專利名稱：高吞吐量篩選的板和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于促進實驗和生產環(huán)境中的組織生長的設備和方法，特別地涉及用來容納組織的專用板的使用和在生物學上維持組織的介質的循環(huán)。
背景技術：
高吞吐量篩選典型地需要并行處理典型地在每個板具有24，48，96和384或更多個井的多井板(MWP)中的多批試樣。MWP是可以與現(xiàn)有高吞吐量機械例如與機器人控制吸液管一起使用的標準尺寸。機器人控制吸液管的每個移液站使用具有同時地尋址多個井的一系列吸液管尖頭的吸液頭。雖然當前多井板有效地用于液體試樣的篩選，但是對于篩選需要或喜歡更復雜環(huán)境例如固體支承結構的植物和其他組織，以及與這些組織相關的分泌產物通常無效的。
例如，曾經做試驗通過將植物懸吊到每個井內的液體介質中來在MWP中生長植物。但是，當擱置在液體中時植物組織失去氧氣，實際上在缺氧環(huán)境中“溺死”植物組織。也曾經做其他試驗使用通常更固態(tài)的并且提供可以將植物組織支托在流體上方的襯底的介質，例如凝膠體或濾紙圓盤。雖然這些類型的支托避免溺死植物，但是當養(yǎng)分或介質已經耗盡時它們難以交換和補充。浸入液體介質中的紙橋也已經用作組織支托，并且液體介質稍微容易補充。但是，經驗證明已經顯示紙橋難以在自動系統(tǒng)中管理，并且通常對促進組織生長無效。不用結合任何特殊理論，這可能是因為液體介質不能容易地滲透紙橋(即紙橋僅略微地親水)，以及支托在其上的組織缺少連續(xù)的介質供給。
將新鮮介質供給到植物組織的一種常見方法是將植物組織移至盛有新鮮介質的容器。植物組織的移動是一個相對慢而且勞動密集的過程，因為多個板必須被補充以及為每批植物組織做準備。另外，當植物試樣從井中移走時，有損失或污染組織試樣的威脅。
吸出并移除用過的介質和組織副產物的另一種方法是使用具有多個井、每個井在井的基底具有孔口或端口的化驗板。過濾器放置在每個井的底部以支托組織。用過的介質可以使用真空歧管裝配通過端口從每個井中真空收集。真空歧管裝配的一個實例是由MILLIPORE ofBedford，Massachusetts制造的MultiScreen Vacuum Manifold系統(tǒng)。化驗板擱置在提供真空的歧管上，該歧管抽出介質，介質通過濾波器圓盤、流出井并通過端口，在端口介質被收集到下面的歧管中。雖然化驗板中的濾波器圓盤使介質可以從板中抽出，但是濾波器圓盤難以保持足夠的介質以支持組織維持和生長任意持續(xù)時間。因為井底部的端口對周圍空氣開放，端口可以使介質能夠滲漏或蒸發(fā)，并且也可以提供井的微生物污染的途徑。另外，化驗板的井不能單獨采樣，因為真空歧管同時從所有井中收集介質。
動物以及其他類型生物體的組織也可能需要或者喜歡阻礙多井板和高吞吐量篩選技術的使用的固體支托結構。例如，軟骨細胞的生長可以通過使用仿真活體內環(huán)境的膠原纖維基質來促進。類似于上面所討論的植物組織，軟骨細胞需要以不同間隔補充的新鮮介質的供給來繼續(xù)生存和/或增殖。另外，一些軟骨細胞在膠原纖維基質內增殖并且不能獨立于基質而移動。將細胞移至具有新鮮介質供給的新板需要整個膠原基質的移動，這是一個將組織暴露于污染的相對慢而且效率低的過程。
具有一種多井板使高吞吐量篩選方法可以用于非液體試樣將是有利的。另外，具有一種多井板使高吞吐量篩選方法可以用于要求或者喜歡固體支托結構的組織將是有利的。具有一種多井板其促進組織例如植物組織的生長，而不引起在液體介質中溺死組織或者使組織脫水或被污染的危險，將有更有利的。具有一種多井板其使介質可以容易補充，而不過度干擾包含在井中的組織，也將是有利的。另外，具有采樣少于板中井的總數(shù)而不干擾未采樣的井的能力將是有利的。
發(fā)明概述本發(fā)明通過提供一種用于介質交換的多井板(MWP)和方法來滿足上面的需要并獲得其他優(yōu)點，該多井板和方法通過控制介質到組織的供給并且允許介質的正常交換(移除和增加)而不干擾組織來促進植物組織以及其他類型組織的生長。MWP包括一系列井，每個井與使介質可以使用常規(guī)的自動吸液管頭從井中吸出的相鄰吸出孔相連。因為新的雙井結構，MWP和吸液管頭提供用過介質的實際上完全的更換。容納于每個井內的親水、多孔燒結物支托組織并且將介質保留到其空隙中，允許組織和介質之間的接觸同時避免缺氧情況。介質以充足的量向上吸以將養(yǎng)分提供給組織并促進組織的增殖。
在一種實施方案中，本發(fā)明包括用于容納支托組織的多孔燒結物的板。多孔燒結物(porous frit)浸入到可以例如通過頂加載式吸液管設備定期吸出并更新的介質中。該板包括主體，主體具有定義第一孔和第二孔的頂面。第一孔具有由主體的頂面定義的第一孔上緣和定義在主體內并且在主體的頂面下方的第一孔底部分。第一孔被成形以容納多孔燒結物和組織，以及容納浸浴多孔燒結物和組織的介質。第二孔具有由主體的頂面定義的第二孔上緣和定義在主體內并且在主體的頂面下方的第二孔底部分。第二孔底部分與第一孔底部分流體聯(lián)通，使得吸液管設備可以進入第二孔上緣以通過施加真空來吸出介質。吸液管設備也通過將新鮮介質直接加到每個井中的燒結物上來更新介質。
