本發(fā)明定量檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于單細(xì)胞拉曼光譜直接定量分析微孢子蟲孢子海藻糖含量的方法。

技術(shù)背景

微孢子蟲（Microsporidia）是一類細(xì)胞內(nèi)專性寄生單細(xì)胞真核生物，目前將其歸類為真菌，寄主很廣泛，可以感染包括人類在內(nèi)的無脊椎動物和脊椎動物，目前已發(fā)現(xiàn)有150多屬，1400余種。微孢子蟲對許多極具經(jīng)濟(jì)價值的昆蟲、魚類、兔子等都有致病性。其中，家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis，N.b）是人類最早發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲，主要寄生于家蠶。家蠶微粒子病就是由N.b感染、寄生引起的一種傳染性蠶病，可以通過食下傳染或胚種傳染，是蠶業(yè)生產(chǎn)上的毀滅性疫病，家蠶微孢子蟲不僅可寄生在家蠶幼蟲、蛹、蛾的多種組織內(nèi)，并能經(jīng)蠶卵垂直傳播給下一代，對蠶業(yè)生產(chǎn)尤其是蠶種生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害，而且極易導(dǎo)致蠶繭品質(zhì)和產(chǎn)量的下降，嚴(yán)重影響蠶絲產(chǎn)業(yè)鏈下游經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，被各國列為蠶種生產(chǎn)唯一的檢疫病害。

基于微孢子蟲對人類社會的影響及其在進(jìn)化生物學(xué)上的重要性，一直是廣大學(xué)者的研究興趣。尤其是微孢子蟲孢子的發(fā)芽機(jī)制，因?yàn)殒咦影l(fā)芽是微孢子蟲侵染寄主的關(guān)鍵起始。而海藻糖在微孢子蟲孢子的發(fā)芽過程中發(fā)揮了重要作用，孢子發(fā)芽前期，海藻糖與海藻糖酶因間隔膜的打破而相互接觸，在合適的條件下酶活性被激發(fā)，催化海藻糖水解為葡萄糖或果糖，孢子內(nèi)滲透質(zhì)濃度上升，外界水分在滲透勢差的作用下大量進(jìn)入孢子，極膜層和后極泡吸水膨脹，壓迫極絲解螺旋，極帽外翻成衣領(lǐng)狀結(jié)構(gòu)支撐著孢子前端極管的彈出。極管彈出刺入寄主細(xì)胞后，孢原質(zhì)開始擠入泡囊形成芽體侵染寄主。有研究表明，有的物種的孢子海藻糖濃度超過1.0 mol L^-1，但在發(fā)芽的時候僅有70%左右的海藻糖轉(zhuǎn)化為單糖，引起孢內(nèi)滲透壓升高進(jìn)而觸發(fā)孢子發(fā)芽。海藻糖濃度高低是否影響孢子的發(fā)芽力和侵染力呢，目前還不清楚。

海藻糖是真菌孢子中常見的雙糖物質(zhì)，常規(guī)的檢測方法有層析法、比色法、氣相色譜法、高效液相色譜法及酶法分析。層析法（紙層析、薄層層析）以試樣組分在固定相和流動相間的溶解、吸附、分配、離子交換或其他親和作用的差異為依據(jù)而建立起來的分離分析方法。這種方法比較費(fèi)時間，而且檢測人員可能接觸到有機(jī)溶劑。蒽酮比色法是糖類（在硫酸作用下，脫水生成糠醛或羥甲基糠醛，然后蒽酮與糠醛或羥甲基糠醛經(jīng)脫水縮合，產(chǎn)生藍(lán)綠色糠醛衍生物，通過分光光度計來定量。這種方法是非特異性的，會受到其它可與蒽酮試劑反應(yīng)的物質(zhì)的干擾。氣相色譜也可 以用于海藻糖的分離與檢測，但因?yàn)楹Ｔ逄遣皇菗]發(fā)性物質(zhì)，必需制成相應(yīng)的揮發(fā)性衍生物才能檢測。在定量分析海藻糖的方法中，高效液相色譜法（HPLC）定量的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性最好，但需要專業(yè)的設(shè)備。海藻糖酶法分析是最近發(fā)展起來的測定方法，其原理是通過海藻糖酶對海藻糖的特異性水解，產(chǎn)生的葡萄糖再用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶系統(tǒng)進(jìn)行檢測，該方法特異性高，分析成本也高，且受酶活力影響。

