一種快速便隱血雙聯(lián)檢試紙條及其制備方法，涉及便隱血標(biāo)志物轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅蛋白檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

便隱血試驗(yàn)是指消化道出血量少，肉眼不見血色，少量紅細(xì)胞被消化分解，以至在顯微鏡下也無從發(fā)現(xiàn)的出血，為檢測這種出血而進(jìn)行的試驗(yàn)。正常人的便隱血試驗(yàn)為陰性，而陽性結(jié)果常見于腸癌、消化道炎癥或出血性疾病等患者糞便檢測。因而便隱血檢測試驗(yàn)對診斷消化道出血具有重要意義，也是目前進(jìn)行消化道腫瘤普查、初篩和監(jiān)測的有效手段，便隱血診斷試驗(yàn)結(jié)果已是臨床上診斷消化道出血的常測指標(biāo)。

便隱血診斷常用的普查方法有化學(xué)法和膠體金法兩種，但化學(xué)法與膠體金法相比檢測結(jié)果更易受到飲食和藥物的干擾導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽性，而膠體金法采用單克隆抗體基于抗原抗體的免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測，在檢測靈敏度和特異性等方面提高了檢測的準(zhǔn)確性，在臨床上應(yīng)用越來越廣泛。其中便隱血檢測觀察的標(biāo)志物為轉(zhuǎn)鐵蛋白(tf)和血紅蛋白(hb)兩種，目前在臨床上使用的膠體金法一般只針對兩種標(biāo)志物其中的一種進(jìn)行檢測，這種檢測具有快捷、高效和成本低的特點(diǎn)。兩種蛋白相比各自具有獨(dú)特優(yōu)異的性質(zhì)，如胃腸道中轉(zhuǎn)鐵蛋白相比于血紅蛋白抗菌能力更強(qiáng)，性質(zhì)更穩(wěn)定不易分解，可降低檢測樣本需求，是腸癌蛋白表達(dá)的標(biāo)志物，有助于提高檢測的特異性；在血液中血紅蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的比例為51.2∶1.0，糞便中比例為5.4∶1.0，血紅蛋白可被成功檢測的概率更高，有助于檢測靈敏度的提升。但單一蛋白檢測帶來了一定的局限性主要表現(xiàn)在以下幾個方面。單一進(jìn)行血紅蛋白檢測會由于受到腸內(nèi)細(xì)菌的作用及大腸粘膜產(chǎn)生的黏液成分影響而變性或者分解帶來檢測出現(xiàn)假陰性的情況；轉(zhuǎn)鐵蛋白在體內(nèi)可能會因?yàn)檫z傳性無轉(zhuǎn)鐵蛋白血癥、惡性疾病、手術(shù)等炎癥為主的疾病導(dǎo)致含量偏低導(dǎo)致單一檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性。

基于以上血紅蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白特性和檢測局限性的分析，將兩種標(biāo)志蛋白單一檢測合二為一，在一根試紙條一次檢測中同時進(jìn)行兩種蛋白的檢測，既可簡化檢測操作豐富檢測輸出數(shù)據(jù)，也能夠降低假陰性的出現(xiàn)可能性，使檢測結(jié)果更全面，為疾病的診斷分析提供更為真實(shí)有效的結(jié)果，提高消化道疾病的檢出率。目前這種在一根試紙條一次檢測中同時進(jìn)行便隱血兩種標(biāo)志物轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅蛋白的檢測方法尚未見報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的：針對現(xiàn)有檢測轉(zhuǎn)鐵蛋白tf和血紅蛋白hb的技術(shù)的不足和缺陷，提供一種基于膠體金免疫層析技術(shù)，具有靈敏度高、反應(yīng)時間短、不需要儀器設(shè)備和低 廉高效的特點(diǎn)，可同時實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)鐵蛋白tf和血紅蛋白hb的快速檢測的方法，便于更加快速、靈敏和簡便地檢測人體中潛在直腸病變。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種快速同時便隱血雙聯(lián)檢的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，其中試紙條由襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、雙聯(lián)檢金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜、吸水墊組成，雙聯(lián)檢金標(biāo)結(jié)合墊為吸附轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和血紅蛋白抗體的玻璃纖維膜，在包被膜上包被有分別用于檢測的由轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和血紅蛋白抗體溶液印制的直線式隱形檢測線t1和t2線，用羊抗鼠igg溶液印制的直線式隱形對照線c線1條，總共3條線：