在另一方面，板的主體還定義以流體聯(lián)通相連接第一孔底部分和第二孔底部分的通道。主體可能還包括突出在第一孔底部分中以將燒結物支托在流體儲蓄器上方的凸緣。主體也可以定義多個第一和第二孔，每個第一孔與第二孔的相應一個流體聯(lián)通，以形成MWP。在另一方面，主體定義一系列第一和第二孔例如12，24，48，96，384或1536個第一和第二孔，其中每個第一孔與第二孔的相應一個流體聯(lián)通。第一和第二孔優(yōu)選地具有圓柱形狀。
在又一方面，主體的頂面被成形以承受放置到其上的蓋板。優(yōu)選地，蓋板是對光透射透明的，并且第一孔上緣也被成形以允許光透射，從而促進植物組織生長。
在另一種實施方案中，本發(fā)明包括一種制造用于容納支托組織的多孔燒結物的板的方法，其中多孔燒結物浸入到介質中。介質通過吸液管設備定期吸出并更新，以促進組織的增殖。該方法包括提供具有頂面的主體和定義主體中的第一和第二孔。定義主體中的第一孔包括鉆通主體的頂面以形成第一孔上緣和鉆到頂面下方以形成第一孔底部分。第二孔通過鉆通主體的頂面以形成第二孔上緣并且鉆到頂面下方以形成第二孔底部分來定義。第一和第二孔底部分通過在主體中在第一孔底部分和第二孔底部分之間形成通道來以流體聯(lián)通相連接。優(yōu)選地，通道通過將鋸盤插入到第一孔底部分中，并且橫向地移動鋸，直到遇到第二孔底部分來形成。
在又一種實施方案中，本發(fā)明包括一種使用MWP的方法。燒結物放置到多個第一孔的每個中，并且組織優(yōu)選地浮萍或其他植物組織放置到燒結物上。介質分發(fā)到多個第一孔的每個中。吸液管插入多個第二孔的每個中，并且用來從第一孔中吸出介質。介質通過使用吸液管將吸出壓力施加到第二孔來吸出。吸出壓力將介質從第一孔中抽出，然后進入第二孔和進入吸液管，以將介質從板中趕出(flush)。在將介質從第二孔中吸出之后，新鮮介質可以再次分發(fā)到多個第一孔中。
在又一種實施方案中，本發(fā)明包括用于支托組織的燒結物材料，其具有多孔結構、頂面和底面。多孔結構具有親水性和許多孔隙。頂面被成形以支托組織。底面與流體介質的儲蓄器流體聯(lián)通。多孔結構的親水性將流體吸到其孔隙中，使得被支撐的組織被供給來自儲蓄器的充足的液體介質，以促進組織的生長。
本發(fā)明具有幾個優(yōu)點，例如當提供的介質耗盡時，井中的組織試樣不必要被移動或擾亂，減少了工作量并保證無菌的和最佳的生長條件。板可以與固定管尖型或單獨可控管尖型常規(guī)液體處理吸液管頭一起使用，因為吸出孔可從主體的頂面到達即頂加載排列。機器人液體機械手(robotic liquid handler)與板一起使用促進了組織處理中井與井的一致性，以及介質的有效移除和更換。頂加載方式使標準罩蓋可以用于無菌控制并且消除對用于抽出介質的單獨真空歧管臺的需要。歧管的缺少允許每個井的差別處理，并且提供液體機械手的設計和選擇，以及實驗模型和試樣詢問功能的靈活性。液體頭被配置以移除介質以及添加新的介質，而不改變工具或吸液管尖頭。
附圖簡述已經大體上這樣描述了本發(fā)明，現(xiàn)在將參考附隨附圖，它們不一定照尺度描繪，并且其中

圖1是本發(fā)明第一實施方案的用于液體介質交換的MWP的俯視圖；圖2是來自圖1的MWP的單井和吸出孔的放大橫斷面視圖；圖3是本發(fā)明另一實施方案的管尖密封的透視圖；圖4是本發(fā)明另一實施方案的用于補充介質到圖1中所示MWP的系統(tǒng)的透視圖；圖5是使用圖4的系統(tǒng)補充介質的方法的流程圖；以及圖6是本發(fā)明另一實施方案中正被機械加工的圖2的井和吸出孔的剖面圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明現(xiàn)在將根據(jù)顯示本發(fā)明優(yōu)選實施方案的附隨附圖在下文更全面地描述。但是本發(fā)明可以以許多不同形式來實施，而不應當看作是局限于這里所陳述的實施方案；相反地，這些實施方案被提供，使得本公開內容全面和完整，并且將充分傳達本發(fā)明的范圍給本領域技術人員。自始至終，相似數(shù)字涉及相似要素。
本發(fā)明的多井板(MWP)10包括具有頂面14的主體12。主體12定義一系列第一孔或井16和一系列第二吸出孔22，如圖1中所示。許多通道28每個將井16的相應一個連接到吸出孔22的相鄰一個，如圖2中所示。在一種實施方案中，多孔親水燒結物30放置在井16的每個中，其將組織試樣32托在液體介質36的儲蓄器上方。燒結物30的多孔親水性將介質36向上吸，以向組織試樣32供給介質。通過吸出孔22來促進舊的、耗盡的介質36的交換，吸出孔22每個被確定尺寸并成形以容納吸液管尖頭34。在吸出的過程中，幾個吸液管尖頭插入吸出孔22并施加真空壓力。真空壓力將流體介質36從井16的每個中抽出，通過通道28，通過吸出孔22的相鄰一個，然后進入吸液管尖頭。
