本發(fā)明涉及一種石榴皮止瀉散的定性與定量檢測方法。

背景技術：

石榴皮具澀腸止瀉，止血，驅(qū)蟲的功效。是一種常用中藥材。石榴皮止瀉散是由石榴皮藥材粉碎成中粉，直接分裝成不同規(guī)格的袋裝即可，為動物保健藥，用于豬腹瀉，黃白痢。一天用量是3～15g。

石榴皮止瀉散的組方與制備工藝如下：

【處方】石榴皮1000g

【制法】取石榴皮，粉碎，過篩，混勻，制成散劑1000g，即得。

石榴皮主含鞣質(zhì)，多以水解鞣質(zhì)為主，縮合鞣質(zhì)類較少。水解鞣質(zhì)又分為沒食子鞣質(zhì)和鞣花鞣質(zhì)，沒食子鞣質(zhì)是沒食子酸與糖類形成的酯類衍生物；鞣花鞣質(zhì)是鞣花酸與糖類形成的酯類衍生物，同時，沒食子鞣質(zhì)和鞣花鞣質(zhì)均可進一步酯化或者通過氧化交聯(lián)形成更復雜的水解鞣質(zhì)。所以中國藥典一部從2005年版開始，一直采用分光光度法，測定鞣質(zhì)含量，2015年版才增加上鞣花酸的HPLC含量測定。

其鞣質(zhì)的具體測定方法是：以沒食子酸為指標，通過與磷鉬鎢酸反應生成深藍色，在在760nm測定其總酚含量，以總酚含量減去不被干酪素吸附的非鞣質(zhì)的多酚量，即為鞣質(zhì)含量。操作步驟是：首先要制備沒食子酸對照品溶液，接著制備標準曲線，第三步要制備供試品溶液，該溶液必須放置過夜，鞣質(zhì)才能提取完全，第四步比色測定供試品溶液中的總酚含量，第五步保溫制備不被干酪素吸附的非鞣質(zhì)多酚樣品，并測定其含量?？偡雍繙p去不被干酪素吸附的多酚含量，即為鞣質(zhì)含量。實際上測定的是：以對照品沒食子酸反應物顏色為參照的，用樣品顏色的吸收度計算的含量，到底樣品中所含的鞣質(zhì)與沒食子酸是什么比例關系，無法考證。

中國藥典2015年版一部鞣花酸的含量測定方法如下：

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.2％磷酸溶液(21∶79)為流動相；檢測波長為254nm。理論板數(shù)按鞣花酸峰計算應不低于5000。

對照品溶液的制備 取鞣花酸對照品適量，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備 取本品粉末(過3號篩)0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率150W，頻率40kHz)40分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

測定法 分別精密吸取對照品溶液5μl、10μl，供試品溶液各5～10μl，注入液相色譜儀，測定，用外標兩點法計算含量，即得。

曾按藥典鞣花酸的方法測定石榴皮止瀉散的含量，出現(xiàn)鞣花酸波峰拖尾，峰型不對稱，且樣品濃度高，波峰面積大，流動相pH值在2以下，屬于易損色譜柱、非要求范圍，無法直接采用，需對方法進行改進。

查閱文獻得知，有采用高效液相法測定石榴皮中沒食子酸含量的報道，但多數(shù)都是測定的石榴皮中游離沒食子酸，含量低微約1mg/g^【1】；檢測波長是270nm、273nm或280nm，其波峰高度僅是215nm的1/3(見圖2)，且流動相多采用緩沖鹽^【2】，即便不是緩沖鹽的，有機相的比例為3％、流速為0.8ml/min，沒達到藥典限定的5％和1ml/min范圍。這樣就導致樣品取樣量大，干擾成分多，緩沖鹽或較低的有機相都會降低儀器與色譜柱的壽命。也有測定總沒食子酸的報道^【3】，但樣品前處理不科學，即取石榴皮粉末20g，加鹽酸(1→9)250ml，乙醚250ml，回流水解2小時，過濾，提取2次，合并濾液蒸干，甲醇定容至100ml，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。相當每1ml供試品溶液中含石榴皮藥材0.2g。從方法的文字，非專業(yè)技術人員很難判斷合并的濾液是鹽酸水部分，還是乙醚部分。測定的13個產(chǎn)地不同石榴皮中總沒食子酸含量在1.30～4.64mg/g之間，平均為2.92mg/g。

我們就是在上述背景條件下，為以簡便、快捷、準確、高標準控制石榴皮止瀉散的質(zhì)量，對其進行了質(zhì)量標準的探討研究，發(fā)明了石榴皮止瀉散的定性與定量檢測方法。

