糖尿病的特征在于血液中異常高水平的葡萄糖。1型糖尿病(IDDM：胰島素依賴(lài)性糖尿病)是由胰島的胰臟β細(xì)胞的破壞引起的，通常導(dǎo)致絕對(duì)胰島素缺乏。2型糖尿病(NIDDM：非胰島素依賴(lài)性糖尿病)的特征在于異常胰島素抗性，其可與胰島素貧乏癥相關(guān)。糖尿病性腎病(DN)是影響糖尿病患者的一種腎小球病變。DN影響約25-40％的1型或2型糖尿病患者，并且是這些患者終末期腎病(ESRD)的主要原因。糖尿病性腎病的特征在于腎小球?yàn)V過(guò)率的改變和尿中蛋白質(zhì)的逐漸異常增加。微量白蛋白尿(尿白蛋白排泄約30-300毫克/24小時(shí))是早期DN的第一個(gè)臨床癥狀，并且已經(jīng)是診斷DN的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試。微量白蛋白尿階段可持續(xù)約10年。然后，尿白蛋白的量增加超過(guò)300毫克/24小時(shí)(大量白蛋白尿)，這表明明顯的DN和ESRD增加的風(fēng)險(xiǎn)。一些研究已經(jīng)使用了差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法來(lái)搜索用于診斷DN的新標(biāo)志物。通常，這樣的研究基于患有DN的糖尿病患者的尿蛋白質(zhì)組與對(duì)照受試者(健康受試者或無(wú)DN的糖尿病患者)的尿蛋白質(zhì)組的比較。Sharma等人的文章(《蛋白質(zhì)組學(xué)》2005，5，2648-2655)使用二維差異凝膠電泳分析(2DDIGE)顯示，與健康受試者相比，患晚期DN且具有大量白蛋白尿的糖尿病患者的尿樣本中的α1抗胰蛋白酶(AAT)增加。在另一項(xiàng)研究(Rao等人，《糖尿病護(hù)理》30：629-637，2007)中，通過(guò)蛋白質(zhì)鑒定相關(guān)的2DDIGE，使用LC-MS/MS，將具有正常白蛋白尿、微量白蛋白尿或大量白蛋白尿的2型糖尿病患者的尿蛋白質(zhì)組和對(duì)照受試者的尿蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較。與正常白蛋白尿糖尿病患者相比，在DN大量白蛋白尿癥患者中發(fā)現(xiàn)7種蛋白質(zhì)以較高的相對(duì)豐度表達(dá)，4種蛋白質(zhì)以較低的相對(duì)豐度表達(dá)。Cho等人(《蛋白質(zhì)組學(xué)的臨床應(yīng)用》2007，1，352-361)通過(guò)雙向凝膠電泳(2D-GE)和ESI-Q-TOFMS/MS測(cè)試了具有正常白蛋白尿和具有微量白蛋白尿的2型糖尿病患者的血清蛋白質(zhì)組。作者鑒定出一組18個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，與正常白蛋白尿相比，在微量白蛋白尿患者中呈下調(diào)或上調(diào)，并且他們建議蛋白質(zhì)DBP(維生素D結(jié)合蛋白)可能是2型DN的診斷標(biāo)志物。在Bellei等人的研究中(《蛋白質(zhì)組學(xué)的臨床應(yīng)用》2008，2，478-491)，通過(guò)2D-GE分離以及隨后進(jìn)行的ESI-Q-TOFMS/MS鑒定，在患有2型糖尿病的正常白蛋白尿患者的尿中和患有DN并且相比健康受試者顯示出微量白蛋白尿的2型糖尿病患者的尿中，可以發(fā)現(xiàn)不同表達(dá)的15種蛋白。Afkarian等人(《分子與細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)》9：2195-2204，2010)在取自健康志愿者的樣本上進(jìn)行基于iTRAQ(同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù))的蛋白質(zhì)組學(xué)方法之前，實(shí)驗(yàn)了冷凍尿樣本處理的不同方案。顯示了在DN大量白蛋白尿患者和沒(méi)有DN的糖尿病正常白蛋白尿患者之間差異表達(dá)的37種蛋白質(zhì)的列表。Jin等人(《實(shí)驗(yàn)糖尿病研究》，第2012卷，文章ID：168602)在正常白蛋白尿和微量白蛋白尿糖尿病患者中使用iTRAQ方法，鑒定出193種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。在通過(guò)蛋白質(zhì)印跡和MRM的選擇和隨后的驗(yàn)證之后，3種蛋白質(zhì)(α1抗胰蛋白酶、α-1酸性糖蛋白1和前列腺干細(xì)胞抗原)被認(rèn)為是DN的良好生物標(biāo)志物。