本發(fā)明屬于病原菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于單細(xì)胞拉曼光譜直接檢測(cè)病原菌微孢子蟲(chóng)孢子的方法。

背景技術(shù)：

微孢子蟲(chóng)（Microsporidia）是一類(lèi)細(xì)胞內(nèi)專(zhuān)性寄生單細(xì)胞真核生物，目前將其歸類(lèi)為真菌。微孢子蟲(chóng)的生活史可分為侵染期（孢子發(fā)芽）、繁殖期（裂殖生殖）和孢子形成期等3 個(gè)階段。孢子是微孢子蟲(chóng)的成熟細(xì)胞，隨寄主糞便排泄到體外而到處擴(kuò)散，感染新的寄主，而孢子的發(fā)芽是微孢子蟲(chóng)侵染寄主的關(guān)鍵起始。

微孢子蟲(chóng)的寄主很廣泛，可以感染包括人類(lèi)在內(nèi)的無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物，引起許多昆蟲(chóng)、水產(chǎn)動(dòng)物甚至靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物等的嚴(yán)重病害。目前已發(fā)現(xiàn)有150多屬，1400余種。其中，家蠶微孢子蟲(chóng)（Nosema bombycis，簡(jiǎn)稱(chēng)N.b）是人類(lèi)最早發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲(chóng)，主要寄生于家蠶。家蠶微粒子病就是由N.b感染、寄生引起的一種傳染性蠶病，可以通過(guò)食下傳染或胚種傳染，對(duì)家蠶具有很強(qiáng)的危害性，被各國(guó)列為蠶種生產(chǎn)唯一的檢疫病害。隨著我國(guó)蠶絲業(yè)的發(fā)展，蠶種生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，家蠶微粒子病對(duì)蠶種和蠶業(yè)生產(chǎn)的威脅也日趨嚴(yán)重。家蠶微粒子病是蠶業(yè)生產(chǎn)上的毀滅性疫病，家蠶微孢子蟲(chóng)不僅可寄生在家蠶幼蟲(chóng)、蛹、蛾的多種組織內(nèi)，并能經(jīng)蠶卵垂直傳播給下一代，對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)尤其是蠶種生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害，而且極易導(dǎo)致蠶繭品質(zhì)和產(chǎn)量的下降，嚴(yán)重影響蠶絲產(chǎn)業(yè)鏈下游經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。因此，對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)的研究是養(yǎng)蠶業(yè)中一個(gè)非常重要的項(xiàng)目，既具有理論意義，也具有實(shí)用價(jià)值。

國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)微孢子蟲(chóng)的檢測(cè)方法進(jìn)行了大量的探索和研究，從最早的肉眼鑒定方法發(fā)展到顯微鏡檢查以及目前以血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)為主的檢測(cè)技術(shù)。而對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)的診斷方法的研究，包括光學(xué)鏡檢、電鏡檢查、血清學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)等，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。光學(xué)鏡檢雖然相對(duì)比較可靠、簡(jiǎn)便，但是其檢測(cè)靈敏度較低，一般需要在感染的晚期才能觀察到，檢測(cè)存在極大的滯后性。電鏡檢查必須經(jīng)過(guò)超薄切片后再進(jìn)行電鏡觀察，對(duì)技術(shù)設(shè)備和操作人員的技術(shù)要求比較高，目前主要用于科研，尚且不能實(shí)用地進(jìn)行診斷鑒別。分子生物學(xué)中的對(duì)微孢子蟲(chóng)的檢測(cè)方法雖然在靈敏度以及特異性等方面比傳統(tǒng)的顯微鏡檢法有很大的優(yōu)勢(shì)，但是該方法對(duì)操作人員的實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求高，觀察結(jié)果染色時(shí)使用的染液對(duì)人體也會(huì)造成較大的毒性。微孢子蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)的研究方向是實(shí)時(shí)、快捷、高效、準(zhǔn)確和低價(jià)。因此，如何建立一種既快速、簡(jiǎn)便、高效又能夠在基層廣泛使用的檢測(cè)方法已迫在眉睫。

