòng)態(tài)往容量(ng/ml)絕對(duì)往容量=X100%(公式3)單位體枳膠的抗體(ng/ml)空白對(duì)照柱按照上述(1)(4)進(jìn)行，只是不加抗體溶液。根據(jù)所獲得的IAC柱，測(cè)定其對(duì)氟胺氰菊酯、入酯、氟氯氰菊酯以及溴氰菊酯6種藥物的柱容量。結(jié)果如表2所示，該柱對(duì)6種藥物的絕對(duì)柱容量為195-415ng/mgIgG，動(dòng)態(tài)柱容量為1289-2340ng/mL?？梢詽M足殘留分析的需要。表2親和層析柱的動(dòng)態(tài)和絕對(duì)柱容量<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(6)洗脫液的選擇0074]將10mL含有氟胺氰菊酯，入菊酯各100ng的PBS溶液(含有10%甲醇)連續(xù)加到IAC柱上，依次用20mLPBS、水洗滌柱，最后分別用不同比例的PBS溶液_甲醇溶液，醋酸溶液-甲醇，檸檬酸緩沖液-甲醇，甲醇溶液進(jìn)行洗滌。收集洗脫液，用GC-ECD測(cè)定，計(jì)算回收率。分別使用不同酸堿度和不同甲醇含量的PBS溶液對(duì)目的藥物進(jìn)行洗脫，測(cè)定其回收率，綜合考慮回收率和IAC柱的壽命，最終選擇了4mL甲醇作為最終的洗脫液(見圖1)。在此條件下，各個(gè)藥物的回收率均在93%以上，可以滿足殘留分析的要求。表3洗脫溶液對(duì)藥物回收率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>洗脫體積也是一個(gè)重要的參數(shù)，洗脫體積太大不方便濃度且可能破壞抗體的穩(wěn)定性。試驗(yàn)中我們對(duì)洗脫液甲醇的使用量進(jìn)行了優(yōu)化，見圖l所示，隨著甲醇體積的增加，回收率增加，由于有機(jī)溶劑對(duì)抗體的活性有損害，為了增加柱的可重復(fù)使用頻率，我們選擇了4mL甲醇，既可以滿足較高的回收率又不至于洗脫體積太大而降低IAC柱的壽命，同時(shí)也縮短了分析時(shí)間。(7)淋洗液的選擇動(dòng)物性組織樣本中油脂、蛋白等干擾物質(zhì)會(huì)顯著降低抗原-抗體反應(yīng)的特異性，大量的非特異性結(jié)合反應(yīng)引入了干擾物質(zhì)，降低了凈化效果。試驗(yàn)中，我們對(duì)豬肉樣品的提取物分別在IAC柱上進(jìn)行了凈化，并通過改變淋洗液PBS中NaCl的含量可以顯著地減少非特異性結(jié)合。結(jié)果表明，PBS-0.2MNaCl-20X甲醇可以在保證各個(gè)藥物較好的回收率的情況下減少非特異性結(jié)合。(8)上樣溶液和再生介質(zhì)確定由于擬除蟲菊酯類藥物的弱極性，在溶劑中加入一定比例助溶劑甲醇來(lái)改變其水溶性。將含有50ng的氟胺氰菊酯，A-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，甲氰菊酯，氯氰菊酯或溴氰菊酯的40mL溶液(PBS-甲醇9:1，v/v)連續(xù)加到IAC柱上，依次用PBS-甲醇(9:1，v/v)，PBS-甲醇(8:2，v/v)，PBS-甲醇(75:25，v/v)，PBS-甲醇(7:3，v/v)，水-甲醇(9:1，v/v)，水-甲醇(8:2，v/v)，水-甲醇(75:25，v/v)，水-甲醇(7:3，v/v)進(jìn)行洗滌，測(cè)定回收率。再生溶液初選為PBS。