本發(fā)明屬于一種液相色譜分析方法，具體涉及一種同時(shí)分離代謝組和脂質(zhì)組組份的高效液相色譜分析方法。

背景技術(shù)：

代謝組學(xué)技術(shù)探尋代謝物與生理病理變化的相對(duì)關(guān)系，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。其定性定量分析的對(duì)象為生物體內(nèi)的所有代謝物。這些代謝物的組成十分復(fù)雜且性質(zhì)差異很大，給分離分析帶來(lái)非常大的困難，使代謝組學(xué)的發(fā)展與分析技術(shù)的發(fā)展密切相關(guān)。

反相液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因其較高的柱效、重復(fù)性、靈敏度和分辨率而成為代謝組學(xué)研究中的核心技術(shù)之一。由于代謝物性質(zhì)差異非常大，發(fā)展了一系列非靶向和靶向的分析方法。一般來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)的非靶向的分析方法可以覆蓋極性和中等極性的代謝物，如氨基酸、脂肪酸、肉堿和溶血磷脂等。這些分析方法主要有兩個(gè)弊端，其一是極性代謝物由于在反相色譜柱上保留太弱而在死時(shí)間流出，分離度差，分辨率低且存在嚴(yán)重的離子抑制；其二是非極性較強(qiáng)的磷脂和甘油酯等代謝物由于保留太強(qiáng)而無(wú)法洗脫。

針對(duì)上述問(wèn)題，后來(lái)發(fā)展了一些特定的分析方法，如使用洗脫能力較強(qiáng)的溶劑(如異丙醇)作為流動(dòng)相對(duì)脂類(lèi)進(jìn)行分析；使用親水液相色譜對(duì)極性代謝物進(jìn)行分析等。但是由于分析條件不同，若想獲得盡可能多的代謝信息需要進(jìn)行兩次甚至多次提取和分離，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且需要更大量的樣品。因此，發(fā)展高通量、高代謝物覆蓋度的分析方法在日常代謝組學(xué)分析中十分必要。

基于常規(guī)代謝組學(xué)分析方法中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明建立了一種代謝組和脂質(zhì)組同時(shí)分離的高效液相色譜分析方法。使用捕集柱將復(fù)雜樣品中的代謝組和脂質(zhì)組組份分離并轉(zhuǎn)移，結(jié)合后續(xù)分別針對(duì)代謝組和脂質(zhì)組的平行柱分離，實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣同時(shí)有效的分離代謝組和脂質(zhì)組代謝物。本發(fā)明所構(gòu)建的液相色譜分析方法適用于多種復(fù)雜樣品體系如植物樣品、血樣、尿樣、組織等樣品的高效分離。該方法通量高且代謝物覆蓋度廣，構(gòu)建靈活，操作簡(jiǎn)便，與質(zhì)譜兼容性好，在復(fù)雜樣品分離分析中有非常廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)上述代謝組學(xué)分析技術(shù)中存在的問(wèn)題，提供一種高通量、高覆蓋度的液相色譜分析方法及其應(yīng)用。通過(guò)引入合適的捕集柱將復(fù)雜樣品中的代謝組和脂質(zhì)組組份分離并轉(zhuǎn)移，結(jié)合后續(xù)的高效液相色譜分析，實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣同時(shí)分析代謝組和脂質(zhì)組組份。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，具體發(fā)明技術(shù)方案如下：

本發(fā)明涉及一種同時(shí)分離代謝組和脂質(zhì)組的高效液相色譜分析方法，采用的裝置包括液相色譜泵1、液相色譜泵2、稀釋液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、液相色譜柱1、液相色譜柱2、捕集柱、十通閥、八通閥、六通閥、和檢測(cè)器。

主要包括代謝組組份轉(zhuǎn)移、代謝組組份分離、脂質(zhì)組組份分離三個(gè)過(guò)程。初始時(shí)，八通閥的3號(hào)位與4號(hào)位相連，十通閥的15號(hào)位與16號(hào)位相連，六通閥的28號(hào)位與33號(hào)位相連；液相色譜泵1的輸出端經(jīng)過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器與八通閥的3號(hào)位相連，八通閥的4號(hào)位通過(guò)管線與十通閥的15號(hào)位相連，十通閥的16號(hào)位與捕集柱的輸入端相連，捕集柱的輸出端與十通閥的19號(hào)位相連，十通閥的20號(hào)位通過(guò)管線與八通閥的9號(hào)位相連，八通閥的10號(hào)位與液相色譜柱1的輸入端相連，液相色譜柱1的輸出端與六通閥的28號(hào)位相連，六通閥的33號(hào)位與檢測(cè)器相連；液相色譜泵2與八通閥的5號(hào)位相連，八通閥的6號(hào)位和7號(hào)位通過(guò)管線相連，8號(hào)位與色譜柱2的輸入端相連，色譜柱2的輸出端與六通閥的32號(hào)位相連，六通閥的30號(hào)位與31號(hào)位通過(guò)管線相連，29號(hào)位接入廢液；在該位置，自動(dòng)進(jìn)樣器將復(fù)雜樣品提取液由進(jìn)樣到捕集柱，樣品中的代謝組組份首先流出并轉(zhuǎn)移至液相色譜柱1中。

