本發(fā)明提供從主要有機物質但不排除無機物質以及從該物質中的化學、生物化學或生物反應、相互作用、途徑或序列中檢測、監(jiān)測、成像和檢索數(shù)據(jù)的方法和設備。特別地，本發(fā)明提供以高吞吐量和例如在活細胞中、在活組織中和在含有機物質的溶液中的每個樣本的較低成本以在三維中的高空間分辨率來研究所述物質的方法和裝備。特別針對的另一個應用是監(jiān)測活細胞或溶液中dna和rna相關的活性的可能性。

背景

存在用于對生物樣本成像的太多的方法和設備。主要地，這些是由marvinminsky在十九世紀五十年代后期獲得專利的共聚焦顯微鏡的變型。共聚焦顯微鏡的普及性是由于其切片能力，其實現(xiàn)了比常規(guī)寬視場顯微鏡可以實現(xiàn)的三維上的相對高的分辨率和更好的對比度。通常，共聚焦顯微鏡與熒光光譜結合，其中特定的顆粒，例如，蛋白質，用熒光團標記，并因此可以從背景中辨別。

在大多數(shù)共聚焦顯微鏡中，相同的光學器件(至少相同的物鏡)用于照明/激發(fā)和用于觀察/檢測來自所研究的樣本的光。這種配置的優(yōu)點在于其模擬經(jīng)典寬視場顯微鏡的設計，并因此可以使用或多或少的相同光學部件。另一個優(yōu)點是照明和檢測自動對準。另外的優(yōu)點是通過用垂直于樣本表面的視場軸線照明和觀察，n.a可以是大的，而不會遇到諸如全反射的問題。

然而，常規(guī)共聚焦顯微鏡的這種幾何結構引入限制可以被處理的應用的頻譜的弱點和權衡。

在共聚焦顯微鏡中，通過限制允許所發(fā)射的光到達檢測器的體積(觀察體積)來獲得分辨率，即兩個可區(qū)分的輻射點之間的距離。限制觀察體積通過組合兩種方法來實現(xiàn)：(i)在與顯微鏡的照明(或等效的視場)軸線正交的維度中，觀察體積的延伸由物鏡的焦平面中的聚焦寬度確定；以及(ii)在沿著物鏡的照明軸線(視場軸線)的維度中，觀察體積由放置在檢測器前面的光學共軛平面中的針孔的寬度確定。該針孔做得足夠小以阻擋從沿著照明軸線的方向距焦平面一定距離之外的點發(fā)出的所有光。這樣，通過選擇具有非常小的聚焦寬度和小且正確定位的針孔的物鏡，可以獲得所有三維的非常高的分辨率。使用針孔的另一個優(yōu)點是它增強了對比度，因為從位于觀察體積之外的樣本的被照射部分發(fā)出的散射光或熒光不會到達檢測器。

盡管如此，在實踐中，這意味著幾種權衡：

首先，聚焦寬度由物鏡的數(shù)值孔徑(n.a.)確定。因此，希望具有真正高的n.a.以獲得高分辨率。然而，對于具有長工作距離(以能夠穿透樣本的整個深度)和在寬光譜內(nèi)工作的高n.a.物鏡，補償出射光和檢測光的色差(在熒光光譜中這可以是幾百納米)是非常昂貴的。

其次，用于濾出從焦平面之外發(fā)出的光的針孔使得不可能在當時對在焦平面中的多于一個點進行成像。因此，為了獲得圖像，必須使樣本和觀察體積相對于彼此移動(掃描)。圖像是逐點合成的，并且1024×1024幀可能花費超過一秒鐘來獲取。這使得并行化成像并從而實現(xiàn)高吞吐量的可能性復雜化。

如上所述，常規(guī)共聚焦顯微鏡中的觀察體積通過將小聚焦寬度與針孔技術組合來確定。在三維空間中創(chuàng)建觀察體積的另一種方法是使用所謂的共聚焦θ顯微鏡，參見stelzer，ehk等人的“fundamentalreductionintheobservationvolumeinfar-fieldlightmicroscopybydetectionorthogonaltotheilluminationaxis:confocalthetamicroscopy”，optcommun.111,536-547,(1994)。在該技術中，通過使用兩個物鏡來代替地確定觀察體積，兩個物鏡被放置成使得它們的視場的軸線正交并且使得它們的焦平面相交。因此，觀察體積由一個檢測器在一個方向上的聚焦寬度和第二檢測器在正交的第二方向上的聚焦寬度來限制。在這種情況下的照明可以是任意的，只要它照亮感興趣的觀察體積即可。