組織試樣32優(yōu)選地是植物組織例如雙子葉植物和單子葉植物組織例如來自谷物(Zea mays)，蕓苔種(例如B.napus，B.rapa，B.juncea)，特別是可用作種子油來源的那些蕓苔種，紫花苜蓿(Medicago sativa)，稻米(Oryza sativa)，黑麥(Secalecereale)，高梁(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)，粟(例如珍珠稗(Pennisetum glaucum)，稷粟(Panicum miliaceum)，谷子(Setaria italica)，龍爪稷(Eleusine coracana))，向日葵(Helianthus annuus)，紅花(Carthamus tinctorius)，小麥(Triticum aestivum)，大豆(Glycine max)，煙草(Nicotianatabacum)，馬鈴薯(Solanum tuberosum)，花生(Arachishypogaea)，棉花(Gossypium barbadense，Gossypium hirsutum)，甘薯(Ipomoea batatus)，木薯(Manihot esculenta)，咖啡(Coffea spp.)，椰子(Cocos nucifera)，菠蘿(Ananascomosus)，柑橘樹(Citrus spp.)，可可(Theobroma cacao)，茶(Camellia sinensis)，香蕉(Musa spp.)，鱷梨(Perseaamericana)，無花果(Ficus casica)，番石榴(Psidiumguajava)，芒果(Mangifera indica)，橄欖(Olea europaea)，番木瓜(Carica papaya)，腰果(Anacardium occidentale)，澳大利亞堅果(Macadamia integrifolia)，巴旦杏(Prunus amygdalus)，甜菜(Beta vulgaris)，甘蔗(Saccharum spp.)，燕麥，大麥，蔬菜，觀賞植物和針葉樹。在一些實施方案中組織是浮萍或裸子植物的胼胝組織。本發(fā)明可能對于以最少流體而生長茂盛的植物組織例如從裸子植物得到的組織特別有效。
MWP 10的主體12優(yōu)選地用可以機械加工并足夠耐熱以在高壓釜中殺菌供再使用的聚碳酸酯塊構成。一般地，聚碳酸酯的硬度使它可以通過計算機控制銑床(CNC)或其他自動加工方法來機械加工成復雜、精確的形狀。主體也可以用其他材料例如聚苯乙烯，聚砜，其他合成材料，金屬，陶瓷，玻璃等來構成。主體12是矩形的，長度為5.03±0.01英寸，寬度為3.365±0.01英寸以及高度為0.813±0.01英寸，外形適合大多數(shù)常規(guī)液體處理機器。主體12包括其他特征例如底板13和在主體一條寬的相對拐角上的一對45°倒棱15。底板13提供凸緣，并且可以用作常規(guī)裝備中的夾緊面或安裝面。該對倒棱15可以用作參考標記，以保證主體的正確定向，尤其是當記住每個井的位置重要時。主體12也具有孔16和22鉆穿的平頂面14。應當注意，雖然主體的尺寸優(yōu)選地被成形以適合預先存在的裝備，主體的尺寸也可以隨意改變。
井16的數(shù)量，尺寸和位置也被設計，以適合預先存在的裝備。例如，板優(yōu)選地具有4乘6陣列的24個井或6乘8陣列的48個井，以適合大多數(shù)液體處理設備。可以使用適合常規(guī)設備的其他井密度例如6個井或96個井。但是，也可以使用非標準的井密度例如單個井或1000個井。一般地，井的數(shù)量由例如主體12的尺寸，生長組織的類型，使用井的裝備的能力和井自身的尺寸等實踐來限制。
優(yōu)選地，對于24個井的板，井16的每個具有直徑為0.62英寸以及深度為0.60±0.01英寸的標準圓柱形狀。每個井的直徑可以隨意改變，并且基于幾個因素例如待放置到井中的組織的初始尺寸，組織的生長速率以及在移除之前組織將在井中繁殖的持續(xù)時間。對于24個井的板，井之間中心到中心距離是0.76英寸，以保證標準自動吸液管設備的排列和移動是適合的。24個井的板已經被發(fā)明者確定特別適合于浮萍胼胝體的組織繁殖，提供組織32的體積和井密度的優(yōu)選平衡。用于浮萍的細胞井16的密度優(yōu)選地是96個井或更少，因為胼胝體的大小和快速的細胞生長。當然，其他方案也可以用于更專用的裝備，如果希望的話。
吸出孔22貫穿主體12的頂面14。24個吸出孔22的每個優(yōu)選地與井16的相應一個相鄰并且與其以流體聯(lián)通相連接。吸出孔22和井16的成對排列使可以吸出而沒有例如使用現(xiàn)有技術的歧管井板所發(fā)生的試樣交叉污染。另外，成對排列使所關心的單獨井16的介質可以選擇性地吸出并更新。單獨井16可以通過手或使單個吸液管的操作可以獨立于頭中其他吸液管的自動裝備來選擇性地尋址。選擇性地尋址井將是有用的，如果例如一個井中的組織對試劑產生強烈的表達響應，例如增加的組織生長，增加的多肽表達，附加的對選用試劑例如除草劑的抗耐性，或者對植物病原體的抗耐性。其他生物化學或生物物理反應也可以用本發(fā)明在單獨井中化驗(檢定分析)。與其他井相比，來自該井的介質可以更頻繁地吸出和試驗。連同其他優(yōu)點，更頻繁地收集和試驗來自該井的介質將提供更強的統(tǒng)計相關。如果不很關心污染，吸出孔22的每個可以與幾個井16配對，以減少吸出重復的次數(shù)。