所述的襯板為不吸水的硬質(zhì)塑膠條；樣品墊為玻璃纖維膜；包被膜為硝酸纖維素膜；吸水墊為吸水濾紙；

所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白的單克隆抗體；

所述的血紅蛋白金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的血紅蛋白的單克隆抗體；

所述的膠體金為使用檸檬酸三鈉還原的金納米粒子；

所述的用于檢測的轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和血紅蛋白抗體分別為：特異性識別轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅蛋白的單克隆抗體。

所述快速同時檢測轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅蛋白的膠體金免疫層析試紙條的制備方法：

1)用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm的膠體金溶液；

2)雙聯(lián)檢金標(biāo)抗體的制備：用0.1mol/lk2co3調(diào)節(jié)膠體金溶液為ph8.5，將1ml膠體金溶液加入1.5ml離心管中，逐滴加入8μltf抗體溶液(濃度為1mg/ml)，25℃室溫溫和震蕩1h，逐滴加入10％bsa，使bsa的終濃度為1％，持續(xù)攪拌30min，再將金標(biāo)抗體溶液常溫9600rpm離心8min，溶液分為二層：透明上清，管底可流動的暗紅色沉淀；輕吸并棄去上清液，將可流動的暗紅色沉淀用重懸液混懸，恢復(fù)原體積后再離心；重復(fù)2-4次，以徹底除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，最后用重懸液將沉淀混懸為原體積的1/10，4℃保存?zhèn)溆?，獲得轉(zhuǎn)鐵蛋白tf膠體金標(biāo)記抗體；

所述重懸液為含1％蔗糖的5％bsa溶液；

用0.1mol/lk2co3調(diào)節(jié)膠體金溶液為ph8.5，將1ml膠體金溶液加入1.5ml離心管中，逐滴加入8μlhb抗體溶液(濃度為1mg/ml)，25℃室溫溫和震蕩1h，逐滴加入0.5％casein，使casein的終濃度為0.05％，持續(xù)攪拌30min，再將金標(biāo)抗體溶液常溫9600rpm離心8min，溶液分為二層：透明上清，管底可流動的暗紅色沉淀；輕吸并棄去上清液，將可流動的暗紅色沉淀用重懸液混懸，恢復(fù)原體積后再離心；重復(fù)2-4次，以徹底除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，最后用重懸液將沉淀混懸為原體積的1/10，4℃保存?zhèn)溆?，獲得血紅蛋白hb膠體金標(biāo)記抗體；

所述重懸液為含1％蔗糖的0.25％casein溶液；

將兩種完成標(biāo)記的金標(biāo)抗體混合，完成雙聯(lián)檢金標(biāo)抗體的制備；

3)將制備好的雙聯(lián)檢金標(biāo)抗體涂抹吸附于玻璃纖維膜中，26℃干燥，制備雙聯(lián)檢金標(biāo)結(jié)合墊；

4)包被轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和血紅蛋白抗體及羊抗鼠igg至包被膜：用噴膜儀分別將選定濃度的轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和血紅蛋白抗體噴載于包被膜的t1和t2線，以及羊抗鼠igg噴載于包被膜的c線上，37℃烘箱干燥4h備用；

5)檢測試紙條的制作：將樣品墊、雙聯(lián)檢金標(biāo)結(jié)合墊、包被有轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體和血紅蛋白抗體及羊抗鼠igg的包被膜、吸水墊依次銜接在襯板上，組成快速同時檢測轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅蛋白的膠體金免疫層析試紙條；

6)膠體金層析試紙條檢測反應(yīng)原理：本發(fā)明采用雙抗夾心法，即樣品中的轉(zhuǎn)鐵蛋白或者血紅蛋白同時被固定在包被膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體或者血紅蛋白單克隆抗體和膠體金標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白或者血紅蛋白單克隆抗體捕獲實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物檢測。