Rossing等人(《美國(guó)腎臟病學(xué)會(huì)雜志》，2008)通過(guò)毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜(CE-MS)分析鑒定了在患有或不患有DN的糖尿病患者的尿中不同表達(dá)的一組生物標(biāo)志物(主要是I型膠原蛋白的片段和尿調(diào)節(jié)素的片段)，并發(fā)現(xiàn)該組生物標(biāo)志物允許區(qū)分患有微量白蛋白尿的糖尿病患者與向明顯DN(即大量白蛋白尿)逐漸發(fā)展的糖尿病患者。因此，這樣的生物標(biāo)志物可以被認(rèn)為是微量白蛋白尿患者是否患DN的預(yù)測(cè)標(biāo)志物。然而，該出版物沒(méi)有提供關(guān)于在正常白蛋白尿患者體內(nèi)預(yù)測(cè)性標(biāo)志物的數(shù)據(jù)。由于在上述研究中鑒定的生物標(biāo)志物僅在那些已經(jīng)顯示出尿白蛋白水平增加的患者體內(nèi)觀察到(即，當(dāng)DN或至少DN的早期階段已經(jīng)形成時(shí)，才觀察到差異表達(dá))，因此，這些生物標(biāo)志物只能引起診斷目的的興趣，具體地確認(rèn)DN的診斷，例如通過(guò)高水平的尿白蛋白的檢測(cè)來(lái)確定。然而，從這些研究中不能得出任何指示，表明這樣的生物標(biāo)志物在正常白蛋白尿患者DN發(fā)病方面的預(yù)測(cè)性價(jià)值。因此，仍然需要提供一種DN的早期預(yù)測(cè)標(biāo)志物，其允許在沒(méi)有顯示任何異常白蛋白尿的糖尿病患者體內(nèi)預(yù)測(cè)DN的發(fā)病。一些先前的實(shí)驗(yàn)方法旨在鑒定DN預(yù)測(cè)的標(biāo)志物：Otu等人(《糖尿病護(hù)理》，第30卷，第3期，2007年3月)研究了10年內(nèi)被隨訪的糖尿病患者的回顧性隊(duì)列。在隨訪期間取自保持正常白蛋白尿的糖尿病正常白蛋白尿患者的尿樣本中的蛋白質(zhì)組與取自后來(lái)患上DN的正常白蛋白尿患者的樣本中的蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較。對(duì)應(yīng)于幾種肽的峰值被鑒定為在兩組中被差異表達(dá)，并且12個(gè)峰值的子集被定義為預(yù)測(cè)性峰值特征，允許DN的預(yù)測(cè)。然而，根據(jù)本發(fā)明人的知識(shí)，相應(yīng)的蛋白質(zhì)沒(méi)有被進(jìn)一步表征，并且確實(shí)沒(méi)有鑒定出預(yù)測(cè)標(biāo)志物。最近，一種使用毛細(xì)管電泳質(zhì)譜(CE-MS)的方法突出顯示了273個(gè)低分子量肽在尿液中的特異性譜，用于糖尿病性腎病的早期診斷(Zürbig等，《糖尿病》，2012)。使用先前產(chǎn)生的慢性腎臟疾病(CKD)生物標(biāo)志物分類(lèi)器(CKD273分類(lèi)器)檢查取自1型和2型糖尿病患者的縱向隊(duì)列的尿樣本，以評(píng)估所收集尿液中肽的DN病征。在患有大量白蛋白尿之前長(zhǎng)達(dá)5年將CKD273分類(lèi)器應(yīng)用于正常白蛋白尿受試者的樣本，與常規(guī)用于確定診斷的尿白蛋白相比，能夠更早檢測(cè)到向大量白蛋白尿的隨后進(jìn)展。雖然文章建議CDK273分類(lèi)器“作為一個(gè)整體”可以允許鑒定將患上DN的正常白蛋白尿患者，但沒(méi)有提示關(guān)于分類(lèi)器的每個(gè)單獨(dú)組分的潛在預(yù)測(cè)價(jià)值(如果有的話)。從上文可以看出，對(duì)于糖尿病患者，尤其是正常白蛋白尿糖尿病患者體內(nèi)的用于DN早期預(yù)測(cè)的單個(gè)標(biāo)志物，仍然存在非常少的數(shù)據(jù)。發(fā)明人能夠在O'Brien等人1995年所描述測(cè)試的基礎(chǔ)上，在認(rèn)為有患上糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)的正常白蛋白尿糖尿病患者體內(nèi)，鑒定出新的DN預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。本發(fā)明確實(shí)依賴(lài)于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即根據(jù)O'Brien測(cè)試被確定為有患上DN風(fēng)險(xiǎn)的患者和根據(jù)O'Brien測(cè)試被確定為沒(méi)有患上DN風(fēng)險(xiǎn)的患者之間可以檢測(cè)出某些蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，并且這種變化與患上糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。