待代謝組組份從捕集柱完全流出后，控制十通閥切換，液相色譜泵1的輸出端經(jīng)過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器與八通閥的3號(hào)位相連，八通閥的4號(hào)位通過(guò)管線與十通閥的15號(hào)位相連，十通閥的24號(hào)位通過(guò)管線與21號(hào)位相連，十通閥的20號(hào)位通過(guò)管線與八通閥的9號(hào)位相連，八通閥的10號(hào)位與液相色譜柱1的輸入端相連，液相色譜柱1的輸出端與六通閥的28號(hào)位相連，六通閥的33號(hào)位與檢測(cè)器相連；液相色譜泵2控制輸出的流動(dòng)相流路不變；十通閥的22號(hào)位和23號(hào)位堵死；在該位置，實(shí)現(xiàn)代謝組組份在液相色譜柱1中的分離以及液相色譜柱2的平衡。

待代謝組組份在液相色譜柱1中分離完成后，控制十通閥、八通閥、和六通閥同時(shí)切換，液相色譜泵1的輸出端經(jīng)過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器與八通閥的3號(hào)位相連，八通閥的10號(hào)位與液相色譜柱1的輸入端相連，液相色譜柱1的輸出端與六通閥的28號(hào)位相連，六通閥的29號(hào)位接 入廢液；液相色譜泵2與八通閥的5號(hào)位相連，八通閥的4號(hào)位通過(guò)管線與十通閥的15號(hào)位相連，十通閥的16號(hào)位與捕集柱的輸入端相連，捕集柱的輸出端與十通閥的19號(hào)位相連，十通閥的20號(hào)位通過(guò)管線與八通閥的9號(hào)位相連，八通閥的8號(hào)位與液相色譜柱2的輸入端相連，液相色譜柱2的輸出端與六通閥的32號(hào)位相連，六通閥的33號(hào)位與檢測(cè)器相連；在該位置，捕集柱中的脂質(zhì)組組份轉(zhuǎn)移到液相色譜柱2中并進(jìn)行分離，與此同時(shí)，完成液相色譜柱1的平衡。

待脂質(zhì)組組份分離完成后，控制十通閥切換；稀釋液泵與十通閥的17號(hào)位相連，十通閥的16號(hào)位與捕集柱的輸入端相連，捕集柱的輸出端與十通閥的19號(hào)位相連，十通閥的18號(hào)位接入廢液；在該位置，實(shí)現(xiàn)捕集柱中殘留溶劑的替換。

液相色譜柱1和液相色譜柱2分別用于代謝組和脂質(zhì)組組份的分離；捕集柱用于代謝組和脂質(zhì)組組份的轉(zhuǎn)移。

所述液相色譜分析方法用于同時(shí)分析復(fù)雜樣品中的代謝組和脂質(zhì)組組份。

所述的代謝組組份包含除脂類(lèi)以外的小分子代謝物和溶血磷脂類(lèi)代謝物；脂質(zhì)組組份包括除溶血磷脂類(lèi)外的其他脂類(lèi)代謝物。

本發(fā)明最核心的過(guò)程是：復(fù)雜樣品提取物進(jìn)樣后保留在捕集柱上，根據(jù)代謝物性質(zhì)的差異將復(fù)雜樣品中的代謝組和脂質(zhì)組組份分離，通過(guò)控制十通閥的位置分別將代謝組和脂質(zhì)組組份轉(zhuǎn)移到液相色譜柱1和液相色譜柱2上，結(jié)合后續(xù)的高效液相色譜分離系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣同時(shí)分析代謝組和脂質(zhì)組組份。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明方法適用于復(fù)雜樣品中代謝組和脂質(zhì)組組份的同時(shí)分析。與傳統(tǒng)的液相色譜分析方法相比，使用本發(fā)明方法只需一次進(jìn)樣就可實(shí)現(xiàn)代謝組和脂質(zhì)組組份的同時(shí)分析，縮短了分析時(shí)間，提高了分析通量；此外，降低了樣品的使用量，對(duì)珍貴樣品尤其有利；代謝物覆蓋度廣，對(duì)于極性較強(qiáng)的代謝物(如氨基酸)和非極性較強(qiáng)的代謝物(如脂質(zhì))均可得到良好的分離效果；操作簡(jiǎn)便，普適性強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜體系如植物樣品、生物樣品、環(huán)境樣品等的高效分離。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明提供的液相色譜分析方法的裝置圖；