上述方法都是費(fèi)時、費(fèi)試劑且費(fèi)樣品的檢測方法，這些方法都需要先破碎孢子壁，把海藻糖從孢子內(nèi)釋放出來，需要較大數(shù)量的孢子樣品才能達(dá)到檢測的最小樣品要求，因而無法定量微量孢子的海藻糖濃度，更別說單個孢子的海藻糖濃度。而且檢測后的孢子樣品是被破壞的、沒有細(xì)胞活性的孢子樣品，無法直接分析海藻糖濃度與孢子的發(fā)芽力、侵染力相關(guān)性。因此，發(fā)展一種實(shí)時、無損的、快速的測量單個孢子海藻糖濃度的技術(shù)方法有非常重要的意義。

參考文獻(xiàn)：

1. 汪方煒，魯興萌. 微孢子蟲發(fā)芽機(jī)理. 科技通報，2001，17(1): 6-19

2. 趙祖康. 家蠶幼蟲血液中海藻糖含量及其酶的活性測定. 蠶業(yè)科學(xué), 1983(3):188-189.

3. 葛 宇，袁勤生. 海藻糖的定量分析方法比較. 藥物生物技術(shù)，2001，8（6）：348-351.

4. 何 鋼，劉 嵬，鄔曉勇，劉坤平，梁 立，彭靈犀，戴 欣，顏 軍，茍小軍. HPLC-RI法測定食用酵母的海藻糖含量. 食品工業(yè)科技，2015，14: 49-52.

5. 馬少敏，韋 航，蒙健宗. 酶法生產(chǎn)海藻糖的定量分析方法. 大眾科技, 2008, 10:111-112.

6. Albert H. Undeen, Laila M. El Gazzar , Robert K. Vander Meer, Narang S.. Trehalose levels and trehalase activity in germinated and ungerminated spores of Nosema algerae (Microspora: Nosematidae). Journal of Invertebrate Pathology, 1987, 50(3) : 230-237

7. Albert H. Undeen, Robert K. Vander Meer. Conversion of intrasporal trehalose into reducing sugars during germination of Nosema algerae (Protista: Microspora) spores: a quantitative study. Journal of Eukaryotic Microbiology, 1994, 41(2):129 - 132.。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

現(xiàn)有的測定微孢子蟲孢子海藻糖濃度的方法是通過蒽酮反應(yīng)的比色法或者層析法、氣相色譜法，或者高效液相色譜法，是費(fèi)時或者費(fèi)試劑的檢測方法。需要較大量的孢子樣品，無法定量微量孢子或者單個孢子的海藻糖濃度，且破壞檢測的孢子的活性。針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在提供一種無需試劑、操作簡便、可靠，且能夠快速定量單個具有生理活性的微孢子蟲孢子海藻糖濃度的方法。

具體的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種基于單細(xì)胞拉曼光譜快速定量微孢子蟲孢子海藻糖濃度的方法，包括以下步驟：

（1）含微孢子蟲孢子樣品與無菌水混勻，吸取100~500 微升含孢子水到檢測槽；

（2）采用激光鑷子將單個待檢樣品細(xì)胞固定，并通過拉曼光譜儀采集拉曼光譜；

（3）同樣的條件采集系列已知濃度的海藻糖溶液的拉曼光譜；

（4）通過拉曼光譜特征峰信號強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)待檢孢子海藻糖濃度的定量計算。

激光鑷子，又稱光學(xué)鑷子（英文：Optical tweezers），就是用激光形成的鑷子，是一種利用光壓原理制造的能夠移動或固定單個細(xì)胞和其他微小物體的儀器。拉曼光譜儀由激光源、收集系統(tǒng)、分光系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)構(gòu)成, 激光源一般采用能量集中、功率密度高的激光, 收集系統(tǒng)由透鏡組構(gòu)成, 分光系統(tǒng)采用光柵或陷波濾光片結(jié)合光柵以濾除瑞利散射和雜散光以及分光檢測系統(tǒng)低溫冷卻的電荷藕合器件。通過拉曼光譜技術(shù)能夠提供快速、簡單、可重復(fù)、無損傷的定性定量分析。