每個吸出孔22也優(yōu)選地是深度為0.66±0.01英寸以及直徑為0.167英寸的圓柱形，以能夠容納穿過其上緣24的標準尺寸吸液管尖頭34。更大或更小的尺寸以及不同的中心到中心距離也可以使用，依賴于待插入其中的吸液管尖頭的尺寸。當然，其他形狀和其他尺寸也可以改變，以適合專用排列或本領域技術人員已知的其他標準吸液管形狀和長度。圓柱形吸出孔22也是優(yōu)選的，因為它們較容易通過轉動鉆頭來機械加工。相鄰吸出孔22之間的中心到中心距離優(yōu)選地與井16之間的中心到中心距離相同，在24個井的示例實施方案中為0.76英寸。穿過主體12的頂面14以及相同的中心到中心距離的吸出孔布局保證相同的吸液管尖頭外形可以用于介質36的吸出和介質的分散。
通道28的每個以流體聯(lián)通相連接細胞井16和吸出孔22的相應一對，如圖2中所示。通道28的每個由于用來制造通道的優(yōu)選制造方法而優(yōu)選地是大致橢圓形，如將在下文描述的。通道的每個放置在一個井16和吸出孔22的底部下面，也是出于優(yōu)選的制造方法。許多類型的形狀可以用于通道28，因為由吸液管34施加的真空壓力分布將仍然均勻地分布于整個被吸出空氣的細胞井。通道28的每個連同井16和孔22的其相應一個用作還沒有吸入到燒結物30的過剩介質36的儲蓄器。除了提供用于吸出的真空之外，通道28和吸出孔22也可以用來供給介質36。通過通道28和吸出孔22供給介質到井16是有用的，例如如果植物組織32的胼胝體足夠稠密以致相對不能滲透通過井16的上緣而分配進來的介質。優(yōu)選地，每個通道28的寬度小于井16的其相應一個的直徑，以在井的底部形成凸緣29，用于將燒結物30支托在介質36上方。
每個燒結物30優(yōu)選地由燒結的聚乙烯材料構成，該材料是多孔和親水的，以促進其空隙內介質的吸引和保持。燒結物材料的親水性可以是永久的或暫時的，取決于所施加的加工或者材料是否為固有地親水。可以使用具有多孔結構的可選材料，并且表面活性劑可以應用到不是天然親水的材料以使其親水。材料通過燒結來制備并且通過毛細作用吸收溶液，并且由于其曲折路徑特性可以充當無菌阻擋。燒結物優(yōu)選地從具有平均孔徑大小90～130微米的多孔1/4英寸厚聚乙烯片切割并沖孔成與井16大致全等的圓盤形，其中上述聚乙烯片是通常所說的Porous Products of Fairburn，Georgia的Porex，也可以是Small Parts Inc.，Miami Lakes，F(xiàn)L.的Part No.Y2-PEH-250/90。這種燒結物可以容納大約55μl的介質并且供給組織許多天。
燒結物30和井16的其相應一個之間形狀的一致保證燒結物周圍的介質36最小滲漏的吻合，并且也保證燒結物穩(wěn)固地支托在凸緣29上在大部分介質上方。燒結物30的不同厚度可以使用，較厚的燒結物通常容納較多的材料并且較不經常需要用新的介質更新。較大直徑的燒結物可以用于較大直徑的井16，但是可能需要在下方用于額外支托的歧管以防止較大直徑燒結物30在外加真空壓力下壓塌。例如，大直徑燒結物30可以由制造燒結物材料時放置到燒結物材料背后的篩網(wǎng)來支托。盡管可能需要支托歧管，與甚至不能承受在吸出過程中由吸液管尖頭施加的中等真空壓力的類似尺寸的膜或紙支托物相比，燒結物典型地堅固得多。優(yōu)選地，本發(fā)明的燒結物材料應當能夠承受大約30英寸汞柱的壓力。在另一種實施方案中，組織32可以在一塊燒結物材料上生長，然后切割或沖孔成個體燒結物以放置到井16中。
MWP 10優(yōu)選地用一塊具有與主體12大致相同矩形尺寸的聚碳酸酯材料構成。用單塊材料構造板確保防止可能導致試樣交叉污染的井間滲漏。井16和吸出孔22優(yōu)選地使用CNC或其他自動鉆孔機來形成，使用與期望孔尺寸類似尺寸的鉆頭。如果必要的話，鉆孔機也切掉足夠的聚碳酸酯，以形成底板13、底板上的鑲邊(inset)、倒棱15，以及去除足夠材料，以使其他表面例如頂面14變平。通道28優(yōu)選地使用相同銑床上的旋轉鋸條80來形成。旋轉鋸條具有比井16稍微小的切割直徑，并且插入一個井中直到它切到與旋轉鋸條80的厚度相等的深度，如圖6中所示。然后旋轉鋸條向相鄰的一個吸出孔22的方向推進，直到它充分切入吸出孔，以形成具有足夠尺寸的通道28來允許井和吸出孔之間的流體聯(lián)通，如圖2中所示。然后鋸條80移回井的中央并退出井。鋸條的欠尺寸直徑形成支托燒結物30的凸緣29。
如圖2和3中所示，本發(fā)明也可以包括密封35，其環(huán)抱吸液管尖頭34并且當管尖插入一個吸出孔22時放置在吸出孔的上緣24附近。密封35包括剛性套環(huán)51下鄰的彈性材料環(huán)50。剛性套環(huán)優(yōu)選地用剛性材料例如由鋼套筒構成，并且可選地包括穿過其側面的固定螺釘52。上緊固定螺釘即關于吸液管尖頭34上緊套環(huán)，使剛性套環(huán)51可以防止當它壓在吸出孔的上緣24上時彈性材料環(huán)50的向上移動。彈性材料環(huán)50與吸出孔上緣24接觸的一端可以具有大約70°的優(yōu)選角度的截頭圓錐形狀以進一步利于真空密封的形成。更優(yōu)選地，密封35大約直徑為0.3英寸以及長度為0.5英寸，以適合標準吸液管尖頭。例如，具有PTFE(TEFLON)涂層的TECAN吸液管尖頭No.71-700S，內側點直徑為0.5mm，外側點直徑為1.1mm，內側體直徑為1.5mm，以及外側體直徑為2.0mm。