上樣溶液中甲醇的含量由于擬除蟲菊酯類藥物的弱極性，上樣溶液中含有一定比例的有機(jī)溶劑可以增強(qiáng)其溶解性，然而有機(jī)溶劑會(huì)破壞抗原-抗體結(jié)合，試驗(yàn)中對(duì)不同比例的甲醇-PBS上樣溶液進(jìn)行了測(cè)試，見圖2，結(jié)果表明，隨著甲醇含量的增加，目標(biāo)化合物在上樣流出液中的損失隨之增加，在甲醇比例為25%以下，測(cè)定回收率在90%以上，而甲醇比例超過30%則目標(biāo)化合物回收率急劇下降。因此，試驗(yàn)中選擇含20%甲醇的PBS(O.01M，pH7.4)溶液作為上樣溶液。(9)重復(fù)使用和柱容量用氟胺氰菊酯和溴氰菊脂標(biāo)準(zhǔn)品為代表化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定，時(shí)間為2個(gè)月，考察免疫親和柱在此期間連續(xù)使用20次的動(dòng)態(tài)柱容量的變化。一次使用包括加樣、洗滌、洗脫和再生。20X甲醇的PBS(0.01M，pH7.4)溶液作為上樣溶液。洗脫液用4mL甲醇洗脫，再生用PBS(O.OIM，pH7.4)溶液，GC-ECD測(cè)定柱容量變化。試驗(yàn)中在2個(gè)月內(nèi)考察了IAC柱的穩(wěn)定性，追蹤了在此期間的柱容量變化。圖3以氟胺氰菊酯或溴氰菊酯的柱容量變化表明了在20次重復(fù)使用過程中，在前6次過程中，柱容量迅速下降，此后趨于平穩(wěn)，尤其是在10次使用之后柱容量變化較小，此時(shí)的柱容量下降至最初的1/3。(見圖3)(10)標(biāo)準(zhǔn)曲線配制濃度為0，0.5，1，2，5，10，50，100，200ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用GC-ECD測(cè)定，以各組分色譜峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸。菊酯為手性藥物，對(duì)于在非手性柱上出現(xiàn)簇峰的，以各個(gè)峰面積總和計(jì)算，如氟氯氰菊酯為混旋體，有四個(gè)峰，以4峰面積總和計(jì)算?；貧w方程見表4，由表4知，在上述濃度范圍內(nèi)，每種藥物的響應(yīng)與濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于99%，典型色譜圖見圖4。表46種化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及線性回歸系數(shù)藥物線性范圍ng/mL線性方程回歸系數(shù)甲氰菊酯1-200y=0.9772x+9.60310.9946A-氯氟氰菊酯0.5-200y=1.5552x+13.8110.9970氟氯氰菊酯2-200y=0.5598x+l.67640.9995氯氰菊酯2-200y=1.639x+20.0110.9936氟胺氰菊酯2-200y=0.6366x+0.27860.9971溴氰菊酯2-200y=0.1143x-0.80060.9980(11)實(shí)際樣品處理肉類組織經(jīng)研缽磨碎，添加水平5，20或50iigkg—、取樣本(5g)，加無(wú)水硫酸鈉(lOg)，混勻溶于石油醚-乙醚(1:1，v/v，30mL)溶液中，渦旋(lmin)后，超聲提取(10min)，離心，上清液揮干，溶于正己烷(20mL)和乙腈(30mL)，液液分配，將乙腈層濃縮，溶于上樣溶液(甲醇PBS(0.01M，pH7.4)=2:8，20mL)。檢測(cè)條件GC-ECD:檢測(cè)器(300°C);進(jìn)樣口(280°C);不分流進(jìn)樣；載氣(高純氮)；色譜柱DM-5，30mX0.32mmI.D.，0.25iim(Dikma);程序升溫初始60。