當(dāng)試紙條以樣品墊末端浸入樣本后，樣品溶液沿著試紙條通過毛細(xì)作用從下往上泳動，溶解金標(biāo)墊上干燥的金標(biāo)抗體，若待測樣品中存在兩種目標(biāo)物，則兩種目標(biāo)物分別與相對應(yīng)的金標(biāo)抗體識別結(jié)合，繼續(xù)泳動到t1和t2檢測線和硝酸纖維膜上的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，從而膠體金顆粒發(fā)生聚集，形成兩條紅色的線條，然后其他未結(jié)合的金標(biāo)抗體繼續(xù)通過毛細(xì)管作用向前泳動，與控制線上的羊抗鼠二抗發(fā)生第二次免疫反應(yīng)，同樣形成紅色線條，這樣包被膜上就會有t1、t2和c線三條紅色線條，表示樣品兩種目標(biāo)物均為陽性。若待測樣品中存在一種目標(biāo)物，則該目標(biāo)物與相對應(yīng)金標(biāo)抗體，與目標(biāo)物識別的金標(biāo)抗體繼續(xù)泳動與檢測線相應(yīng)抗體結(jié)合，從而只一條檢測線有紅色線條出現(xiàn)，繼續(xù)泳動與控制線上的羊抗鼠二抗發(fā)生免疫反應(yīng)，形成紅色線條，這樣包被膜上會有兩條紅色線條，表示樣品為一種目標(biāo)物測試呈陽性。若待測樣品中不存在目標(biāo)物，則金標(biāo)抗體不會與檢測線抗體結(jié)合，從而檢測線就不會有紅色線條出現(xiàn)，繼續(xù)泳動與控制線上的羊抗鼠二抗發(fā)生免疫反應(yīng)，形成紅色線條，這樣包被膜上會有一條紅色線條，表示樣品為陰性。控制線是為檢驗(yàn)金標(biāo)免疫層析方法本身是否有效而設(shè)定的，所以無論樣品中是否存在目標(biāo)物，控制線都應(yīng)該顯現(xiàn)，如果控制線不顯色，則說明試紙條失效。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的檢測試紙條具有下列優(yōu)點(diǎn)：

1)特異性強(qiáng)，敏感性高。該膠體金層析檢測試紙條以膠體金標(biāo)記高親和力的單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金標(biāo)記對抗體的特異性和親和力影響很小，且具有較高的標(biāo)記率。因此，試紙條具有較強(qiáng)的特異性和較高的敏感性。

2)簡便、快速、時效性強(qiáng)。使用膠體金層析檢測試紙條和試紙卡，無需任何其它試劑和儀器，可現(xiàn)場操作，試紙條加入被檢樣品液后，在15分鐘內(nèi)即可判定檢測結(jié)果。

3)結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確。檢測試紙條均以顯示紅色線t線和c線作為檢測結(jié)果陽性和陰性標(biāo)記，即在包被膜上顯示一條紅色線c線時，表示在被檢樣品中不含有目標(biāo)物；顯示t線和c線兩條紅色線條時，表示在被檢樣品只含有一種目檢物；顯示t1、t2線和c線三條紅色線條時，表示在被檢樣品兩種目檢物都含有。結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確，簡單明了，不易出現(xiàn)假陽性和假陰性等人為誤判。

4)節(jié)省費(fèi)用，適用范圍廣，便于推廣。使用檢測試紙條，比用儀器分析和elisa試劑盒的費(fèi)用大幅下降。另外，試紙條的適用范圍廣，可滿足不同層次人員需要，包括專業(yè)檢驗(yàn)，海關(guān)檢疫，衛(wèi)生檢疫，質(zhì)量監(jiān)測，加工企業(yè)和養(yǎng)殖場戶等，便于推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場前景和明顯的經(jīng)濟(jì)、社會效益。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明是基于膠體金免疫層析技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅蛋白雙聯(lián)檢測方法，它具有靈敏度高、反應(yīng)時間短、儀器設(shè)備便宜、方便易用和輸出結(jié)果豐富等特點(diǎn)。

附圖說明

圖1、便隱血雙聯(lián)檢膠體金層析檢測試紙條側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2、便隱血雙聯(lián)檢膠體金層析檢測試紙條俯視結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

要制成便隱血雙聯(lián)檢的膠體金免疫層析檢測試紙條，首先需要制備膠體金，用于標(biāo)記制備金標(biāo)抗體；另外需要羊抗鼠igg抗體，用于制備對照線(c線)。