因此，本發(fā)明涉及一種用于體外檢測(cè)患有糖尿病且是正常白蛋白尿的受試者患糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括以下步驟：(a1)測(cè)量取自受試者的生物樣本中至少一種選自下組的蛋白質(zhì)的水平：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四連接素、CD59糖蛋白、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑、甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2或其亞型，抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、膠原蛋白α-1(I)鏈、α-烯醇酶、組蛋白H2B1-O型、谷氨酰胺?；沫h(huán)轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)AMBP和鋅-α-2-糖蛋白，以及(b)由步驟(a1)測(cè)得的水平確定所述受試者患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)是否增加。本發(fā)明的另一方面涉及一種用于體外鑒定糖尿病性腎病預(yù)測(cè)標(biāo)志物的方法，所述方法包括以下步驟：(a)確定取自患有糖尿病的受試者的生物樣本中蛋白質(zhì)的水平，所述受試者已經(jīng)被確定有患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)，所述生物樣本在所述受試者進(jìn)行體育鍛煉后取得；(b)確定取自患有糖尿病的受試者的生物樣本中蛋白質(zhì)的水平，所述受試者已經(jīng)被確定沒(méi)有患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)，所述生物樣本在所述受試者進(jìn)行體育鍛煉后取得；(c)將步驟(b)確定的水平與步驟(a)確定的水平進(jìn)行比較，以及(d)如果在步驟(c)中進(jìn)行比較的各水平不同，則鑒定所述蛋白質(zhì)是糖尿病性腎病的預(yù)測(cè)標(biāo)志物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種試劑盒，其在單獨(dú)的容器中或在同一容器中，包括用于檢測(cè)至少兩種選自下組的蛋白質(zhì)的工具：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四連接素、CD59糖蛋白、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑、甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2或其亞型、抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、膠原蛋白α-1(I)鏈、α-烯醇酶、組蛋白H2B1-O型、谷氨酰胺酰基肽環(huán)轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)AMBP和鋅-α-2-糖蛋白。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：定義本文中的“受試者”是指任何動(dòng)物，例如脊椎動(dòng)物或哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為非人類(lèi)或人類(lèi)哺乳動(dòng)物。脊椎動(dòng)物的實(shí)施例包括鳥(niǎo)類(lèi)和家禽，具體地雞。非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的實(shí)施例包括嚙齒動(dòng)物、馬、豬和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。最優(yōu)選地，受試者是人類(lèi)。根據(jù)本發(fā)明的“受試者”是患有糖尿病的個(gè)體，即已經(jīng)在所述個(gè)體中診斷出糖尿病?！疤悄虿?Diabetesmellitus)”或“糖尿病(diabetes)”是指特征在于血液中異常高水平的葡萄糖的代謝性疾病，或者是因?yàn)橐认俨划a(chǎn)生足夠的胰島素，或者是因?yàn)榧?xì)胞不對(duì)產(chǎn)生的胰島素產(chǎn)生反應(yīng)。有兩種主要類(lèi)型的糖尿病。1型糖尿病由胰島的胰臟β細(xì)胞的破壞引起，導(dǎo)致不能產(chǎn)生胰島素，并且其通常導(dǎo)致絕對(duì)胰島素缺乏。它通常需要受試者注射胰島素或佩戴胰島素泵。