C維持lmin，25°C/min升至175°C，10°C/min升至300°C，300。C維持5min。表5豬肉添加回收試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權(quán)利要求一種擬除蟲菊酯類藥物群選性免疫親和層析柱的制備方法，其特征在于(1)擬除蟲菊酯類藥物群選型抗體的制備a.3-間苯氧甲酸-酰氯的合成，3-間苯氧甲酸簡(jiǎn)寫為3-PBA2.2g3-PBA溶于3mL三氯甲烷中，在磁力攪拌器上輕柔攪拌，在N2流中加入1μLN，N′-二甲基甲酰胺，然后將加熱溫度調(diào)為65℃，加入1mL亞硫酰氯，反應(yīng)1h后，加入正己烷2mL，然后用氮?dú)獯蹈桑磸?fù)進(jìn)行3次該操作，得1.5mL深棕色的液體即為3-PBA-酰氯；b.3-間苯氧甲酸縮γ-氨基丁酸的合成將0.79gγ-氨基丁酸預(yù)先溶于10mL2mol/L的KOH溶液中，加入2.65mL吡啶，于冰水浴中冷卻，將上述1.5mL3-PBA-酰氯溶液于10min內(nèi)加入γ-氨基丁酸溶液中，激烈攪拌40min，并監(jiān)測(cè)其pH的變化情況，直到pH降低到7時(shí)，反應(yīng)結(jié)束；然后加入1mL1mol/LNaOH溶液，強(qiáng)力攪拌，反應(yīng)進(jìn)行15min后停止，使用6mol/LHCl酸化至pH＜7，用10mL二氯甲烷液液萃取2次，萃取液合并后與20mL水進(jìn)行分配，收集有機(jī)相，過裝有5g無(wú)水硫酸鎂的漏斗，收集流出液并濃縮，結(jié)晶出來(lái)的晶體3-間苯氧甲酸縮γ-氨基丁酸，簡(jiǎn)寫為3-PBA-γ-AJDS，轉(zhuǎn)移到具塞瓶中，4℃保存；c.3-PBA-γ-AJDS與載體蛋白偶聯(lián)制備免疫原4.2μL、0.032mmol/L氯甲酸異丁酯逐滴加入預(yù)先冷卻至13℃的溶液，溶液中包含0.032mmol/L的半抗原3-PBA-γ-AJDS和9.8μL、0.041mmol/L三丁胺，溶劑是0.5mL的二惡烷，在12-14℃攪拌反應(yīng)45min，所產(chǎn)生的混合酸酐溶液逐滴加入至pH7.5、含54mgBSA蛋白、水∶二惡烷v/v為5∶1的1.5mL水-二惡烷溶液中，混合物在4℃反應(yīng)5h，使用1mol/LNaOH調(diào)整pH始終在7.5，交聯(lián)物超濾凈化，然后進(jìn)行冷凍干燥，制得免疫原；免疫原按常規(guī)免疫方法制備抗體；經(jīng)ELISA鑒定，抗體的檢測(cè)限為0.5-1μg/kg；與氟胺氰菊酯，甲氰菊酯，λ-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，氯氰菊酯及溴氰菊酯的交叉反應(yīng)率分別為100％，18％，76％，39％，8％，7％；(2)載體與抗體的偶聯(lián)a.偶聯(lián)將CNBr活化的proteinA-Sepharose4B膠體從4℃冰箱中取出，回復(fù)至室溫，小心將膠體打散；取出20mL打散后膠體，用pH7.4、0.01mol/L的PBS緩沖溶液充分洗滌，去除其保存液；之后，用pH7.4、0.01mol/L的PBS緩沖溶液將膠體稀釋至40mL，使其充分懸浮，平均分配到2個(gè)50mL的離心管中；將29.7mg抗體用PBS緩沖溶液稀釋到20mL，然后分別取10mL加入到含有膠體的離心管；室溫下小心攪拌30min，而后1000rpm離心10min回收所得載體與抗體偶聯(lián)的膠體；b.