從觀察體積的角度來看，θ共聚焦顯微鏡消除了對針孔的需要。然而，從對比度的角度來看，需要針孔來抑制從到達任一個檢測器的觀察體積之外發(fā)出的光。

由于共聚焦顯微鏡基本上是逐點測量設備，通過相對于由顯微鏡的物鏡和檢測器前方的針孔限定的觀察體積移動包含研究中的任何樣本的樣本體積并且測量每個點的強度值來形成樣本的圖像。該動作繼續(xù)，直到已經(jīng)獲取整個二維(x-y)圖像，過程可被重復以隨時間生成一系列圖像?？蛇x地，觀察體積也可沿著顯微鏡軸線步進以獲取光學截面的三維(x、y和z)圖像堆疊。利用這個值的向量，三維圖像可被合成并通常在屏幕上以層析成像(tomographically)的方式被顯示。

在共聚焦顯微鏡的早先的版本中，樣本被放置在高精度平移臺上，該高精度平移臺在三維中系統(tǒng)地移動樣本，直到生成圖像向量。為了產(chǎn)生高幀率，樣本必須沿著其預編程路徑高速移動，同時保持亞微米精度。由于樣本保持器和臺的質量的高的加速度，因此這是挑戰(zhàn)性且昂貴的任務?？缭酱竺娣e保持聚焦也是困難的，并且已經(jīng)為此目的實現(xiàn)了相比較而言復雜的自動聚焦系統(tǒng)。

gratton等人(專利號us7974294)已經(jīng)提出另一解決方案來將樣本體積移動穿過觀察體積。代替使x-y-z平移臺圍繞樣本體積移動，樣本被放置在旋轉的容器中。因此，非常大的樣本體積可以以最小所需的加速度通過共聚焦顯微鏡的觀察體積。當處于穩(wěn)態(tài)時，只有旋轉臺的摩擦力需要被克服，并且容器還可在其他方向上緩慢移動，以訪問樣本體積的所有部分。然而，這種設置不旨在成像，而是旨在光譜測量。

獲得高幀率的另一方法是激光掃描共聚焦顯微鏡。代替移動樣品，激發(fā)光束被擴展并且被引導到一對振蕩電流計掃描鏡，所述振蕩電流計掃描鏡光柵掃描穿過樣本體積的聚焦光束。來自樣本的光通過相同的鏡組被去掃描，并在到達檢測器之前通過共軛(共焦)針孔。掃描速度被最快的鏡子的機械規(guī)格限制，該最快的鏡子通常以每圖像點(有時稱為像素或三維空間中的體素)約4至5微秒的速率掃描。因此，對于在單一秒內(nèi)收集的512x512像素圖像，掃描點在每個像素上停留大約4微秒。此外，由于以下事實：鏡子將必須被快速地加速，保持在恒定速度同時掃描整個場，接著快速地減速并且行進的方向被反轉，對于每個掃描線重復該循環(huán)，獲得更高的速率是非常困難的，即使不是不可能的。

盡管掃描速度的限制可通過采用諧振掃描方案來改進，但是這種高速采集遭受另一個問題：所謂的停留時間變得非常短。停留時間在此被定義為樣本(樣品)的相同部分在觀察體積的被照射部分內(nèi)“停留”的時間。尤其是如果涉及熒光成像，則快速掃描共聚焦顯微鏡可能遭受不充足的信噪比。