技術實現(xiàn)要素：

(1)本發(fā)明采用薄層色譜法，以石榴皮對照藥材為對照，鑒別了其散劑中相對應的特征點，方法簡便，只需2ml60％甲醇超聲對照藥材和供試品，上清液點樣，展開，紫外光燈254nm下檢視，即可(圖1)；

(2)采用高效液相色譜法，以體積比為3∶5.4∶91.6的乙腈-甲醇-0.1％磷酸為流動相，在215±1nm處(圖2)，測定了六批石榴皮止瀉散中總沒食子酸，含量在3.76mg/g～13.90mg/g之間，平均值為9.08mg/g，波峰分離良好，在三種不同的色譜柱上，峰保留時間都在10分鐘左右，進樣一針，運行15分鐘，沒食子酸對照品進樣量0.05μg，其波峰面積可達50萬，簡便、快捷、準確，靈敏度是報道方法的3倍以上。

(3)采用高效液相色譜法，以體積比為18∶5∶77的乙腈-甲醇-0.1％磷酸為流動相，在254nm±1nm處(圖10)，測定了樣品中鞣花酸含量，流動相由體積比21∶79的乙腈-0.2％磷酸溶液修訂為體積比18∶5∶77的乙腈-甲醇-0.1％磷酸后，提高了波峰對稱性，使流動相的pH值提升到2以上，減少了對色譜柱的損壞；提取溶劑由甲醇修訂為80％甲醇，鞣花酸含量提高9.9％，測定數(shù)值更趨于樣品的真實含量(見表8)，方法的準確性提升；鞣花酸的進樣量調(diào)整為0.04μg，波峰面積在50力，既保證數(shù)值準確性，又延長 了色譜柱壽命。

通過方法學考察，沒食子酸的進樣量在0.012298～0.196773μg，與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為：Y＝10149563.8X-3334，r＝0.99997(見表1、圖3)；采用加樣回收實驗，結(jié)果表明：沒食子酸的平均回收率為99.97％(n＝6)，RSD為0.51％(見表2)；沒食子酸的精密度(見表3)；穩(wěn)定性(見表4)；重復性(見表5)；專屬性(見圖4、5、6)與柱耐用性(見表6、圖7、8、9)；石榴皮止瀉散中沒食子酸含量結(jié)果(表7)；提取溶劑對鞣花酸含量影響(表8)；鞣花酸的進樣量在0.01302～0.2083μg，與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為：Y＝13048189.2X-21214r＝0.9998(見表9、圖11)；鞣花酸的平均回收率為99.86％(n＝6)，RSD為0.55％(見表10)；鞣花酸的精密度(見表11)；穩(wěn)定性(見表12)；重復性(見表13)；專屬性(見圖12、13、14)與柱耐用性(見表14、圖15、16、17)；石榴皮止瀉散中鞣花酸酸含量結(jié)果(表7)；等實驗數(shù)據(jù)均符合方法學要求。適用于石榴皮止瀉散中沒食子酸和鞣花酸的定量測定。

本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案為：

(1)定性鑒別方法

取石榴皮止瀉散0.5g，研細，加60％甲醇2ml，超聲處理15分鐘，上清液作為供試品溶液；再取石榴皮對照藥材0.5g，同法制備對照藥材溶液；吸取上述二種溶液各8～10μl，分別點于同一硅膠GF₂₅₄薄層板上，以體積比為2.5∶5∶0.3∶0.2的環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈254nm下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色主斑點；

(2).總沒食子酸含量測定方法

A.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為3∶5.4∶91.6的乙腈-甲醇-0.1％磷酸為流動相；檢測波長：215nm；柱溫為30℃；理論板數(shù)按去沒食子酸峰計算不低于2500；

B.對照品溶液制備 取沒食子酸對照品適量，精密稱定，加50％甲醇制成每1ml含2.5μg的溶液，即得；

C.供試品溶液制備 取通過3號篩的石榴皮止瀉散粉末0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水15ml和濃鹽酸6ml，加熱回流3小時，放冷，加20％氫氧化鈉4ml，搖勻，用水定量轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；

D.測定法 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測定，即得；

(3).鞣花酸含量測定方法

A.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為18∶5∶77的乙腈-甲醇-0.1％磷酸為流動相；檢測波長：254nm；柱溫為30℃；理論板數(shù)按去鞣花酸峰計算不低于4000；

B.對照品溶液的制備 取鞣花酸對照品適量，加甲醇制成每1ml含2μg的溶液，即得；

C.供試品溶液的制備 取通過3號篩的石榴皮止瀉散粉末0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，以功率250w、頻率33kHz，超聲處理40分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1ml，置10ml量瓶中，加80％甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；