彈性材料環(huán)50也可以通過將其孔徑53的尺寸定為吸液管尖頭最寬外徑的大約90％來成形，以適合任何類型的吸液管尖頭，使密封可以在管尖周圍壓縮而當從吸出孔移走時松弛到其正常形狀。相反地，剛性套環(huán)51具有關于吸液管尖頭34的外徑加大尺寸10％的孔徑，以使它可以容易地容納吸液管尖頭。套環(huán)孔徑當固定螺釘52上緊時減小，以關于吸液管尖頭34固定套環(huán)。在可選實施方案中，密封35也可以與吸液管尖頭34整體模制。在另一種實施方案中，可以在吸出孔的上緣24周圍使用軟密封材料，以緊密地容納管尖而不用密封35。
MWP 10用來通過在無菌環(huán)境中供給養(yǎng)分來促進組織生長和繁殖。使用MWP的方法包括手工地或使用改進成用來分類組織試樣的細胞分類器例如用來分類果蠅的那些分類器來裝填板。一般地，該裝備使用真空來拾取試樣。如果組織試樣足夠小的話，可以使用未改進的細胞分類器。MWP 10優(yōu)選地用透明的聚苯乙烯罩或蓋來覆蓋，以使光可以透射傳輸?shù)浇M織。
一旦組織32處于板的井16中，該板被堆疊，以由包括連接到介質和真空供給的多個吸液管尖頭的液體機械手來訪問。液體機械手緊夾該板并且以本領域技術人員已知的方式移去罩蓋。液體處理設備將每個吸液管尖頭34伸入吸出孔22中的相應一個直到密封35鄰接吸出孔的上緣24和頂面14在那附近的部分。液體處理設備通過管尖將介質分發(fā)到吸出孔22，通過通道28并進入井16。這樣，每個井16中的組織32具有通過燒結物30到介質供給的通路。罩蓋放回到板10上，并且該板放置到具有照明以促進生長的培育室中(在植物組織的情況下)。
在組織耗盡介質36中的基本養(yǎng)分之后或者介質需要替換時，板10裝回到液體處理設備上。罩蓋從板上移走。液體處理設備將每個吸液管尖頭34伸入吸出孔22的相應一個直到密封35鄰接吸出孔的上緣24和頂面14在那附近的部分。液體處理設備通過吸液管尖頭施加真空或吸出壓力，其將介質從細胞井16中抽出，通過通道28，進入吸出孔22，然后進入吸液管尖頭，以完成吸出。通過重復上面過程介質以需要的頻率循環(huán)。
在另一種實施方案中，自動吸液頭(或機器人液體機械手)60用來選擇性地尋址單個或多個井，例如圖4中所示的GENESIS液體機械手(瑞士的TECAN，AG)。機器人以用于在不同的介質，試劑和乙醇供給之間切換的六通閥來升級。機器人在其液體處理臂62上包括八個吸液尖頭61。四個管尖被配置以將介質傳送到支托在其臺面64上的多個多井板63。其余四個管尖每個安裝有管尖密封，使該其余的四個管尖可以通過井的相應的吸出孔22來吸井16。
優(yōu)選地，機器人液體機械手60使用軟件程序來操作，以控制吸液尖頭61的部署，以這樣一種方式使得井16之間的交叉污染達到最小。在介質傳送過程中，四個介質供給管尖的污染通過懸吊介質供給管尖在井上方而不接觸板來避免。吸出尖頭的污染通過在吸出循環(huán)當間用抗菌乙醇液體沖洗每個管尖來避免。管尖和密封的外部在同樣充滿乙醇液體的臺面上淺洗滌臺65中洗滌。乙醇由注射泵和/或高速隔膜(快速洗滌)泵通過六通閥從可到達的貯器來泵送。
編程設計機器人60來訪問正確的孔需要教導機器人吸出孔22和井16的位置。這樣，機器人被操作好像板10具有兩倍的井，因為吸出孔22被放置而與板的井對應所以具有兩倍密度。吸出孔具有比井16小的直徑的事實不重要，因為機器人尋找吸出孔22的中心。例如，機器人被編程來訪問24個井的板，好像該板具有48個井每個井具有與吸出孔直徑相等的直徑。值得注意地，井中心(或它們關于吸出孔的位置)的編程可能顯著地偏離(off)，因為相對于井，吸液管尖頭61直徑小得多。
圖5描繪機器人60如何可以編程來尋址板10的井16和吸出孔22的一個實例。首先，在步驟125，四個介質供給管尖放置到井105～108上方，但不接觸板10，將介質分發(fā)到井中。然后，在步驟126和127，介質供給管尖分別順序地放置到井113～116和121～124上方并且將介質分發(fā)到其中。然后，在步驟128，四個吸出管尖插入吸出孔(機器人將其識別為“井”)101～104，從井105～108中吸出用過的介質。在吸出之后，在步驟129，吸出管尖在洗滌臺65用乙醇來內部沖洗和外部洗凈。在步驟130和131，吸出和清洗輪流到孔109～112，并且在步驟132和133又輪流到吸出孔117～120。應當注意，該過程可以依賴吸液尖頭的數(shù)量和井的數(shù)量而擴展或簡化。另外，該過程優(yōu)選地在HEPA過濾環(huán)境例如在加壓過濾罩中執(zhí)行，以使污染的發(fā)生達到最小。