1)雙聯(lián)檢金標(biāo)抗體和金標(biāo)物結(jié)合墊的制備：檸檬酸三鈉還原法制備膠體金：由于氯化金極易吸濕，因此使用小劑量封裝的氯化金時，必須一次配完。將1g的氯化金一次溶解于雙蒸水中配成1％的水溶液。放在4℃冰箱內(nèi)保存，保存時間長達(dá)幾個月至1年左右。再取1％的氯金酸溶液10ml，配制成濃度為0.1g/l的氯金酸溶液。取0.1g/l氯金酸溶液50ml放入錐形瓶，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰并持續(xù)2min，在1400r/min磁力攪拌下，加入1％檸檬酸三鈉水溶液0.8ml，保持溫度和攪拌速度不變，繼續(xù)攪拌加熱6min，直至溶液呈透亮的酒紅色。室溫冷卻，4℃保存?zhèn)溆?。獲得直徑為20nm的膠體金溶液。

2)用0.1mol/lk2co3調(diào)節(jié)膠體金溶液為ph8.5，將1ml膠體金溶液加入1.5ml離心管中，逐滴加入8μltf抗體溶液(濃度為1mg/ml)，25℃室溫溫和震蕩1h，逐滴加入10％bsa，使bsa的終濃度為1％，持續(xù)攪拌30min，再將金標(biāo)抗體溶 液常溫9600rpm離心8min，溶液分為二層：透明上清，管底可流動的暗紅色沉淀；輕吸并棄去上清液，將可流動的暗紅色沉淀用重懸液混懸，恢復(fù)原體積后再離心：重復(fù)2～4次，以徹底除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，最后用重懸液將沉淀混懸為原體積的1/10，4℃保存?zhèn)溆?，獲得轉(zhuǎn)鐵蛋白tf膠體金標(biāo)記抗體；

所述重懸液為含1％蔗糖的5％bsa溶液；

用0.1mol/lk2co3調(diào)節(jié)膠體金溶液為ph8.5，將1ml膠體金溶液加入1.5ml離心管中，逐滴加入8μlhb抗體溶液(濃度為1mg/ml)，25℃室溫溫和震蕩1h，逐滴加入0.5％casein，使casein的終濃度為0.05％，持續(xù)攪拌30min，再將金標(biāo)抗體溶液常溫9600rpm離心8min，溶液分為二層：透明上清，管底可流動的暗紅色沉淀；輕吸并棄去上清液，將可流動的暗紅色沉淀用重懸液混懸，恢復(fù)原體積后再離心；重復(fù)2-4次，以徹底除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，最后用重懸液將沉淀混懸為原體積的1/10，4℃保存?zhèn)溆茫@得血紅蛋白hb膠體金標(biāo)記抗體；

所述重懸液為含1％蔗糖的0.25％casein溶液；

將兩種完成標(biāo)記的金標(biāo)抗體混合，完成雙聯(lián)檢金標(biāo)抗體的制備；

將制備好的雙聯(lián)檢金標(biāo)抗體涂抹吸附于玻璃纖維膜中，26℃干燥，制備雙聯(lián)檢金標(biāo)結(jié)合墊；

實(shí)施例1：把1.0mg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅蛋白包被抗體及羊抗鼠igg噴在包被膜上，分別作為檢測線t1、t2和控制線c，在37℃烘箱干燥4h。以同樣方法，將一定濃度的金標(biāo)抗體包被在結(jié)合墊上。試紙條組成為一個襯板，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、包被膜和吸水墊。將貼好的板切割成4mm寬的條，然后將試紙條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)密封保存。

實(shí)施例1：把1.5mg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅蛋白包被抗體及羊抗鼠igg噴在包被膜上，分別作為檢測線t1、t2和控制線c，在37℃烘箱干燥4h。以同樣方法，將一定濃度的金標(biāo)抗體包被在結(jié)合墊上。試紙條組成為一個襯板，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、包被膜和吸水墊。將貼好的板切割成4mm寬的條，然后將試紙條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)密封保存。

實(shí)施例1：把2.0mg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅蛋白包被抗體及羊抗鼠igg噴在包被膜上，分別作為檢測線t1、t2和控制線c，在37℃烘箱干燥4h。以同樣方法，將一定濃度的金標(biāo)抗體包被在結(jié)合墊上。試紙條組成為一個襯板，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、包被膜和吸水墊。將貼好的板切割成4mm寬的條，然后將試紙條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)密封保存。