這種形式也被稱(chēng)為“胰島素依賴(lài)性糖尿病”(IDDM)或“青少年糖尿病”。2型糖尿病的特征在于異常胰島素抗性，是一種病征，其中細(xì)胞未能正確使用胰島素，有時(shí)與絕對(duì)胰島素缺乏相結(jié)合存在。這種形式也被稱(chēng)為“非胰島素依賴(lài)性糖尿病”(NIDDM)或“成人發(fā)病型糖尿病”。根據(jù)本發(fā)明的“受試者”可能患有1型或2型糖尿病。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的受試者患有1型糖尿病。“糖尿病性腎病”(DN)是影響糖尿病患者的一種腎小球病變。DN影響約25-40％的1型或2型糖尿病患者，并且是這些患者終末期腎病(ESRD)的主要原因。糖尿病性腎病的特征在于腎小球?yàn)V過(guò)率的改變和尿中蛋白質(zhì)的逐漸異常增加。早期DN的第一個(gè)臨床癥狀是“微量白蛋白尿”，這個(gè)術(shù)語(yǔ)是指尿中異常量白蛋白的出現(xiàn)。微量白蛋白尿的檢測(cè)通常用作診斷DN的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試。正常白蛋白尿通常被定義為低于30毫克/24小時(shí)的尿白蛋白排泄率(UAER)，而微量白蛋白尿被定義為尿白蛋白排泄率在30毫克/24小時(shí)至300毫克/24小時(shí)。微量白蛋白尿階段可在患者體內(nèi)持續(xù)約10年。然后，并發(fā)癥可能發(fā)展到“大量白蛋白尿”階段，被定義為尿白蛋白排泄率超過(guò)300毫克/24小時(shí)。大量白蛋白尿通常表明明顯的DN和ESRD增加的風(fēng)險(xiǎn)。與正常、微量和大量白蛋白尿相關(guān)的尿白蛋白排泄率和尿白蛋白肌酐比(UACR)匯總在表1中。表1：與正常、微量和大量白蛋白尿相關(guān)的尿白蛋白排泄率(UAER)和尿白蛋白肌酐比(UACR)。根據(jù)本發(fā)明的受試者是正常白蛋白尿，即可以在他/她的尿中檢測(cè)到正常量的白蛋白。例如，在所述受試者的尿中檢測(cè)到的尿白蛋白排泄率(UAER)低于20微克/分鐘，或低于30毫克/24小時(shí)。可選的，如果受試者是女性，則在所述受試者的尿中檢測(cè)到的尿白蛋白肌酐比(UACR)低于2.5毫克/毫摩爾，或者如果受試者是男性，則檢測(cè)到的尿白蛋白肌酐比(UACR)低于3.5毫克/毫摩爾，或者低于30毫克/克。測(cè)定受試者體內(nèi)UAER或UACR的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。因此，本發(fā)明的方法允許在不呈現(xiàn)糖尿病性腎病的任何癥狀，特別是不顯示微量白蛋白尿的任何癥狀的受試者體內(nèi)早期預(yù)測(cè)糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的方法是基于根據(jù)本發(fā)明的受試者的生物樣本中特定蛋白質(zhì)的檢測(cè)。術(shù)語(yǔ)“生物樣本”是指任何類(lèi)型的生物樣本。例如，生物樣本可以是尿樣本、血樣本、血清樣本或血漿樣本。最優(yōu)選地，生物樣本為尿樣本。生物樣本可以任選地經(jīng)過(guò)處理以允許進(jìn)一步分析，例如磷酸化蛋白質(zhì)，并且這種處理可以包括使用磷酸酶抑制劑(例如用1mM原釩酸鈉、10mM氟化鈉、20mM甘油2-磷酸二鈉和/或蛋白酶抑制劑)。此外，生物樣本可任選地被濃縮和/或冷凍直至使用。具體地，可以如實(shí)施例1.4所示制備生物樣本。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，生物樣本取自在樣本收集之前進(jìn)行過(guò)“體育鍛煉”的受試者。如本文所使用的，“體育鍛煉”或“體育活動(dòng)”被定義為需要能量消耗的骨骼肌產(chǎn)生的任何身體鍛煉。例如，受試者可以在腳踏車(chē)測(cè)力計(jì)上進(jìn)行鍛煉測(cè)試。為了個(gè)性化鍛煉測(cè)試期間鍛煉強(qiáng)度的增量，可以從理論最大有氧功率(Wmax)(即，對(duì)應(yīng)于理論最大氧消耗(VO2max)的功率)計(jì)算每一步的工作量。因此，受試者可以進(jìn)行具有相同相對(duì)增量工作量的測(cè)試，并且可以在其Wmax的相同百分比下進(jìn)行比較。該測(cè)試可以包括在20％、40％、60％和80％的Wmax下六分鐘穩(wěn)態(tài)工作量。鍛煉的持續(xù)時(shí)間通常約為24分鐘。然后受試者可以在樣本收集之前休息、喝水。具體地，受試者可以進(jìn)行如實(shí)施例1.2或O'Brien，Watts等人，1995中所述的鍛煉測(cè)試。