用于快速掃描樣本的另一可選方案是(nipkow)旋轉盤方法。該共聚焦顯微鏡是基于圓形旋轉的盤，該盤具有以螺旋圖案布置的一個或多個針孔陣列，該螺旋圖案被設計成在盤的一個旋轉期間覆蓋樣本體積。由于除了旋轉盤之外不需要加速，因此這個配置在穩(wěn)定狀態(tài)下在機械上是非常穩(wěn)定的。這個方法的另一個優(yōu)點是不管旋轉盤的針孔，幾個點(像素)可以被并行觀看。通過使用超出每秒1000幀的這種技術，已經(jīng)實現(xiàn)了結合高速和并行化非常高的幀率的能力。然而，旋轉盤共聚焦顯微鏡不是沒有它們的偽像。一個局限是從焦平面的外面散射或發(fā)射的光可通過行進穿過鄰近的針孔到達檢測器，所謂的針孔串擾。第二局限是穿過盤的針孔的光的低百分比(通常小于10％)。剩余的光被反射并且可以作為檢測器中的背景噪聲呈現(xiàn)。這兩個副作用都限制信噪比。也許最大的缺點是這種儀器的復雜性，這使得基于這種方法的儀器的成本在許多應用中是過高的。

因此，雖然現(xiàn)有技術已經(jīng)采取了改進用于微成像的裝置的步驟，但是在以商業(yè)上可行的成本達到高分辨率和高吞吐量中仍然存在相當大的困難。

概述

因此，本發(fā)明的重要目標是，利用三維中的高幀率和高空間分辨率，以允許基于本發(fā)明的方法和設備完成從資金充足的研究實驗室到例如點護理應用中的更廣泛的使用的轉換的成本水平，實現(xiàn)主要對微生物相關物質的研究、測試等。

根據(jù)本發(fā)明，上面的目標通過將樣本體積如何通過觀察體積被傳輸和所述觀察體積如何被限定以及從觀察體積發(fā)射或散射的光如何被檢測的新穎的組合來滿足。

首先，在本發(fā)明的實施方式中，觀察體積以類似于θ共聚焦顯微鏡的方式限定，但是具有非常重要的差異：觀察體積由照明/出射光的聚焦寬度和檢測裝置的物鏡的視場的聚焦寬度來確定。照明/出射光的焦平面和物鏡的焦平面是相交的，并且照明/激發(fā)光的軸線和物鏡的軸線被選擇為優(yōu)選地正交但是至少明顯地不平行。這種配置消除了對針孔的需要，因為檢測器僅接收來自檢測裝置的視場的被照射的區(qū)段的光。在檢測器前方?jīng)]有針孔的情況下，觀察當時在由照明/激發(fā)裝置照明的平面中的幾個點是可能的。在優(yōu)選的實施方式中，照明裝置的光學器件被選擇，使得照明是線聚焦的，從而形成具有法向量的照射平面，該法向量優(yōu)選地平行于檢測裝置的視場的軸線。以這種方式，檢測裝置可被設計成使得其并行地觀察照明平面中的許多個點(像素或三維空間中的體素)。這對應于常規(guī)共聚焦顯微鏡中的x-y幀。

其次，調查研究中的樣本或樣品被放置在樣本容器中，該樣本容器附接到樣本容器保持裝置或與樣本容器保持裝置集成，樣本容器保持裝置接著耦合到旋轉生成裝置，使得樣本旋轉并使樣本通過根據(jù)上面的段落定義的觀察體積。這類似于由gratton等人、spaulding、harufumi(us4940332a)提出的旋轉樣本保持器，但是本發(fā)明的方法和設備在很多其它方面不同。除了將樣本傳遞通過觀察體積外，樣本體積的旋轉的另一個非常重要的功能是使樣本受到足夠的離心力，以將固定在機械平衡中的樣本保持緊靠樣本保持器中的內(nèi)表面。

第三，物鏡的視場的軸線和樣本體積的運動向量(由于旋轉)被選擇為非垂直的，優(yōu)選地，它們具有45度角。如果檢測裝置包括用于觀看被照射的體素的平面的裝置，如上面所提到的，樣本體積的運動將使樣本移動通過體素的平面并且根據(jù)時間將樣本進行分段以使能夠產(chǎn)生圖像堆疊。這對應于早先描述的常規(guī)顯微鏡中的z方向上的步進。