機器人60也可以連同用于容納和提供光線給幾百個板中的組織的高密度箱或托架一起使用，如在名稱為“用于照明細胞井板的LED陣列和用于處理該陣列的自動托架系統(tǒng)”的共同擁有美國專利申請10/080,918中描述的，其在此引入作為參考。自動托架系統(tǒng)使用它自己的機器人來操作和將板提供給本系統(tǒng)的機器人。
在又一種實施方案中，本發(fā)明的井板和方法可以用來執(zhí)行固相提取。井板的每個井包括夾陷在構成立柱的一對燒結物之間的基體(matrix)。各種化合物(例如配位體或抗體)被強迫通過立柱并被夾陷在基體中。在固相提取之后，試劑可以被強迫通過立柱以使固相瓦解。化合物、試劑等的高吞吐量分發(fā)和回收可以通過自動吸液頭使用井及其相應的吸出孔來處理。
本發(fā)明具有幾個優(yōu)點。例如，井16中的組織試樣32不必要移動或擾亂，減少了工作量，保證無菌和最佳的生長條件。板10可以與常規(guī)液體處理吸液頭一起使用，因為吸出孔22可從主體的頂面到達即頂加載排列。機器人液體機械手與板一起使用促進了組織處理中的井與井的一致性，以及介質36的有效移除和更換。頂加載方式使標準罩蓋可以用于無菌控制，并且取消對用于抽出介質的單獨真空歧管站的需要。歧管的缺少允許每個井的差別處理并且提供液體機械手的設計和選擇的靈活性。液體頭被配置以移除介質和添加新的介質，而不改變工具或吸液管尖頭。
這里所公開的一些圖包含根據(jù)本發(fā)明的方法、系統(tǒng)和程序產品的框圖，流程圖和控制流示例。應當理解框圖、流程圖和控制流示例的每個框或步驟，以及框圖、流程圖和控制流示例中的框的組合可以由計算機程序指令來實現(xiàn)。這些計算機程序指令可以裝載到計算機或其他可編程裝置上以產生這樣一種機器，使得在計算機或其他可編程裝置上執(zhí)行的指令創(chuàng)建用于實現(xiàn)在框圖、流程圖或者控制流框或步驟中指定的功能的方法。這些計算機程序指令也可以存儲在計算機可讀存儲器中，該計算機可讀存儲器可以引導計算機或其他可編程裝置以特定方式來運行，使得存儲在計算機可讀存儲器中的指令產生一件產品，該產品包括實現(xiàn)在框圖、流程圖或者控制流框或步驟中指定功能的指令方法。計算機程序指令也可以裝載到計算機或其他可編程裝置上，以引起將在該計算機或其他可編程裝置上執(zhí)行的一系列操作步驟，以產生計算機實現(xiàn)的過程，使得在該計算機或其他可編程裝置上執(zhí)行的指令提供用于實現(xiàn)在框圖、流程圖或者控制流框或步驟中指定的功能的步驟。
因此框圖、流程圖或控制流示例的框或步驟支持用于執(zhí)行指定功能的方法的組合、用于執(zhí)行指定功能的步驟的組合以及用于執(zhí)行指定功能的程序指令方法。也應當理解，框圖、流程圖或控制流示例的每個框或步驟，以及框圖、流程圖或控制流示例中的框或步驟的組合可以由執(zhí)行指定功能和步驟的基于硬件的專用計算機系統(tǒng)，或者專用硬件和計算機指令的組合來實現(xiàn)。
得益于在前述描述和相關附圖中提供的講授，本發(fā)明的許多修改和其他實施方案將被本發(fā)明所適合的本領域技術人員想到。因此，應當理解本發(fā)明并不局限于所公開的具體實施方案并且修改和其他實施方案將打算包含在附加權利要求的范圍內。例如，在另一種實施方案中，井板和方法也可以用來生長細菌。雖然在這里使用專用術語，它們僅在一般和描述性的意義上使用，而不是為了限制。
權利要求
1.一種用于容納多孔燒結物的板，其中該多孔燒結物支托待浸入介質中的組織，該介質由頂加載吸液管設備定期地吸出和更新，所述板包括具有上表面的主體，所述主體確定第一孔，具有由主體的上表面確定的第一孔上緣和確定在主體內并且在主體的上表面下方的第一孔底部分，所述第一孔被成形以容納多孔燒結物和組織，并且保持浸浴多孔燒結物和組織的介質；凸緣，突出到第一孔底部分中，并且被成形以將燒結物支托在其上；以及第二孔，具有由主體的上表面確定的第二孔上緣和確定在主體內并且在主體的上表面下方的第二孔底部分，第二孔底部分與第一孔底部分以流體聯(lián)通相連接，使得吸液管設備可以通過第二孔上緣訪問第一孔，以通過施加真空來吸出介質以及通過泵入新鮮介質來更新介質，而不將組織和多孔燒結物從板上移走。
2.根據(jù)權利要求1的板，其中主體的頂表面被成形以承受放置到其上的蓋板。
3.根據(jù)權利要求2的板，還包括對光透射透明的蓋板，并且其中第一孔上緣通過具有小于2∶1的高度直徑比來成形以使光透射到包含在第一孔中的組織，使得促進組織的生長。
4.根據(jù)權利要求1的板，其中第二孔具有與預先存在的吸液管尖頭兼容的直徑。
5.根據(jù)權利要求1的板，其中所述主體由單片材料制成。
6.一種用于容納多孔燒結物的板，其中該多孔燒結物支托待浸入介質中的組織，該介質由頂加載吸液管設備定期地吸出和更新，所述板包括由單片材料制成并且具有上表面的主體，所述主體確定第一孔，具有由主體的上表面確定的第一孔上緣和確定在主體內并且在主體的上表面下方的第一孔底部分，所述第一孔被成形以容納多孔燒結物和組織，并且容納浸浴多孔燒結物和組織的介質；以及第二孔，具有由主體的上表面確定的第二孔上緣和確定在主體內并且在主體的上表面下方的第二孔底部分，第二孔底部分與第一孔底部分以流體聯(lián)通相連接，使得吸液管設備可以通過第二孔上緣訪問第一孔，以通過施加真空來吸出介質并且通過泵入新鮮介質來更新介質，而不將組織和多孔燒結物從板上移走。