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

目前，微孢子蟲(chóng)的檢測(cè)方法雖然有各自的優(yōu)點(diǎn)但是都存在著一定的缺陷。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在提供一種無(wú)需染色、操作簡(jiǎn)便、可靠，且能夠快速直觀判別微孢子蟲(chóng)孢子的方法。

具體的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種基于單細(xì)胞拉曼鑷子檢測(cè)病原菌微孢子蟲(chóng)孢子的方法，包括以下步驟：

（1）將含菌樣品與無(wú)菌水混勻，進(jìn)行10^-1～10^-2梯度稀釋?zhuān)?00~200 微升含孢子水到檢測(cè)槽；

（2）采用激光鑷子將單個(gè)待檢樣品細(xì)胞固定，并通過(guò)拉曼光譜儀采集拉曼光譜；

（3）通過(guò)拉曼光譜特征峰出現(xiàn)與否及其強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)待檢樣品是否含孢子的判別。

拉曼鑷子（英文：Raman tweezers），亦即拉曼光譜（Raman spectroscopy）與激光鑷子（Laser tweezers）兩種技術(shù)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)結(jié)合的單細(xì)胞分析技術(shù)。激光鑷子就是用激光形成的鑷子，是一種利用光壓原理形成的光勢(shì)力阱，能夠固定單個(gè)細(xì)胞或者其他微小物體并可以移動(dòng)的特定的位置。拉曼光譜儀由激光源、收集系統(tǒng)、分光系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)構(gòu)成, 激光源一般采用能量集中、功率密度高的激光, 收集系統(tǒng)由透鏡組構(gòu)成, 分光系統(tǒng)采用光柵或陷波濾光片結(jié)合光柵以濾除瑞利散射和雜散光，并經(jīng)由低溫降噪的電荷藕合器件采集微弱的拉曼信號(hào)。通過(guò)拉曼鑷子技術(shù)能夠提供快速、簡(jiǎn)單、可重復(fù)、無(wú)損傷的定性定量分析，而且是實(shí)時(shí)的反應(yīng)了細(xì)胞正常的生理機(jī)能和生理狀態(tài)的單個(gè)細(xì)胞的分析。

本發(fā)明方法中，通過(guò)激光鑷子將單個(gè)待檢樣品細(xì)胞移動(dòng)并固定在光束的聚集中心，采集到的拉曼光譜是整個(gè)孢子的完整信號(hào)，比常規(guī)的共焦顯微方法得到更強(qiáng)的信號(hào)，更好的信噪比。而且，孢子的某些拉曼光譜特征峰的出現(xiàn)與否直接反映了是否含有某些特殊物質(zhì)，其強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的含量。因此，通過(guò)對(duì)待檢樣品是否檢測(cè)到特異的孢子拉曼峰，便能快速直觀地判斷出待檢樣品是否微孢子蟲(chóng)孢子。

本發(fā)明的有益效果是：

（1）本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，無(wú)需染色，樣品直接懸浮在無(wú)菌水中進(jìn)行檢測(cè)即可。

（2）本發(fā)明方法能夠快速直觀地判斷出待檢樣品是否微孢子蟲(chóng)孢子，單個(gè)樣品孢子進(jìn)行光譜采集、數(shù)據(jù)處理等工序僅需要10～20 s，每個(gè)樣品5 min即可。

（3）本發(fā)明方法對(duì)檢測(cè)細(xì)胞不造成傷害，而且適用于所有單細(xì)胞微生物。

附圖說(shuō)明

圖1是3種不同的孢子的平均拉曼光譜圖。

圖2是幾種孢子狀細(xì)胞的判別分布圖。

圖3是影響幾種孢子狀細(xì)胞判別分布的載荷分析圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明作更清楚的說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

一、不同家蠶微孢子蟲(chóng)孢子拉曼光譜分析

1、 實(shí)驗(yàn)材料

菌株：分離自感染家蠶微孢子蟲(chóng)病（Nosema bombycis，簡(jiǎn)稱(chēng)N.b）的蠶體。

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.2 N.b侵染過(guò)程/方法

將供試的微孢子蟲(chóng)孢子液稀釋成濃度為1×10⁷ mL^-1的懸浮液，取微孢子懸浮液涂抹于桑葉表面，飼喂3齡起蠶，待蠶兒吃盡帶毒桑葉后，改飼正常無(wú)毒桑葉。