生物標(biāo)志物發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可以在一子組在體育鍛煉測(cè)試后被確定具有患上糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)的正常白蛋白尿糖尿病患者的生物樣本中檢測(cè)到某些特定蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，并且還發(fā)現(xiàn)，該變化與發(fā)生糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。這些特定蛋白質(zhì)可用作生物標(biāo)志物，用于體外檢測(cè)糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)的方法中，選自下組：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四連接素、CD59糖蛋白、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑、甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2或其亞型、抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、膠原蛋白α-1(I)鏈、α-烯醇酶、組蛋白H2B1-O型、谷氨酰胺酰基肽環(huán)轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)AMBP和鋅-α-2-糖蛋白。碳酸酐酶1通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中被標(biāo)引為P00915的蛋白質(zhì)。作為非限制性實(shí)施例，碳酸酐酶1的替代名稱(chēng)包括碳酸脫水酶I、碳酸酐酶B、CAB、碳酸酐酶I，CA-I或CA1(其在本文中指由基因CA1編碼的蛋白質(zhì))。通常，碳酸酐酶1是催化二氧化碳水合和碳酸氫鹽脫水的酶。CD59糖蛋白通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中被標(biāo)引為P13987的蛋白質(zhì)。作為非限制性實(shí)施例，CD59糖蛋白的替代名稱(chēng)包括1F5抗原、20kDa同源限制性因子、HRF20、MAC-抑制性蛋白、MAC-IP、MEM43抗原、膜攻擊復(fù)合物抑制因子、MACIF、反應(yīng)性裂解的膜抑制劑、MIRL、保護(hù)素或CD59(其在本文中指由基因CD59編碼的蛋白質(zhì))。通常，CD59糖蛋白是補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物(MAC)作用的抑制劑。其結(jié)合了組裝MAC的C8和/或C9互補(bǔ)體。CD59由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，包括腎小球和腎小管內(nèi)皮細(xì)胞。四連接素通常是指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中被標(biāo)引為P05452的蛋白質(zhì)。作為非限制性實(shí)施例，四連接素的替代名稱(chēng)包括TN、C型凝集素結(jié)構(gòu)域族3成員B、纖溶酶原三環(huán)結(jié)構(gòu)域4結(jié)合蛋白或CLEC3B(其在本文中指由基因CLEC3B編碼的蛋白質(zhì))。通常，四連接素是具有C型凝集素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，其最初被分離為纖溶酶原結(jié)合蛋白，該纖溶酶原結(jié)合蛋白可以在組織纖溶酶原激活物的存在下增強(qiáng)纖溶酶原激活。膠原蛋白α-1(I)鏈通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中被標(biāo)引為P02452的蛋白質(zhì)。作為非限制性實(shí)施例，膠原蛋白α-1(I)鏈的替代名稱(chēng)包括α-1I型膠原蛋白或(其在本文中指由基因COL1A1編碼的蛋白)。通常，膠原蛋白α-1(I)鏈?zhǔn)荌組膠原蛋白(纖維形成膠原蛋白)的成員。被稱(chēng)為膠原纖維的膠原絲束是支持大多數(shù)組織并從外部給予細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)的主要組分，但是膠原蛋白也在某些細(xì)胞內(nèi)部發(fā)現(xiàn)。凝血酶原通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中被標(biāo)引為P00734的蛋白質(zhì)。作為非限制性實(shí)施例，凝血酶原的替代名稱(chēng)包括凝血因子II或F2(其在本文中指由基因F2編碼的蛋白質(zhì))。