因此，本發(fā)明提供根據(jù)權利要求1所述的設備以及根據(jù)權利要求10所述的方法。本發(fā)明優(yōu)選的實施方式被概括在從屬權利要求中。

附圖簡述

在下面跟隨的詳細描述中，將對附圖進行參考，其中

圖1示意性地示出根據(jù)本發(fā)明的實施方式的裝置的一般設置；

圖2示意性地示出用于探測樣本的發(fā)明性布置的放大視圖；以及

圖3示意性地圖示根據(jù)本發(fā)明的照明和檢測如何協(xié)作地限定觀察體積。

詳細描述

如上面所概括的，通過旋轉的方式使得樣本通過觀察體積。這個布置用于實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的實施方式的幾個便利的特性。一旦樣本容器達到期望的轉速并且該速率保持恒定，那么作用于樣本的僅有的力是離心力和由樣本容器的內(nèi)壁作用于樣本的法向力。樣本還可通過化學結合或粘附保持到樣本容器，使得不需要蓋子。因此，樣本在受控位置中被保持在機械平衡的狀態(tài)中。此外，旋轉作為運動的方式在精度方面是有利的，并且有助于達到本發(fā)明的全部潛力。通過使用現(xiàn)有技術的空氣軸承技術并通過仔細平衡樣本保持和樣本容納裝置，可以實現(xiàn)樣本的足夠受控的軌跡。在穩(wěn)態(tài)下，即在恒定轉速處，在通過觀察體積時樣本容器保持裝置的位置可以被很好地控制在單個體素的尺寸內(nèi)，即，大約為所檢測的光的波長的一半。

圖1示意性地示出根據(jù)本發(fā)明的設置，其中，樣本被設置在可旋轉的樣本容器保持器上的樣本容器中。在圖1中，保持器10被示出為空心圓柱體，樣本12存在于該空心圓柱體上。圓柱形蓋子14被放置在保持器上方以限定樣本容器，而由于離心力確保樣本在與蓋子14相對的位置保持穩(wěn)定，所以樣本在旋轉期間被保持在適當位置。在圖中，樣本被示出為小的圓圈12，并且為了不使該圖過于復雜，僅示出了一些樣本；然而，應理解，樣本容器保持器的整個外圍一般將或可能被樣本占據(jù)。為了探測樣本，提供了照明裝置16和檢測裝置18。照明裝置16優(yōu)選地可以是一個或多個激光器，諸如二極管激光器。檢測裝置18優(yōu)選地可以是單光子計數(shù)檢測器。

在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，樣本容器保持裝置的旋轉通過以下裝置實現(xiàn)：旋轉生成裝置，通常是電氣無刷直流電動機，將其轉子軸的角動量優(yōu)選地通過感應力傳輸?shù)綐颖救萜鞅３盅b置，使所述樣本容器保持裝置以相同的速率旋轉。樣本容器保持裝置，優(yōu)選地由諸如鋁或鋼的金屬或可能由塑料材料制成，理想地是空心或實心圓柱體，即管或桿。為了使能平滑且精確的旋轉，優(yōu)選的是，所述樣本容器保持裝置被設計和制造為使得它圍繞軸線沿著其長度是對稱的，并且使得質量在從軸線開始的所有徑向方向上被均勻分布。還為了保證圍繞其軸線的平滑且可重復的旋轉，旋轉的樣本容器保持裝置通過軸承優(yōu)選地為空氣軸承或電動力軸承被保持在適當位置，以實現(xiàn)無接觸懸架，所述軸承被組裝在所述旋轉的樣本容器保持裝置和內(nèi)部或外部的固定零件之間。樣本容器保持裝置的一部分延伸到零件的外部，使得對于樣本容器的手動或自動附件同樣是可接入的。

樣本容器可以以多種方式設計。然而，為了有利于本發(fā)明的目的，樣本容器在理想情況下應該容易地與樣本容器保持裝置附接、以不顯著地偏移組合的樣本容器保持裝置和樣本容器的重心的方式成型、是光學透明的、在化學上是惰性的、提供對樣本或樣品的保護以及與工業(yè)的測定的標準程序兼容。