7.根據(jù)權利要求6的板，其中主體的頂表面被成形以承受放置到其上的蓋板。
8.根據(jù)權利要求7的板，還包括對光透射透明的蓋板，并且其中第一孔上緣通過具有小于2∶1的高度直徑比來成形以使光透射到包含在第一孔中的組織，使得促進組織的生長。
9.根據(jù)權利要求6的板，其中第二孔具有與預先存在的吸液管尖頭兼容的直徑。
10.一種用于支托待浸入到介質中的組織的裝配，其中該介質由頂加載吸液管設備定期地吸出和更新，所述裝配包括多孔燒結物；由單片材料制成并且具有上表面的主體，所述主體確定第一孔，具有由主體的上表面確定的第一孔上緣和確定在主體內并且在主體的上表面下方的第一孔底部分，所述第一孔被成形以容納多孔燒結物和組織，并且保持浸浴多孔燒結物和組織的介質；以及第二孔，具有由主體的上表面確定的第二孔上緣和確定在主體內并且在主體的上表面下方的第二孔底部分，第二孔底部分與第一孔底部分以流體聯(lián)通相連接，使得吸液管設備可以通過第二孔上緣訪問第一孔，以通過施加真空來吸出介質以及通過泵入新鮮介質來更新介質，而不將組織和多孔燒結物從板上移走。
11.根據(jù)權利要求10的裝配，其中所述多孔燒結物由燒結的聚乙烯材料來構成。
12.根據(jù)權利要求11的裝配，其中所述燒結物是親水的。
13.根據(jù)權利要求10的裝配，其中所述燒結物大約0.25英寸厚。
14.根據(jù)權利要求10的裝配，其中所述燒結物具有90～130微米的孔徑大小。
15.根據(jù)權利要求10的裝配，其中所述主體還包括突出到第一孔底部分中并且被成形以將燒結物支托在其上的凸緣。
16.一種用于組織的自動、高吞吐量篩選的裝置，所述裝置包括與介質的供給以流體聯(lián)通相連接的至少一個介質供給管尖；與真空壓力的供給以流體聯(lián)通相連接的至少一個吸出管尖；環(huán)抱該吸出管尖的密封；能夠通過一定范圍的移動來鉸接所述管尖的機器人操縱器；以及位于由機器人操縱器鉸接的管尖的移動范圍內、并且包括具有上表面的主體的至少一個板，所述主體確定第一孔，具有由主體的上表面確定的第一孔上緣和確定在主體內并且在主體的上表面下方的第一孔底部分，所述第一孔被成形以容納組織和通過介質供給管尖而供給的介質，并且保持該介質以浸浴組織；以及第二孔，具有由主體的上表面確定的第二孔上緣和確定在主體內并且在主體的上表面下方的第二孔底部分，第二孔底部分與第一孔底部分以流體聯(lián)通相連接，所述第二孔被成形以容納吸出管尖使得環(huán)抱吸出管尖的所述密封鄰接圍繞上緣的上表面，并且密封以對抗真空壓力的施加，以便通過吸出管尖從第一孔中吸出介質。
17.根據(jù)權利要求16的裝置，其中該管尖密封確定一個通過其中的通道，從而允許該密封包圍吸出管尖。
18.根據(jù)權利要求17的裝置，其中該通道具有吸出管尖最大直徑的至多90％直徑。
19.根據(jù)權利要求17的裝置，其中該管尖密封具有截頭圓錐形狀的端部，該通道軸向地穿過該端部。
20.根據(jù)權利要求19的裝置，其中所述截頭圓錐形狀的端部具有70度的角。
21.根據(jù)權利要求17的裝置，還包括固定在與管尖密封相鄰的管尖的周圍的套環(huán)。
22.根據(jù)權利要求21的裝置，其中所述套環(huán)包括鋼襯套，通過該鋼襯套有一開口，其被確定尺寸以容納管尖。
23.根據(jù)權利要求21的裝置，其中所述套環(huán)還包括固定螺釘，其被成形為通過以摩擦配合而緊鄰管尖來夾陷該管尖。
24.根據(jù)權利要求17的裝置，其中所述密封由硅樹脂材料來構成。
25.根據(jù)權利要求16的裝置，其中該吸出管尖還以流體聯(lián)通而連接到抗菌液體供給。
26.根據(jù)權利要求25的裝置，還包括能夠通過吸出管尖泵送抗菌液體的泵。
27.根據(jù)權利要求25的裝置，其中抗菌液體包括乙醇。
28.一種制造用于保持支撐組織的多孔燒結物的板的方法，其中多孔燒結物和組織浸浴在由吸液管設備定期地吸出和更新的介質中，所述方法包括提供具有上表面的主體；確定在主體中的第一孔，通過鉆通主體的上表面以形成第一孔上緣和鉆上表面下方并進入主體中而形成第一孔底部分；確定在主體中的第二孔，通過鉆通主體的上表面以形成第二孔上緣和鉆上表面下方并進入主體中而形成第二孔底部分；以及通過在主體中和在第一孔底部分與第二孔底部分之間形成通道，來將第一孔底部分連接到第二孔底部分。
29.根據(jù)權利要求28的制造板的方法，其中形成通道包括將鋸插入到第一孔底部分中，并且橫向地移動鋸直到遇到第二孔底部分。
30.根據(jù)權利要求28的制造板的方法，其中該主體由單片材料來確定。
31.一種使用具有一個主體的多井板的方法，其中該主體具有上表面，主體確定多個第一孔和多個第二孔，每個孔具有由上表面確定的上緣，并且每個第一孔與第二孔中的相應一個以流體聯(lián)通相連接，所述方法包括將燒結物放置到多個第一孔的每個中；將組織放置到多個第一孔的每個中并且放置到燒結物上；將介質分發(fā)到多個第一孔的每個中；將吸液管插入到多個第二孔的每個中；以及通過使用吸液管施加吸出壓力到第二孔而將介質從第一孔吸出，吸出壓力將介質從第一孔中抽出，進入到第二孔中并且進入到吸液管中，以從多井板趕出(flush)介質。