本發(fā)明方法中，通過激光鑷子將單個待檢樣品細(xì)胞移動并固定在光束的聚集中心，采集到的拉曼光譜是整個孢子的完整信號，比常規(guī)的共焦顯微方法得到更強(qiáng)的信號，更好的信噪比。而且，孢子的某些拉曼光譜特征峰的出現(xiàn)與否直接反映了是否含有某些特殊物質(zhì)，其強(qiáng)度與胞內(nèi)物質(zhì)的含量（濃度）呈線性相關(guān)。因此，通過對待檢樣品的特征峰的信號強(qiáng)度，便能簡單快速計算出待檢樣品某類物質(zhì)的含量（濃度）。

本發(fā)明的有益效果是：

（1）本發(fā)明方法操作簡便，無需染色，無需復(fù)雜的樣品準(zhǔn)備過程，樣品直接懸浮在水中進(jìn)行檢測即可。

（2）本發(fā)明方法能夠快速直觀地定量待檢樣品里單個微孢子蟲孢子的海藻糖濃度。

（3）本發(fā)明方法能夠獲知大量孢子中每個孢子間海藻糖濃度的差異。

（4）單個個樣品孢子進(jìn)行光譜采集、數(shù)據(jù)處理等工序僅需要10～20秒。

（5）本發(fā)明方法對檢測孢子不造成傷害，檢測后的孢子是活的，還可以用于進(jìn)一步的分析或研究，而且適用于其他含海藻糖的微生物單細(xì)胞。

附圖說明

圖1是含與不含海藻糖的家蠶微孢子蟲孢子的拉曼光譜曲線及其差異光譜，以及0.5 mol L^-1海藻糖溶液的拉曼光譜曲線。

圖2是不同濃度海藻糖溶液與536 cm^-1拉曼峰信號強(qiáng)度相關(guān)性曲線。

圖3是幾種不同來源的家蠶微孢子蟲孢子的單個孢子海藻糖濃度分布。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，本實(shí)施例僅是對本發(fā)明作更清楚的說明，而不是對本發(fā)明的限制。

一、家蠶微孢子蟲孢子海藻糖拉曼光譜分析

1、 實(shí)驗(yàn)材料

菌株：分離自感染家蠶微孢子蟲?。∟osema bombycis，簡稱N.b）蠶體的孢子。

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.1 N.b侵染過程/方法

將供試的微孢子蟲孢子液稀釋成濃度為1×10⁷ mL^-1的懸浮液，取微孢子懸浮液涂抹于桑葉表面，飼喂3齡起蠶，待蠶兒吃盡帶毒桑葉后，改飼正常無毒桑葉。

2.2 N.b孢子分離

取感染死亡的蠶體，解剖出家蠶的中腸用研缽研碎，經(jīng)過過濾，取濾液在離心機(jī)上差速離心，獲得家蠶微孢子。

2.3 光譜收集

將孢子用無菌水稀釋，吸取200 μL置于用石英片密封而成的樣品槽中，外加蓋玻片密封。100倍油浸物鏡尋找目標(biāo)細(xì)胞，光鑷隨機(jī)俘獲單個孢子，將目標(biāo)細(xì)胞提升至石英片上方5 μm左右，激光強(qiáng)度調(diào)整為50 mW，信號累積時間為10 s，收集目標(biāo)孢子的拉曼光譜，此時收集到的是帶有背景的孢子的拉曼光譜，于孢子附近以相同條件收集背景拉曼光譜，每個樣品收集30個左右的孢子的拉曼光譜，3個背景拉曼光譜。同樣實(shí)驗(yàn)條件下采集0.1、0.2、0.5、0.8、1.0和1.5 mol L^-1海藻糖溶液的拉曼光譜。

2.4 數(shù)據(jù)處理方法

光譜數(shù)據(jù)先進(jìn)行背景扣除和響應(yīng)曲線的校正，其算法為S_act(v)=[S_acq(v)- S_bg(v)]/R(v) [其中S_act(v)為樣品的實(shí)際光譜，S_acq(v)為帶背景的光譜，S_bg(v)為背景光譜，R(v)為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的響應(yīng)曲線]；采用vb 編程對數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑去噪，其算法是9點(diǎn)Savitzky-Golay 卷積平滑法，以線性本底法（總峰面積法）計算的峰面積作為特征峰的信號強(qiáng)度。