測(cè)定偶聯(lián)率用pH7.4、0.01mol/L的PBS緩沖溶液多次洗滌載體與抗體偶聯(lián)的膠體以除去未結(jié)合的抗體，分管收集淋洗流出液，用紫外掃描儀檢測(cè)流出液在280nm下的紫外吸收，直到在該波長(zhǎng)下無(wú)吸收為止；計(jì)算洗滌液中的蛋白濃度，進(jìn)而推算抗體的偶聯(lián)率，公式如下(3)封閉活化位點(diǎn)，加固抗體與基質(zhì)支持物的連接用pH8.2、0.2mol/L的三乙胺緩沖液充分洗滌膠體，使膠體溶液微環(huán)境處于三乙胺緩沖體系中，隨后往離心管中加用pH8.2、0.1mol/L三乙胺緩沖液新鮮配制的偶聯(lián)劑鄰苯二甲酸二甲酯DMP50mL，之后，室溫下顛倒混勻45min，然后將離心管置于1000rpm下離心10min回收膠體，用20mmol/L二乙胺水溶液50mL封閉未反應(yīng)的偶聯(lián)劑位點(diǎn)，室溫靜置5min；(4)裝免疫親和柱IAC柱將空柱用大量pH7.4、0.01mol/LPBS緩沖液洗滌，將疏水的篩板置于底部；用大量PBS溶液充分洗滌膠體，更換其緩沖體系為PBS，之后將膠體小心蕩起，平均分裝于聚丙烯小柱內(nèi)，按1mL柱床體積/柱，小心地以流線式灌入，避免產(chǎn)生過多氣泡；然后將頂部濾片加上，小心將其推送至膠體表面；在頂部篩板上加0.5cm高的Sepharose4B膠體；用大量PBS溶液沖洗，以去除柱床中的氣泡；最后用含有質(zhì)量濃度0.01％疊氮鈉的PBS溶液保存小柱，膠體上方留0.3cm高的緩沖液，于4℃冰箱中保存待用；(5)測(cè)定柱容量從冰箱中取出制備的IAC柱3支，PBS平衡后，將含8000ng的6種菊酯農(nóng)藥氟胺氰菊酯，λ-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，甲氰菊酯，氯氰菊酯，溴氰菊酯的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶解于40mLPBS-甲醇，PBS∶甲醇體積比80∶20，連續(xù)加到IAC柱上，自然重力下流出，然后用20mLPBS、20mL水洗滌，最后用4mL甲醇洗脫，收集流出液，揮干溶劑，正己烷復(fù)溶后，用氣相-電子捕獲檢測(cè)器GC-ECD檢測(cè)；按下列公式計(jì)算每種動(dòng)態(tài)柱容量和絕對(duì)柱容量；空白對(duì)照柱按照上述(1)～(4)進(jìn)行，只是不加抗體溶液；(6)洗脫液的選擇將總體積為10mL含有氟胺氰菊酯，λ-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，甲氰菊酯，氯氰菊酯和溴氰菊酯各100ng的含有10％甲醇的PBS溶液連續(xù)加到IAC柱上，依次用20mLPBS、水洗滌柱，最后分別用不同比例的PBS溶液-甲醇溶液，醋酸溶液-甲醇，檸檬酸緩沖液-甲醇，甲醇溶液進(jìn)行洗滌；收集洗脫液，用GC-ECD測(cè)定，計(jì)算回收率；(7)上樣溶液和再生介質(zhì)確定由于擬除蟲菊酯類藥物的弱極性，在溶劑中加入一定比例助溶劑甲醇來(lái)改變其水溶性；上樣液選擇PBS，PBS-甲醇(9∶1，v/v)，PBS-甲醇(8∶2，v/v)，PBS-甲醇(75∶25，v/v)，PBS-甲醇(7∶3，v/v)，PBS-甲醇(6∶4，v/v)，PBS-甲醇(5∶5，v/v)；上樣液初選為PBS-甲醇(8∶2，v/v)；將含有50ng的氟胺氰菊酯，λ-氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，甲氰菊酯，氯氰菊酯或溴氰菊酯的40mL溶液(PBS-甲醇8∶2，v/v)連續(xù)加到IAC柱上，依次