32.根據(jù)權利要求31的使用多井板的方法，還包括在從第一孔中吸出介質之后，將介質重新分發(fā)到多個第一孔的每個中。
33.根據(jù)權利要求31的使用多井板的方法，還包括在放置燒結物之前將罩蓋從多井板上移走，以及在吸出介質之后重新放回罩蓋。
34.根據(jù)權利要求31的使用多井板的方法，其中將介質分發(fā)到多個第一孔的每個中包括使用吸液管將介質分發(fā)到第二孔中的相應的各個中。
35.根據(jù)權利要求31的使用多井板的方法，其中所述主體還確定將第一孔的每個以流體穿槽連接到第二孔的相應一個的通道，并且其中所述吸出通過該通道來將介質抽出。
36.根據(jù)權利要求31的使用多井板的方法，其中所述組織包括植物組織。
37.根據(jù)權利要求31的使用多井板的方法，其中所述組織是浮萍組織。
38.一種使用燒結物材料來支托組織供其生長的方法，包括將燒結物材料懸吊在養(yǎng)分供給的上方；通過燒結物材料的多孔、親水結構來吸取養(yǎng)分；以及通過燒結物的頂表面將養(yǎng)分供給到組織，使得組織連續(xù)地被提供養(yǎng)分從而促進組織的生長。
39.根據(jù)權利要求38的方法，還包括在供給養(yǎng)分之前，將多達550μl的養(yǎng)分存儲到燒結物中。
40.一種交換多井板中的流體介質的方法，其中多井板確定多個井，每個井與多個吸出孔的相鄰一個以流體聯(lián)通相連接，該方法包括將多個分發(fā)吸液管尖頭的每個定位到多井板的多個井中的相應一個上；將介質從分發(fā)吸液管尖頭的每個中分發(fā)到分發(fā)吸液管尖頭定位于其上的相應井中；重復定位和從分發(fā)吸液管尖頭中的分發(fā)，直到多井板的所有井被填充；將多個吸出吸液管尖頭的每個插入到多個吸出孔的相應一個中；使用吸出吸液管尖頭的每個來吸出介質，以從吸出管尖定位于其中的相應吸出孔中吸出介質；在洗滌站洗滌吸出吸液管尖頭；以及重復插入，吸出和洗滌，直到多井板的所有井都騰空介質。
41.一種用于控制多井板中的流體介質的交換的計算機程序產品，其中該多井板確定多個井，每個井與多個吸出孔的相鄰一個以流體聯(lián)通相連接，該計算機程序產品包括具有計算機可讀程序代碼部分存儲于其中的計算機可讀存儲介質，該計算機可讀程序代碼部分包括用于將多個分發(fā)吸液管尖頭的每個定位到多井板的多個井的相應一個上的第一可執(zhí)行代碼部分；用于將介質從分發(fā)吸液管尖頭的每個中分發(fā)到分發(fā)吸液管尖頭定位于其上的相應井中的第二可執(zhí)行代碼部分；用于重復定位和從分發(fā)吸液管尖頭的分發(fā)直到多井板的所有井都被填充的第三可執(zhí)行代碼部分；用于將多個吸出吸液管尖頭的每個插入到多個吸出孔的相應一個中的第四可執(zhí)行代碼部分；用于使用吸出吸液管尖頭的每個來吸出介質，以從吸出管尖定位于其中的相應吸出孔中吸出介質的第五可執(zhí)行代碼部分；用于在洗滌臺洗滌吸出吸液管尖頭的第六可執(zhí)行代碼部分；以及用于重復插入、吸出和洗滌直到多井板的所有井都騰空介質的第七可執(zhí)行代碼部分。
42.一種用于保持多孔燒結物的多井板，其中該多孔燒結物支托待浸浴到介質中的組織，介質由頂加載多頭吸液管設備來定期地吸出和更新，所述多井板包括主體，由具有基本上平坦的上表面和下表面的液體不可滲透材料制成；多個井，在所述主體中形成并且排列成列和行的均勻間隔網(wǎng)格，每個井具有在主體上表面處的開口頂端和確定在主體內并且在主體上表面下方的底部分，并且每個井被成形以容納和支托多孔燒結物和組織以及保持浸浴多孔燒結物和組織的介質；吸出孔，在所述主體中形成并與所述井的每個相鄰，吸出孔排列成列和行的均勻間隔網(wǎng)格，并且每個吸出孔具有在主體上表面處的開口頂端和確定在主體內并且在主體上表面下方的底部分；以及通道，在所述主體中形成并提供每個井的底部分和相應相鄰吸出孔的底部分之間的流體聯(lián)通，使得多頭吸液管設備可以同時訪問各個吸出孔，以通過施加真空來吸出介質以及通過泵入新鮮介質來更新介質，而不將組織和多孔燒結物從多孔板移走。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于介質交換的多井板和方法，包括確定多個細胞井的主體，每個細胞井經由通道連接到多個吸出孔的一個。細胞井包括多孔、親水燒結物，燒結物懸置在流體介質的儲蓄器上方的凸緣上并且支托組織試樣。燒結物的特性將流體介質向上吸，以向組織試樣供給用于生長和增殖的養(yǎng)分。舊的介質通過將吸液管尖頭插入吸出孔中的液體處理設備從井中吸出。吸液管尖頭施加吸出壓力，該吸出壓力將介質從細胞井中抽出，通過通道，進入到吸出孔，然后通過吸液管尖頭排出。新的介質通過吸液管尖頭分發(fā)以及直接進入到細胞井。
文檔編號C12N5/04GK1537032SQ02812117
公開日2004年10月13日 申請日期2002年5月29日 優(yōu)先權日2001年5月30日
發(fā)明者基思·埃弗雷特, 基思 埃弗雷特 申請人:比奧萊克斯公司