在下文中，一般將參考圖2。在本發(fā)明的一個實施方式中，樣本容器包括具有非常高的平坦度的玻璃、聚合物或二氧化硅的板狀裝置24。所述板狀裝置的厚度被選擇為使得在沒有冒著斷裂的危險的情況下它可以彎曲到與樣本容器保持裝置的至少一部分的外表面相同的半徑。板狀裝置24的一側可以配備有能夠裝配樣本或樣品25的阱、凹槽、脊或類似物的圖案。在所述板狀裝置24上，優(yōu)選惰性聚合物的光學透明薄板或膜22作為蓋子附接在板狀裝置的圖案化側上，以封閉和保護已經(jīng)放在同一側上的樣本或樣品25。蓋子的另一個功能是用作最外層，當樣本由于旋轉的離心力被向外推動時在樣本上提供法向力。聚合物蓋的第三功能是使樣本或樣品與樣本保持裝置之間的反射最小化。在優(yōu)選實施方式中，蓋子由折射率接近水的折射率(n≈1.33)的材料制成，例如，cytop。

本發(fā)明的目的是獲得高空間分辨率，以便能夠研究非常細微的細節(jié)。在上面概括的實施方式中，兩個因素決定了空間分辨率。在物鏡的焦平面的維度中，該透鏡的分辨能力決定了理論分辨率。分辨能力又根據(jù)r.p.＝λ/2na由數(shù)值孔徑和光波長確定。只要檢測裝置能夠區(qū)分這兩個點，這也將是實際的分辨能力。在由照明限定的維度中，如果源是諸如單模激光器或單模光纖的點源，則相同的公式成立。因此，體素的最小體積大致由分辨能力的三次方確定。

從上面明顯的是，需要照明裝置26和檢測裝置28兩者的大數(shù)值孔徑以獲得高分辨率成像。大n.a的另一個優(yōu)點是它增加了檢測裝置28捕獲從調查研究中的樣本25散射或發(fā)射的光的能力?？紤]到可能需要被檢測的低水平的光，特別是在熒光光譜學應用中，這是至關重要的。然而，高n.a引入了挑戰(zhàn)，因為這必需的是從照明裝置26進入樣本體積25的光和從樣本體積25散射或發(fā)射的光需要能夠以相對于旋轉的樣本保持器的表面的法向量的大角度處這樣做。這意味著，除非耦合以某種方式減輕，否則光將由于反射而損失。

在本發(fā)明的一個實施方式中，裝置因此被引入以便于以大角度將到達樣本容器和來自樣本容器的光耦合。這通過放置與旋轉的樣本容器保持裝置光學接觸的至少一個耦合裝置來完成。耦合裝置通常不與樣本容器保持裝置一起旋轉，而是優(yōu)選地固定到檢測裝置和/或照明裝置。通過光學接觸，在這方面意味著，耦合裝置的表面或者足夠接近樣本容器的表面，以允許光在耦合裝置和樣本容器之間的短暫耦合，或其折射率至少與樣本的折射率一樣高(即，大約水的折射率)的足夠量的液體被維持在樣本容器和耦合裝置之間并與樣本容器和耦合裝置接觸。在耦合裝置的相對側上，表面被設計為大體凸起或者作為棱鏡，使得光以盡可能靠近表面的法向量的方式通過該表面。在優(yōu)選實施方式中，該耦合裝置包括半球形耦合棱鏡23。球形允許光在任何方向上進入棱鏡，并因此檢測裝置28和照明裝置26可以隨意放置。棱鏡23的內(nèi)部充滿流體，優(yōu)選是微咸水。半球的平面23a在樣本容器保持裝置旋轉通過耦合裝置的同時相對于樣本容器保持裝置滑動。在棱鏡23的底部，孔23b允許流體從半球內(nèi)部受控地泄漏。來自半球內(nèi)部的流體將用作潤滑劑以減少耦合裝置和樣本容器保持裝置之間的摩擦，同時實現(xiàn)光學接觸。孔被制成足夠大以便來自照明裝置的光進入，并且便于由檢測裝置看到的光通過液體部分。