測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

本發(fā)明的原理如下：

1.依據(jù)中藥各有效成分的化學結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，遵循相似相容的提取原則，采用適宜的提取溶劑，簡便、快捷地制備供試品與對照藥材溶液。再用不同極性的展開劑，進行展開，各種化學成分就會隨著不同的展開劑，依據(jù)吸附、解吸附、再吸附、解吸附的能力不同，而在各自的薄層板上得以良好分離，供試品色譜圖在與對照藥材色譜相應的位置上呈現(xiàn)相同的薄層斑點，而得以鑒別。

2.依據(jù)沒食子酸在215nm有最大吸收，而鞣花酸在254nm有最大吸收，通過流動相的組分與比例探討，使沒食子酸或鞣花酸波峰得以良好分離，且波峰對稱、保留時間適宜，在3種不同的色譜柱上，沒食子酸保留時間10分鐘左右，鞣花酸保留時間13～15分鐘。再依據(jù)該2種成分的進樣量在一定范圍內(nèi)，與其峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系，而用于定量測定。

本發(fā)明的創(chuàng)新點及有益效果如下：

(1)本發(fā)明薄層鑒別供試品與對照藥材只一步2ml60％甲醇超聲，上清液點樣、展開，紫外光燈254nm下檢視即可，無過濾、濃縮、蒸干、顯色步驟，前處理時間15分鐘，溶劑4ml；與藥典方法相比，檢測一批樣品可節(jié)約樣品前處理時間2.5小時，有機溶劑105ml，顯色劑10ml。

(2)本發(fā)明的總沒食子酸的含量測定方法，與已報道方法相比，在供試品的制備上，只需樣品0.1g，酸性水為溶媒，水解3小時后，適量堿中和過高的酸性，用水直接定容于50ml、取2ml續(xù)濾液，用50％甲醇稀釋至10ml，濾過，即可；而報道方法需樣品 20g，酸水250ml、乙醚250ml，要重復水解2次，每次2小時，合并濾液，蒸干，甲醇定容于100ml，濾過，進樣，即可。兩法相比，本方法比報道法節(jié)約有機溶劑596ml、時間2.5小時；從檢測靈敏度上，本發(fā)明供試品溶液的濃度是0.0004g/ml藥材，而報道方法則是0.2g/ml藥材，二者相差500倍，也就是報道方法進樣的一次，等于本方法進樣500次，本方法大幅度延長了儀器與色譜柱壽命。從方法準確性上，本方法測定的6批不同產(chǎn)地石榴皮生產(chǎn)的散劑，總沒食子酸平均含量為9.08mg/g，而報道方法測定的13批石榴皮的平均含量為2.92mg/g，本方法數(shù)值是報道方法的3倍，理由是本法酸濃度高，水解在酸水一相溶劑中，均勻、完全。綜上本發(fā)明簡便、快捷、準確、成本低、靈敏度高、環(huán)保、無溶劑蒸發(fā)給環(huán)境帶來的污染。

(3)與藥典記載的石榴皮中鞣花酸的含量測定相比：

1)流動相不同，藥典是乙腈-0.2％磷酸(21∶79)，一則酸的濃度大，pH值在2.0以下，極易損壞儀器與色譜柱，二則鞣花酸的波峰拖尾，峰的對稱性不好，修改為體積比為18∶5∶77的乙腈-甲醇-0.1％磷酸后，解決了鞣花酸的波峰拖尾，峰型對稱，流動相的pH值也提高到2.0以上；

2)鞣花酸對照品進樣量不同，藥典進樣量鞣花酸為0.1～0.2μg，本發(fā)明為0.04μg，峰面積仍在50萬，完全可以滿足準確測定含量的要求，藥典進樣量是本發(fā)明的2.5～5倍，波峰面積要達到百萬到二百多萬，試想高濃度進一針等于本研究進3針，對于色譜柱壽命講，本研究可以得到延長；

3)提取溶劑不同，從鞣花酸流動相中有機相的比例在21％，說明其是一偏水溶性的化合物，在甲醇中的溶解度應比含水甲醇中低，所以經(jīng)對比研究，采用80％甲醇提取，可使鞣花酸含量提高9.9％(見表8)，使測定結(jié)果更接近樣品的真實含量，進而提高了方法準確性。