用PBS-甲醇(9∶1，v/v)，PBS-甲醇(8∶2，v/v)，PBS-甲醇(75∶25，v/v)，PBS-甲醇(7∶3，v/v)，水-甲醇(9∶1，v/v)，水-甲醇(8∶2，v/v)，水-甲醇(75∶25，v/v)，水-甲醇(7∶3，v/v)進(jìn)行洗滌，測(cè)定回收率；再生溶液初選為PBS；(8)重復(fù)使用和柱容量用氟胺氰菊酯或溴氰菊脂標(biāo)準(zhǔn)品為代表化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定，時(shí)間為2個(gè)月，考察免疫親和柱在此期間連續(xù)使用20次的動(dòng)態(tài)柱容量的變化；一次使用包括加樣、洗滌、洗脫和再生；含20％甲醇的pH7.4、0.01M的PBS溶液作為上樣溶液；洗脫液用4mL甲醇洗脫，再生用pH7.4、0.01M的PBS溶液，GC-ECD測(cè)定柱容量變化。F2009102225780C0000021.tif,F2009102225780C0000022.tif,F2009102225780C0000023.tif2.用權(quán)利要求1所述方法制備的擬除蟲菊酯類藥物群選性免疫親和層析柱的應(yīng)用，其特征在于實(shí)際樣品處理肉類組織經(jīng)研缽磨碎，添加水平每kg肉添加5，20或50iig的擬除蟲菊酯類藥物的試樣，取樣本5g，加無(wú)水硫酸鈉108，混勻溶于301^石油醚-乙醚溶液中，石油醚乙醚體積比為l:l，渦旋lmin后，超聲提取10min，離心，上清液揮干，溶于正己烷20mL和乙腈30mL的介質(zhì)中，液液分配，將乙腈層濃縮，溶于20mL上樣溶液中，上樣溶液為甲醇:PBS體積比2:8，PBS為pH7.4、0.OIM;檢測(cè)條件GC-ECD:檢測(cè)器300°C;進(jìn)樣口280°C;不分流進(jìn)樣；載氣高純氮；色譜柱DM-5，30mXO.32mmI.D，0.25iim;程序升溫初始60°C維持lmin，25。C/min升至175°C，10°C/min升至300°C，3Q0。C維持5min。全文摘要一種擬除蟲菊酯類藥物群選性免疫親和層析柱的制備方法，屬于免疫分析
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明利用群特異性抗體的免疫親和層析凈化技術(shù)，能同時(shí)對(duì)擬除蟲菊酯類藥物多種組分進(jìn)行分離凈化。本發(fā)明利用實(shí)驗(yàn)所獲得的抗體與ProteinA-Sepharose4B偶聯(lián)，裝填免疫親和層析柱。ProteinA特異地與抗體的重鏈恒定區(qū)(Fc)結(jié)合，將其可變區(qū)釋放出來(lái)，使得抗體定向地偶聯(lián)到基質(zhì)載體上，其結(jié)合區(qū)手臂充分地展開，有利于和目標(biāo)分子結(jié)合。與常用的spharose4B相比，后者依靠基質(zhì)骨架上游離的羥基非特異性地與抗體相連，由于結(jié)合的非特異性，抗體的結(jié)合部位也可被埋沒，使得只有部分結(jié)合部位裸露，在相同的膠體量和抗體量下，定向結(jié)合的ProteinA載體使得IAC柱有更高的柱容量。文檔編號(hào)G01N33/531GK101726589SQ200910222578公開日2010年6月9日申請(qǐng)日期2009年11月20日優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日發(fā)明者匡華,彭池方,徐麗廣,李灼坤,胥傳來(lái),陳偉,馬偉申請(qǐng)人:江南大學(xué)