通常，凝血酶(F2a)是血液凝固的關(guān)鍵酶，并且它由凝血酶原(F2)通過(guò)蛋白酶解激活而得到。實(shí)際上，凝血酶原被裂解成以下4條鏈：活化肽片段1、活化肽片段2、凝血酶輕鏈和凝血酶重鏈。術(shù)語(yǔ)“凝血酶原或其片段”用于指凝血酶原、活化片段1、活化片段2、凝血酶輕鏈或凝血酶重鏈。硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白通常是指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中被標(biāo)引為P98160的蛋白質(zhì)。作為非限制性實(shí)施例，硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白的替代名稱(chēng)包括基底膜特異性硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白、基底膜蛋白多糖、LC或HSPG2(其在本文中是指由基因HSPG2編碼的蛋白質(zhì))。通常，硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白是結(jié)合了許多細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組分和細(xì)胞表面分子的大型多結(jié)構(gòu)域蛋白多糖。其由血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞合成并沉積在細(xì)胞外基質(zhì)中。HSPG2被裂解成以下2條鏈：血管生成抑制劑(78kDa)和LG3肽(22kDa)。下文中，術(shù)語(yǔ)“硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段”用于表示硫酸肝素蛋白多糖核心蛋白、血管生成抑制劑或LG3。甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中被標(biāo)引為O00187的蛋白質(zhì)。作為非限制性實(shí)施例，甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2的替代名稱(chēng)包括MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶2、甘露糖結(jié)合蛋白相關(guān)絲氨酸蛋白酶2或MASP2(其在本文中指由基因MASP2編碼的蛋白質(zhì))。MASP2的替代剪接產(chǎn)物是由185個(gè)氨基酸組成的且分子量為20.62kDa的名為MAp19或sMAP(小MBL相關(guān)蛋白)的蛋白質(zhì)。通常，甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2是一種血清蛋白酶，其在經(jīng)由甘露糖結(jié)合凝集素的補(bǔ)體系統(tǒng)激活中起重要作用。在通過(guò)自身催化裂解活化后，其裂解C2和C4，導(dǎo)致它們活化和形成C3轉(zhuǎn)化酶。MASP2被裂解成以下2條鏈：甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2A鏈和甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2B鏈。在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2”一般地表示MASP2或Map19。α-1-抗胰蛋白酶通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中被標(biāo)引為P01009的蛋白質(zhì)。作為非限制性實(shí)施例，α-1-抗胰蛋白酶的替代名稱(chēng)包括α-1蛋白酶抑制劑、α-1-抗蛋白酶或SerpinA1(其在本文中表示由基因SerpinA1編碼的蛋白質(zhì))。通常，α-1-抗胰蛋白酶是絲氨酸蛋白酶的抑制劑，其主要靶標(biāo)是中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，但其對(duì)纖溶酶和凝血酶也具有中度親和力。其是FXIa和激肽釋放酶的主要血漿抑制劑。血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑通常是指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中被標(biāo)引為P05154的蛋白質(zhì)。