附圖說明

圖1 石榴皮止瀉散的薄層鑒別圖

圖2 沒食子酸光譜掃描圖

圖3 沒食子酸線性關系圖

圖4 沒食子酸對照品HPLC色譜圖

圖5 石榴皮止瀉散中沒食子酸HPLC色譜圖

圖6 沒食子酸空白樣品HPLC色譜圖

圖7 沒食子酸柱耐用性試驗-島津柱HPLC色譜圖

圖8 沒食子酸柱耐用性試驗-luna柱HPLC色譜圖

圖9 沒食子酸柱耐用性試驗-安捷倫柱HPLC色譜圖

圖10 鞣花酸光譜掃描圖

圖11 鞣花酸線性關系圖

圖12 鞣花酸對照品HPLC色譜圖

圖13 石榴皮止瀉散中鞣花酸HPLC色譜圖

圖14 鞣花酸空白樣品HPLC色譜圖

圖15 鞣花酸柱耐用性試驗-島津-VP-ODS柱HPLC色譜圖

圖16 鞣花酸柱耐用性試驗-luna柱HPLC色譜圖

圖17 鞣花酸柱耐用性試驗-月旭柱HPLC色譜圖

圖1中，1.2.3為樣品，4.為石榴皮對照藥材。

圖2、圖10中，橫坐標為波長(nm)、縱坐標為吸收度(mAU)。

圖3、圖11中，橫坐標為進樣量(μg)、縱坐標為峰面積。

圖4、圖5、圖6、圖7、圖8、圖9中，橫坐標為保留時間(分鐘)，縱坐標為響應值(uV)，1為沒食子酸峰。

圖12、圖13、圖14、圖15、圖16、圖17中，橫坐標為保留時間(分鐘)，縱坐標為響應值(uV)，1為鞣花酸峰。

本發(fā)明具體實施方式

實施例

(1)定性鑒別方法

取石榴皮止瀉散0.5g，研細，加60％甲醇2ml，超聲處理20分鐘，上清液作為供試品溶液。再取石榴皮對照藥材0.5g，同法制備對照藥材溶液。吸取上述二種溶液各8～10μl，分別點于同一硅膠GF₂₅₄薄層板上，以體積比為2.5∶5∶0.3∶0.2的環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈254nm下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色主斑點；

(2).總沒食子酸含量測定方法

A.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為3∶5.4∶91.6的乙腈-甲醇-0.1％磷酸為流動相；檢測波長：215nm；柱溫為30℃；理論板數(shù)按去沒食子酸峰計算不低于2500；

B.對照品溶液制備 取沒食子酸對照品適量，精密稱定，加50％甲醇制成每1ml含2.5μg的溶液，即得；

C.供試品溶液制備取通過3號篩的石榴皮止瀉散粉末0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水15ml和濃鹽酸6ml，加熱回流3小時，放冷，加20％氫氧化鈉4ml，搖勻，用水定量轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；

D.測定法 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測定，即得，測定了6批樣品含量(見表7)；

(3).鞣花酸含量測定方法

A.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以體積比為18∶5∶77的乙腈-甲醇-0.1％磷酸為流動相；檢測波長：254nm；柱溫為30℃；理論板數(shù)按去鞣花酸峰計算不低于4000；

B.對照品溶液的制備 取鞣花酸對照品適量，加甲醇制成每1ml含2μg的溶液，即得；

C.供試品溶液的制備 取通過3號篩的石榴皮止瀉散粉末0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，以功率250w、頻率33kHz，超聲處理40分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1ml，置10ml量瓶中，加80％甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；

測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得，測定了6批樣品含量(見表7)；

表1 沒食子酸進樣量與峰面積

表2 樣品中沒食子酸的回收率試驗結(jié)果

表3 沒食子酸精密度實驗結(jié)果(峰面積)

表4 沒食子酸穩(wěn)定性實驗結(jié)果

表5 沒食子酸重復性試驗結(jié)果

表6 沒食子酸柱耐用性試驗結(jié)果(mg/g)

表7 石榴皮止瀉散中沒食子酸含量測定結(jié)果

表8 不同濃度甲醇提取對鞣花酸含量影響(mg/g)

表9 鞣花酸進樣量與峰面積

表10 樣品中鞣花酸的回收率試驗結(jié)果

表11 鞣花酸精密度實驗結(jié)果(峰面積)

表12 鞣花酸穩(wěn)定性實驗結(jié)果

表13 鞣花酸重復性試驗結(jié)果

表14 鞣花酸柱耐用性試驗結(jié)果(mg/g)

參考文獻

[1]張朔生，HPLC法測定炮制前后石榴皮中沒食子酸含量，藥物分析雜志，[J].2010.30(6)1104～1106

[2]周本宏，劉春，吳振華等，高效液相色譜法測定石榴皮中沒食子酸的含量，[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2005.25(12)1148～1150

[3]常占瑛，馬桂芝，高曉黎，HPLC法測定新疆不同產(chǎn)地石榴皮中沒食子酸的含量，[J].新疆醫(yī)科大學學報.2009.32(11)1552～1553。