3、結(jié)果分析

以拉曼光譜強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，拉曼位移為橫坐標(biāo)，構(gòu)建成如圖1所示的孢子拉曼光譜圖。從圖1可知，a曲線是成熟的N.b孢子，主要的拉曼峰為406、438、539、843、913、1081、1127和1343 cm^-1，是海藻糖溶液的典型特征峰，以及718、785 cm^-1（核酸）、1003、1450、1655 cm-1（蛋白質(zhì)）和1304 cm^-1（脂類物質(zhì)）。把a(bǔ)曲線與基線相似而拉曼峰較弱的不含海藻糖的b類光譜相減，得到的差異光譜與海藻糖溶液的拉曼光譜幾乎一致。因此，圖1中a類孢子海藻糖峰顯著，富含海藻糖；而b類細(xì)胞沒有海藻糖峰，其胞內(nèi)主要拉曼峰源自核酸、蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)，顯然不含有海藻糖溶液。這說明成熟的N.b孢子其孢內(nèi)主要成分是海藻糖溶液，以及其它生物大分子。

同樣條件下采集的系列海藻糖溶液拉曼光譜，分析536 cm^-1的拉曼峰的強(qiáng)度與海藻糖濃度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在0.1~1.5 mol L^-1范圍內(nèi)，536 cm^-1強(qiáng)度與海藻糖濃度成顯著的相關(guān)性（圖2），說明基于光鑷的單細(xì)胞拉曼光譜可以定量微區(qū)域的海藻糖濃度。

二、應(yīng)用實(shí)施例

從桑蠶生產(chǎn)現(xiàn)場收集的死蠶和人為培養(yǎng)感染N.b的死蠶，共10個蠶體的樣品。分別解剖出的家蠶中腸用研缽研碎，經(jīng)過過濾，取濾液在離心機(jī)上差數(shù)離心，獲得家蠶微孢子。

將孢子用無菌水稀釋，吸取200 μL置于樣品槽中，激光鑷子將待檢樣品的單個孢子固定，并通過拉曼光譜儀采集拉曼光譜。通過待檢樣品細(xì)胞拉曼光譜特征峰強(qiáng)度來定量分析孢子海藻糖、蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)的含量。

來自成熟N.b孢子的拉曼光譜峰主要源自海藻糖溶液，以及蛋白質(zhì)和核酸，脂類物質(zhì)的峰較弱，說明成熟孢子的主要成分是海藻糖，而脂類物質(zhì)含量較低。

對出現(xiàn)海藻糖峰的孢子數(shù)據(jù)進(jìn)一步的分析顯示，不同來源的N.b孢子的785、915和1658 cm^-1等峰的平均信號強(qiáng)度有所不同，說明不同蠶體產(chǎn)生的孢子其海藻糖含量、核酸含量和蛋白質(zhì)含量有差異，而單個孢子的785、915和1658 cm^-1峰強(qiáng)度相關(guān)性極低。海藻糖濃度分布顯示，部分蠶體孢子的海藻糖含量分布比較集中，且多數(shù)蠶體呈正態(tài)分布，說明不同蠶體間形成的孢子均勻性也存在差異。

圖3是三種不同來源的單個N.b孢子的海藻糖濃度分布圖，Nb_wild是桑蠶基地收集的死蠶分離的孢子，Nb_last year是低溫保存1年后的孢子，Nb_new是實(shí)驗(yàn)室人工新繁殖的孢子。圖中顯示，（1）不同來源的微孢子蟲孢子、同一群體內(nèi)不同孢子間孢內(nèi)海藻糖濃度存在顯著的異質(zhì)性，平均濃度為0.23～0.37 mol/L；（2）野外采集的蟲株孢內(nèi)海藻糖含量顯著低于室內(nèi)人工繁殖的，可能原因是孢子沒有完全成熟，其孢子間的差異極顯著；（3）低溫保藏一年后孢子的海藻糖含量基本沒有變化，但孢子間分布不均勻。