作為非限制性實(shí)施例，血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑的替代名稱(chēng)包括頂體絲氨酸蛋白酶抑制劑、纖溶酶原激活物抑制劑3、PAI-3、蛋白C抑制劑，PCI或SerpinA5(其在本文中指由基因SerpinA5編碼的蛋白質(zhì))。通常，血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑是蛋白酶抑制劑的絲氨酸蛋白酶抑制劑族的成員。在人體中，其在肝臟中產(chǎn)生并分泌到血液中。其抑制包含蛋白質(zhì)C抗凝血?jiǎng)┩緩?、活化蛋白質(zhì)C和凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物的蛋白酶?？鼓?III通常是指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中被標(biāo)引為P01008的蛋白質(zhì)。作為非限制性實(shí)施例，抗凝血酶-III的替代名稱(chēng)包括ATIII或SerpinC1(其在本文中是指由基因SerpinC1編碼的蛋白質(zhì))。通常，抗凝血酶-III是血漿中重要的絲氨酸蛋白酶抑制劑，其調(diào)節(jié)血凝級(jí)聯(lián)。其抑制凝血酶以及因子IXa和Xa。α-烯醇酶通常指2013年1月28日在UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中被標(biāo)引為P06733的蛋白質(zhì)。作為非限制性實(shí)施例，α-烯醇酶的替代名稱(chēng)包括2-磷酸-D-甘油酸水裂解酶、C-myc啟動(dòng)子結(jié)合蛋白質(zhì)、烯醇酶1、MBP-1、MPB-1、非神經(jīng)烯醇酶、NNE、磷酸丙酮酸水合酶、纖溶酶原結(jié)合蛋白質(zhì)或ENO1(其在本文中是指由基因ENO1編碼的蛋白質(zhì))。ENO1的替代剪接產(chǎn)物是由341個(gè)氨基酸組成的分子量為36.92kDa的名為MPB-1的蛋白質(zhì)。在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“α-烯醇酶”一般地表示ENO1和/或MPB-1。組蛋白H2B1-O型通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中被標(biāo)引為P23527的蛋白質(zhì)。作為非限制性實(shí)施例，組蛋白H2B1-O型的替代名稱(chēng)包括組蛋白H2B.2，組蛋白H2B.n，H2B/n或HIST1H2BO(其在本文中是指由基因HIST1H2BO編碼的蛋白質(zhì))。谷氨酰胺?；沫h(huán)轉(zhuǎn)移酶通常是指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中被標(biāo)引為Q16769的蛋白質(zhì)。作為非限制性實(shí)施例，谷氨酰胺?；沫h(huán)轉(zhuǎn)移酶的替代性名稱(chēng)包括谷氨酰胺?；h(huán)化酶、QC、sQC、谷氨酰胺?；?tRNA環(huán)轉(zhuǎn)移酶、谷氨?；h(huán)化酶、EC或QPCT(其在本文中是指由基因QPCT編碼的蛋白質(zhì))。QPCT的替代剪接產(chǎn)物是由312個(gè)氨基酸組成的且分子量為35.42kDa的名為QPCT亞型2的蛋白質(zhì)。在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“谷氨酰胺酰基肽環(huán)轉(zhuǎn)移酶”一般表示上文定義的QPCT蛋白和/或QPCT亞型2。蛋白質(zhì)AMBP通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中被標(biāo)引為P02760的蛋白質(zhì)。作為非限制性實(shí)施例，蛋白質(zhì)AMBP的替代名稱(chēng)包括AMBP(其在本文中是指由基因AMBP編碼的蛋白質(zhì))。蛋白質(zhì)AMBP被裂解成以下3條鏈：α-1-微球蛋白(替代名稱(chēng)：蛋白質(zhì)HC、α-1微糖蛋白或復(fù)合成形的糖蛋白異質(zhì)電荷)、間-α-胰蛋白酶抑制劑輕鏈(替代名稱(chēng)：ITI-LC、雙庫(kù)尼茨抑制劑、EDC1、HI-30或富含糖醛酸蛋白質(zhì))和胰蛋白酶抑制劑。在下文中，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)AMBP”一般表示蛋白質(zhì)AMBP、α-1-微球蛋白、間-α-胰蛋白酶抑制劑輕鏈和/或胰蛋白酶抑制劑。鋅-α-2-糖蛋白通常指2013年1月28日UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中被標(biāo)引為P25311的蛋白質(zhì)。