現(xiàn)在將參考圖3。本發(fā)明的另一個目的是降低裝置的總成本，并且在這方面有利的是選擇二極管激光器32作為照明裝置中的源。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，照明裝置包括具有相關聯(lián)的驅動器和脈沖發(fā)生器的大功率二極管激光器，以及被設計為生成線聚焦的聚焦裝置34。線聚焦用于照射優(yōu)選地垂直于檢測裝置37的視場的軸線并與相同檢測裝置的焦平面相交的平面。當這些條件滿足時，檢測裝置37的焦平面與照明平面重合以限定觀察平面35。這意味著最大數(shù)量的體素(在圖中示為觀察平面35的“盒”)在最佳條件下被照射和觀察。為了簡化的目的，將該平面定義為觀察平面。線聚焦優(yōu)選地使用圓柱形透鏡或光纖34來實現(xiàn)。為了不使圖過于復雜，并從而有降低其可理解性的風險，僅包括用于檢測裝置/觀察平面中的一個的虛線軌跡線以及僅部分地用于照明裝置。

如上所述，從成本的角度來看，二極管激光器是優(yōu)選的。然而，二極管激光器從空間相干性的觀點來看不是理想的。特別是具有高輸出功率的那些二極管激光器通常是空間多模的，并且這將影響由照明限定的維度中的可能的分辨率。在本發(fā)明的另一個實施方式中，第二檢測裝置37a被引入，其具有優(yōu)選地垂直但至少顯著不平行于第一檢測裝置的軸線的視場軸線。此外，第二照明裝置32a被引入，優(yōu)選地使用圓柱形透鏡或光纖34a而具有線聚焦。所述第二照明/出射光的焦平面和物鏡的焦平面是相交的，且所述第二照明/激發(fā)光的軸線和所述第二檢測裝置的軸線被優(yōu)選地選擇為正交但是至少明顯地不平行。這實現(xiàn)了一種配置，其中，由于樣本的運動(由圖3中的向左箭頭示意性地示出)，樣本39中的相同體積將首先通過由第一檢測裝置37和第一照明裝置32、34限定的觀察平面35，并然后在稍后的時間點通過由第二檢測裝置37a和第二照明裝置32a、34a限定的觀察平面35a。通過使由所述兩個觀察平面35和35a生成的圖像相關，由于激光源的多模行為而在一個維度上的位置的不確定性可以通過在該相同維度上的另一個觀察平面的更好的位置精度來補償。因此，該實施方式使得能夠使用低成本激光器，同時仍然獲得接近衍射極限分辨能力。該實施方式的另一個優(yōu)點是，它增加了照明平面的有效面積，因為放寬對窄聚焦寬度的要求能夠實現(xiàn)更大的聚焦深度，從而實現(xiàn)更大的有用照射面積。

在許多應用中，高吞吐量或幀率是非常合乎需要的，例如，在篩查應用中或當研究生物化學反應的動力學時。本發(fā)明為此至少以兩種方式作出貢獻。如上所述，由于本發(fā)明消除對針孔的需求，因此可以并行化對如上所限定的照明平面中的幾個點的檢測，即同時觀看照明平面中的幾個點(檢測來自照明平面中的幾個點的信號)。以每秒體素測量的所得到的吞吐量將是以可并行觀察的體素的數(shù)量測量的并行化程度乘以每秒通過照明平面的體素的數(shù)量。因此，吞吐量可以通過增加旋轉速度或通過增加并行化來增加。

本發(fā)明的一個目標應用是能夠研究活細胞的生物化學。由于活細胞是極其復雜的系統(tǒng)，因此識別特定事件(例如特異性蛋白質-蛋白質相互作用)是非常具有挑戰(zhàn)性的任務。為了使這樣的事件可見，感興趣的蛋白質用熒光團標記，當由另一波長的光激發(fā)時，熒光團發(fā)射特定波長的光。通過使用僅允許特定波長或多個特定波長到達檢測器的濾波器，由顯微鏡產(chǎn)生的圖像由熒光而不是原始激發(fā)光組成。因此，只有標記的蛋白質出現(xiàn)在圖像中。