檢測操作方法：將便隱血雙聯(lián)檢膠體金免疫層析檢測試紙條樣品端插入待測樣 品液中，插入深度不超過標(biāo)記線，約10-20秒鐘取出檢測試紙條，水平放置，15分鐘左右肉眼觀察判定檢測結(jié)果。

結(jié)果判定：如果在包被膜上僅有c線一條紅線顯現(xiàn)，表示檢測結(jié)果為陽性，說明在待測樣品中不含有轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅蛋白；如果在包被膜上c線和t1線兩條紅線都顯現(xiàn)，說明在待測樣品中含有轉(zhuǎn)鐵蛋白；如果在包被膜上c線和t2線兩條紅線都顯現(xiàn)，說明在待測樣品中含有血紅蛋白；如果在包被膜上c線、t1線和t2線三條紅線都顯現(xiàn)，說明在待測樣品中含有轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅蛋白，表示消化道已有隱性出血；如果在包被膜上c線紅線不顯現(xiàn)，則表明試紙條已失效。

通過采用前述使用方法對本發(fā)明的隱血雙聯(lián)檢測試紙進(jìn)行了200例臨床樣本的驗(yàn)證試驗(yàn)，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，糞便隱血總陽性檢出率雙聯(lián)法高于單克隆抗體法；在上消化道病變樣本中陽性檢出率雙聯(lián)法高于單克隆抗體法；雙聯(lián)法檢測tf的陽性率高于單克隆抗體法檢測hb的陽性率；在下消化道病變樣本中，雙聯(lián)法與單克隆抗體法的陽性檢出率無顯著差異。表明檢測糞便中人tf可以克服樣本中hb或紅細(xì)胞被分解變性而出現(xiàn)的假陰性結(jié)果，從而提高糞便隱血試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示試驗(yàn)產(chǎn)品與對照組無顯著性差異，試驗(yàn)產(chǎn)品達(dá)到臨床診斷金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果。

200例樣本兩種方法檢測結(jié)果統(tǒng)計：

雙聯(lián)法是利用抗人tf抗體和抗人hb抗體進(jìn)行隱血檢測，特異性地針對糞便中人tf和人hb。靈敏度高，特異性強(qiáng)。雙聯(lián)法將抗人tf抗體和抗人hb抗體整合在同一試劑盒內(nèi)，可同步檢測tf與hb，互不干擾，二者優(yōu)勢互補(bǔ)。國外學(xué)者對hb以外的血液成分如tf、結(jié)合血紅蛋白，纖維蛋白原等作為消化道出血指標(biāo)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)tf具有消化道出血的特異性和對抗細(xì)菌分解的穩(wěn)定性，且穩(wěn)定性明顯高于hb，經(jīng)56℃30min處理，抗原活性無變化，而hb抗原活性大部分喪失，tf/hb雙聯(lián)膠體金診斷試紙可同時檢測tf與hb，能大大減少假陰性反應(yīng)的出現(xiàn)，提高臨床診斷準(zhǔn)確率。篩檢方法效率評價結(jié)果表明，雙聯(lián)法的靈敏度高于單克隆抗體法組，但兩種方法的特異度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，作為篩檢方法應(yīng)首選雙聯(lián)法，尤其對于上消化道出血顯著提高了檢出陽性率和準(zhǔn)確率，真正意義上實(shí)現(xiàn)了全消化道出血性疾病的定性篩查。

綜上所述，雙聯(lián)法靈敏度較高，特異性強(qiáng)，可同步檢測tf與hb，優(yōu)于糞便隱 血單克隆抗體法單純檢測hb，并有效地提高了真陽性率，確保了隱血檢測的準(zhǔn)確性，是消化道出血性疾病輔助診斷的可靠依據(jù)，值得廣泛用于臨床。

盡管上文對本發(fā)明的具體實(shí)施方式給予了詳細(xì)描述和說明，但是應(yīng)該指明的是，我們可以依據(jù)本發(fā)明的構(gòu)想對上述實(shí)施方式進(jìn)行各種等效改變和修改，其所產(chǎn)生的功能作用仍未超出說明書及附圖所涵蓋的精神時，均應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。