圖2a為本發(fā)明提供的液相色譜分析方法的流路圖之一；

圖2b為本發(fā)明提供的液相色譜分析方法的流路圖之二；

圖2c為本發(fā)明提供的液相色譜分析方法的流路圖之三；

圖2d為本發(fā)明提供的液相色譜分析方法的流路圖之四；

圖1-圖2d中數(shù)字代表：1為液相色譜泵1，2為自動(dòng)進(jìn)樣器，11 為八通閥，3-10為八通閥(11)的接口，12為液相色譜柱1，13為液相色譜柱2，14為液相色譜泵2，25為十通閥，15-24為十通閥(25)的接口，26為捕集柱，27為稀釋液泵，34為六通閥，28-33為六通閥(34)的接口，35為檢測(cè)器。

圖3為本發(fā)明對(duì)血漿樣品提取物進(jìn)行分析的總離子流圖。圖中橫坐標(biāo)為保留時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為響應(yīng)強(qiáng)度。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述。

實(shí)施例1：代謝組脂質(zhì)組組份同時(shí)分析的高效液相色譜方法建立

本發(fā)明方法采用的裝置包括液相色譜泵1、液相色譜泵2、稀釋液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、液相色譜柱1、液相色譜柱2、捕集柱、十通閥、八通閥、六通閥和檢測(cè)器；主要包括代謝組組份轉(zhuǎn)移、代謝組組份分離、脂質(zhì)組組份分離三個(gè)過(guò)程。

第一步，如圖2a所示。初始時(shí)，八通閥11的3號(hào)位與4號(hào)位相連，十通閥25的15號(hào)位與16號(hào)位相連，六通閥34的28號(hào)位與33號(hào)位相連；液相色譜泵1(1)的輸出端經(jīng)過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器2與八通閥11的3號(hào)位相連，八通閥(11)的4號(hào)位通過(guò)管線與十通閥25的15號(hào)位相連，十通閥25的16號(hào)位與捕集柱26的輸入端相連，捕集柱26的輸出端與十通閥25的19號(hào)位相連，十通閥25的20號(hào)位通過(guò)管線與八通閥11的9號(hào)位相連，八通閥11的10號(hào)位與液相色譜柱1(12)的輸入端相連，液相色譜柱1(12)的輸出端與六通閥34的28號(hào)位相連，六通閥34的33號(hào)位與檢測(cè)器相連；液相色譜泵2(14)與八通閥11的5號(hào)位相連，八通閥11的6號(hào)位和7號(hào)位通過(guò)管線相連，8號(hào)位與色譜柱2(13)的輸入端相連，色譜柱2(13)的輸出端與六通閥34的32號(hào)位相連，六通閥34的30號(hào)位與31號(hào)位通過(guò)管線相連，29號(hào)位接入廢液。在圖2a所示過(guò)程，自動(dòng)進(jìn)樣器2將復(fù)雜樣品提取液由進(jìn)樣到捕集柱26，樣品中的代謝組組份首先流出并轉(zhuǎn)移至液相色譜柱1(12)中。

第二步，如圖2b所示，待代謝組組份從捕集柱26完全流出后，控制十通閥25切換，液相色譜泵1(1)的輸出端經(jīng)過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器2與八通閥11的3號(hào)位相連，八通閥11的4號(hào)位通過(guò)管線與十通閥25的15號(hào)位相連，十通閥25的24號(hào)位通過(guò)管線與21號(hào)位相連，十通閥25的20號(hào)位通過(guò)管線與八通閥11的9號(hào)位相連，八通閥11的10號(hào)位與液相色譜柱1(12)的輸入端相連，液相色譜柱1(12)的輸出端與六通閥34的28號(hào)位相連，六通閥34的33號(hào)位與檢測(cè)器相連；液相色譜泵2(14)控制輸出的流動(dòng)相流路不變；十通閥25的22號(hào)位和23號(hào)位堵死。通過(guò)圖2b所示過(guò)程可實(shí)現(xiàn)代謝組組份在色譜柱1(12)中的分離以及液相色譜柱2的平衡。