理想地，熒光團應能夠被激發(fā)并發(fā)出無限次的熒光。不幸的是，熒光團的激發(fā)不總是在發(fā)射期望的熒光時結束。有可能，被激發(fā)的分子反而以黑暗狀態(tài)(例如所謂的三重態(tài))結束，這使得分子不能返回到基態(tài)或者根本上減慢分子向基態(tài)的返回(所謂的光漂白)。到三重態(tài)的轉變也使得分子對其環(huán)境有毒。為了避免光漂白和毒性，因此高度優(yōu)選將熒光團的激發(fā)保持在最小。同時，實際應用中的熒光量通常非常低。這對檢測裝置的光學器件、檢測器和信號處理提出了非常高的要求。在這方面的重要參數(shù)是所謂的停留時間。停留時間被限定為樣本(樣品)的相同部分在被照射的體素內(nèi)“停留”的時間。為了得到高信噪比，期望儀器的停留時間超過熒光團的壽命至少一個數(shù)量級。這樣，在檢測裝置的積分時間期間，熒光團可被激發(fā)并發(fā)出多次熒光。

本發(fā)明使得在最小化光漂白、具有足夠大的停留時間以確保足夠的信噪比和保持高吞吐量之間取得平衡是可能的。由于觀察體積部分地由照明限定，因此熒光團僅在觀察時被激發(fā)。這使光漂白最小化。通過調節(jié)旋轉速度，停留時間可被調節(jié)以獲得良好的信噪比。另外通過增加并行化(由檢測裝置并行觀察的點的數(shù)量)，高吞吐量可以維持在適度的轉速下。

在簡化的描述中，在本發(fā)明的實施方式中使用的檢測裝置包括成像裝置、可選的圖像傳輸裝置、可選的波長濾波裝置、檢測器(這里是檢測光信號并將它們轉換成電信號的裝置的簡稱)、可選的放大裝置以及最后是處理、呈現(xiàn)和存儲與捕獲的圖像相對應的信號的裝置。成像裝置(反射或折射)在圖像平面中產(chǎn)生焦平面的強度分布的圖像。沿著通過成像裝置的路徑，可以引入濾波器以去除不需要的波長?？蛇x的圖像傳輸裝置的一端(其可以是一束光纖)放置在圖像平面中，并將所述平面的強度分布傳送到放置檢測器的圖像傳輸裝置的另一端。在將強度分布轉換為電表示之后，如果必要，這些信號在被處理、顯示或存儲之前被放大。

在檢測裝置的一個實現(xiàn)中，成像裝置包括具有高數(shù)值孔徑的物鏡和在圖像平面中創(chuàng)建觀察平面的強度分布的鏡像的第二透鏡。作為圖像傳輸裝置，光纖束被優(yōu)選地使用。光纖束的前端被放置在圖像平面中并且被布置成使得觀察平面中的每個體素被成像在光纖束中的單個光纖上。優(yōu)選地，使用與其包層相比具有高n.a和大纖芯的光纖，以便使體素之間的串擾最小化并使損失最小化。然后束中的光纖被分離，并且每個光纖被連接到檢測器。在優(yōu)選實施方式中，這些檢測器是以所謂的geiger模式運行的雪崩光電檢測器(apd)，即以高于apd的擊穿電壓的反向電壓操作的apd。這種類型的檢測器的優(yōu)點是其具有非常高的內(nèi)部增益，并因此適合于涉及稀疏光子的應用。

在另一個實施方式中，光纖束的后端在檢測器陣列上成像。這降低了每體素的成本，但是具有以geiger模式操作的apd的檢測器陣列由于暗計數(shù)和后脈沖還不是成熟的技術。

在又一個實施方式中，光纖束中的光纖全部具有不同的長度。然后幾個光纖可以連接到同一單個檢測器，同樣優(yōu)選地處于geiger模式。來自兩個不同的體素的同時發(fā)射的光因此在不同時間到達檢測器。兩個光纖之間的最小允許長度差由檢測器的帶寬和后續(xù)信號處理確定。最小長度差優(yōu)選地被選擇為使得檢測器和相關聯(lián)的信號處理僅能夠在對應于最小長度差的兩個體素之間進行區(qū)分。在該實施方式中，來自照明裝置的激發(fā)光包括以超過任何兩個光纖之間的最長延遲差的時間延遲發(fā)射的短脈沖。該實施方式的優(yōu)點是檢測器的數(shù)量可以被減少而不降低并行化程度，并從而不減少每秒的體素的數(shù)量。這又降低了該方法和設備的成本。