2.3 N.b孢子分離

取感染死亡的蠶體，解剖出的家蠶中腸用研缽研碎，經(jīng)過(guò)過(guò)濾，取濾液在離心機(jī)上差速離心，獲得家蠶微孢子。

2.4 光譜收集

將孢子用無(wú)菌水稀釋?zhuān)?00 μL置于用石英片密封而成的樣品槽中，外加蓋玻片密封。100倍油浸物鏡尋找目標(biāo)細(xì)胞，光鑷隨機(jī)俘獲單個(gè)孢子，將目標(biāo)細(xì)胞提升至石英片上方5μm左右，激光強(qiáng)度調(diào)整為50 mW，信號(hào)累積時(shí)間為10 s，收集目標(biāo)孢子的拉曼光譜，此時(shí)收集到的是帶有背景的孢子的拉曼光譜，于孢子附近以相同條件收集背景拉曼光譜，每個(gè)樣品收集30個(gè)左右的孢子的拉曼光譜，3個(gè)背景拉曼光譜。上述光譜的收集于室溫24℃的環(huán)境下進(jìn)行。

2.4 數(shù)據(jù)處理方法

光譜數(shù)據(jù)先進(jìn)行背景扣除和響應(yīng)曲線的校正，其算法為S_act(v)=[S_acq(v)- S_bg(v)]/R(v) [其中S_act(v)為樣品的實(shí)際光譜，S_acq(v)為帶背景的光譜，S_bg(v)為背景光譜，R(v)為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的響應(yīng)曲線]；采用vb 編程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑去噪，其算法是9 點(diǎn)Savitzky-Golay 卷積平滑法。

3、結(jié)果分析

以經(jīng)基線校正的孢子拉曼光譜強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，拉曼位移為橫坐標(biāo)，構(gòu)建成如圖1所示的孢子拉曼光譜圖。從圖1可知，主要的拉曼峰為406、438、536、843、913、1081、1127和1343 cm^-1，主要來(lái)自海藻糖溶液，以及來(lái)自核酸（718、785 cm^-1）、蛋白質(zhì)（1003、1450、1655 cm^-1）和脂類(lèi)物質(zhì)（1304、1450 cm^-1）。因此，圖1中a、b兩類(lèi)孢子海藻糖峰顯著，富含海藻糖；而c類(lèi)細(xì)胞沒(méi)有海藻糖峰，其胞內(nèi)主要拉曼峰源自核酸、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)物質(zhì)，顯然不含有海藻糖溶液。這說(shuō)明成熟的N.b孢子其孢內(nèi)主要成分是海藻糖溶液，以及其它生物大分子。

二、應(yīng)用實(shí)施例

從生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)收集的死蠶和感染了不同昆蟲(chóng)微孢子的蟲(chóng)體和一個(gè)非孢子類(lèi)的細(xì)胞樣品，共6種樣品。分別解剖出的罹病蟲(chóng)體的中腸用研缽研碎，經(jīng)過(guò)過(guò)濾，取濾液在離心機(jī)上差速離心，獲得微孢子蟲(chóng)孢子。

將孢子用無(wú)菌水稀釋?zhuān)?00 μL置于樣品槽中，激光鑷子將待檢樣品的單個(gè)孢子固定，并通過(guò)拉曼光譜儀采集30-50個(gè)細(xì)胞的拉曼光譜。最后通過(guò)待檢樣品細(xì)胞拉曼光譜特征峰和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法判別細(xì)胞是否是微孢子蟲(chóng)孢子。

圖2、3是幾種孢子狀細(xì)胞的判別分布及其載荷分析圖。圖中顯示，來(lái)自家蠶和昆蟲(chóng)的微孢子蟲(chóng)孢子集中分布在一個(gè)區(qū)域，而非孢子明顯的分布于一個(gè)獨(dú)立的區(qū)域，有效判別率達(dá)到100%。而影響其分布的主要因素是成分1，主要的特征峰為406、438、536、843、913、1081、1127、1350和1462 cm^-1等來(lái)自海藻糖溶液的拉曼峰。