第三步，如圖2c所示，待代謝組組份在液相色譜柱1(12)中分離完成后，控制十通閥25、八通閥11、和六通閥34同時(shí)切換，液相色譜泵1(1)的輸出端經(jīng)過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器2與八通閥11的3號(hào)位相連，八通閥11的10號(hào)位與液相色譜柱1(12)的輸入端相連，液相色譜柱1(12)的輸出端與六通閥34的28號(hào)位相連，六通閥34的29號(hào)位接入廢液；液相色譜泵2(14)與八通閥11的5號(hào)位相連，八通閥11的4號(hào)位通過(guò)管線與十通閥25的15號(hào)位相連，十通閥25的16號(hào)位與捕集柱26的輸入端相連，捕集柱26的輸出端與十通閥25的19號(hào)位相連，十通閥25的20號(hào)位通過(guò)管線與八通閥11的9號(hào)位相連，八通閥11的8號(hào)位與液相色譜柱2(13)的輸入端相連，液相色譜柱2(13)的輸出端與六通閥34的32號(hào)位相連，六通閥34的33號(hào)位與檢測(cè)器相連。在圖2c所示過(guò)程，捕集柱26中的脂質(zhì)組組份的轉(zhuǎn)移到液相色譜柱2(13)中并進(jìn)行分離，與此同時(shí)，完成液相色譜柱1(12)的平衡。

第四步，如圖2d所示，待脂質(zhì)組組份分離完成后，控制十通閥25切換；稀釋液泵27與十通閥25的17號(hào)位相連，十通閥25的16號(hào)位與捕集柱26的輸入端相連，捕集柱26的輸出端與十通閥25的19號(hào)位相連，十通閥25的18號(hào)位接入廢液。通過(guò)圖2d所示過(guò)程可實(shí)現(xiàn)捕集柱26中殘留流動(dòng)相的替換。

在本實(shí)施例中，液相色譜泵1為兩個(gè)高效液相色譜單元泵，液相色譜泵2為兩個(gè)超高效液相色譜單元泵，稀釋液泵為一個(gè)高效液相色譜單元泵，檢測(cè)器為質(zhì)譜檢測(cè)器。通過(guò)圖2a-2d過(guò)程，便實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜樣品中代謝組和脂質(zhì)組組份的同時(shí)分析。

實(shí)施例2：復(fù)雜樣品體系分離

樣品：血漿提取物

具體提取過(guò)程如下：準(zhǔn)確移取50μl血漿與eppendorf管中，加入200μl甲醇，渦旋1分鐘后加入50μl異丙醇，渦旋1分鐘；12℃下以14000rpm的速度離心15分鐘；取250μl上層清液真空冷凍干燥。進(jìn)樣前使用50μl50％異丙醇復(fù)溶；進(jìn)樣量為5μl。

代謝組組分離色譜參數(shù)：液相色譜柱1：c18柱(1.7μm，2.1×50mm)。流動(dòng)相a1為含有體積分?jǐn)?shù)0.1％甲酸的水溶液，流動(dòng)相b1為含有體積分?jǐn)?shù)0.1％甲酸的乙腈溶液。流速0.35ml/min。柱溫為50℃。

脂質(zhì)組組分離色譜參數(shù)：液相色譜柱2：t3柱(1.7μm，2.1×50mm)。流動(dòng)相a2為含有10mm乙酸銨的乙腈/水溶液(乙腈/水＝40/60，v/v)，流動(dòng)相b2為含有10mm乙酸銨的異丙醇/乙腈溶液(異丙醇/乙腈＝90/10，v/v)。流速0.3ml/min。柱溫為50℃。

捕集柱參數(shù)：c8柱(1.7μm，2.1×5mm)。稀釋液為純水。

本實(shí)施例中，根據(jù)捕集柱優(yōu)化結(jié)果，設(shè)定十通閥(25)由圖2a切 換至圖2b的時(shí)間為7.5min。在0min到29min時(shí)間范圍內(nèi)，設(shè)定稀釋液流速為0，29min到30min，設(shè)定稀釋液流速為0.4ml/min。具體梯度條件如下表所示：

使用本發(fā)明方法分析血漿樣品提取物，在上述液相色譜條件下，質(zhì)譜采集的總離子流圖如附圖3所示。