如前所述，在優(yōu)選實施方式中，檢測器是以geiger模式操作的apd。這是一個非常有意識的選擇，并且當熒光標記物用于完成特異性(靈敏度)時尤其有用。在這種應用中，來自體素內(nèi)的熒光團的光子被檢測到的復合可能性相當小。增加這種可能性的方法是增加停留時間，即熒光團停留在照射的體素內(nèi)的時間。這樣，熒光團可以被激發(fā)并且以增加的次數(shù)發(fā)出熒光，并且因此檢測到光子的可能性增加。然而，還如以上所討論的，增加停留時間降低了吞吐量，并且盡管這可以通過增加并行化程度來補償，但是這種方法存在限制。增加停留時間還意味著增加檢測裝置的積分時間，這意味著我們增加包括放大器級的檢測器的暗計數(shù)。事實上，噪聲電平隨積分時間線性增加。在geiger模式中的apd具有非常大的內(nèi)部放大(通常大于10到6的冪)，并且這意味著即使單個光子也能產(chǎn)生強信號。在優(yōu)選實施方式中，停留時間被選擇為約100ns。在這個時間期間一個光子被發(fā)射的可能性約為一。由于當光子將到達時在小于100ns內(nèi)是已知的，所以積分時間僅需要為該量級。因此，積分噪聲將相對較低。在具有1khz的幀率的旋轉盤中，積分時間需要長10000倍，具有低得多的放大、針孔串擾等。因此，在針對高吞吐量和/或低光級優(yōu)化的應用中，使用以在geiger模式下運行的檢測器的形式的用于檢測的裝置的方法是非常有用的。

本發(fā)明的另一目的是在使用該方法或裝置時保持工作流程簡單。樣本的成像通常僅是測定中的許多步驟中的一個步驟。在大多數(shù)測定中，在成像之前，樣本已經(jīng)通過了多種制備程序，例如擴增、沉淀、洗滌等。在工業(yè)應用中，這種測定是使用板、盤、微陣列或一些其它類型的樣本容納裝置，以有效地限制和運輸通過該過程的部分的樣本的自動化程序。所述樣本容器通常包括大量系統(tǒng)排列的阱，以能夠以多種組合測試許多目標(分析物)和試劑。在許多實驗室中，存在滿足測定的自動化的設備的大的安裝基礎，并因此如果在本發(fā)明的實施方式中使用的樣本容器遵守這些標準程序，則是有利的。為此，在本發(fā)明的一個實施方式中，樣本被放置在平面或板狀裝置上，所述裝置由材料或材料的組合構成，并且具有適當?shù)某叽缫宰銐蛉嵝詠砀浇釉谛D生成裝置上，使得其遵循樣本容器保持裝置的曲率或形狀。以這種方式，樣本容器可以在處于平面形式時與標準制備程序兼容，并且然后采取樣本容器保持裝置的形狀以符合本發(fā)明的意圖。

本發(fā)明的另一個顯著優(yōu)點是其從觀察體積中的體素或體素集獲取強度的快照，即現(xiàn)場記錄。與當前現(xiàn)有技術不同，當樣本在觀察體積中時，不需要記錄強度的時間分布。這意味著樣本通過觀察體積的速度可以達到比迄今為止可能的量級高的數(shù)量級。通常，轉速將約為每秒100轉，并且樣本通過觀察體積的速度約為每秒幾米至幾十米。通過以高速(通常為10m/s)移動樣本體積通過觀察體積，與當前現(xiàn)有技術例如常規(guī)共聚焦顯微鏡相比較，本發(fā)明的實施方式因此能夠篩選大的樣本體積。

本發(fā)明的實施方式的另外的優(yōu)點是不需要模式識別算法來接收或分析檢測到的信號。由于每個體素的位置被稱為時間的函數(shù)，并且來自每個體素的光的強度被瞬時檢測，所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)表示已經(jīng)通過觀察體積的整個體積的高分辨率三維圖。

在相同體積可以被觀察到的旋轉的高精度在轉彎之后轉動實現(xiàn)了對細胞中或溶液中的顆粒的運動(至少統(tǒng)計上)的連續(xù)觀察。由于向心力或由于施加的電場，運動可能是預期的隨機行走。關于樣本或樣品的非常重要的信息可以從運動數(shù)據(jù)特別是從運動的缺乏中推斷出。