作為非限制性實(shí)施例，鋅-α-2-糖蛋白的替代名稱(chēng)包括Zn-α-2-GP，Zn-α-2-糖蛋白或AZGP1(其在本文中是指由基因AZGP1編碼的蛋白質(zhì))。應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明的方法中給定蛋白質(zhì)的測(cè)量包括相關(guān)生物樣本中天然存在的蛋白質(zhì)的測(cè)量，這意味著其包括具有任何可能出現(xiàn)的潛在轉(zhuǎn)譯后修飾(例如糖基化、磷酸化等)的相同蛋白質(zhì)的測(cè)量。體外檢測(cè)糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)增加的方法本發(fā)明涉及一種用于體外檢測(cè)患有糖尿病且是正常白蛋白尿的受試者患糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括以下步驟：(a1)測(cè)量取自受試者的生物樣本中至少一種選自下組的蛋白質(zhì)的水平：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四連接素、CD59糖蛋白、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑、甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2或其亞型，抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、膠原蛋白α-1(I)鏈、α-烯醇酶、組蛋白H2B1-O型、谷氨酰胺酰基肽環(huán)轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)AMBP和鋅-α-2-糖蛋白，以及(b)由步驟(a1)測(cè)得的水平確定所述受試者患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)是否增加。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括以下步驟：(a1)測(cè)量取自受試者的生物樣本中至少一種選自下組的蛋白質(zhì)的水平：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四連接素、CD59糖蛋白、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑、甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2或其亞型，以及(b)由步驟(a1)測(cè)得的水平確定所述受試者患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)是否增加。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括以下步驟：(a1)測(cè)量取自受試者的生物樣本中至少一種選自下組的蛋白質(zhì)的水平：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四連接素、CD59糖蛋白、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑和甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2或其亞型，并測(cè)量取自受試者的生物樣本中至少一種選自下組的蛋白質(zhì)的水平：抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、膠原蛋白α-1(I)鏈、α-烯醇酶、組蛋白H2B1-O型、谷氨酰胺?；沫h(huán)轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)AMBP和鋅-α-2-糖蛋白，以及(b)由步驟(a1)測(cè)得的各水平確定所述受試者患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)是否增加。糖尿病性腎病(DN)是一種影響約25-40％的糖尿病患者的腎小球病變。因此，在糖尿病患者群體中，統(tǒng)計(jì)學(xué)上約25-40％的受試者會(huì)患上糖尿病性腎病，而剩余的60-75％的受試者將不會(huì)患上糖尿病性腎病。為了能夠預(yù)防可能患上糖尿病性腎病的患者的發(fā)病，期望盡早評(píng)價(jià)糖尿病患者患上糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)，即在糖尿病性腎病的第一癥狀出現(xiàn)之前，例如當(dāng)糖尿病患者仍然是正常白蛋白尿時(shí)，就預(yù)測(cè)糖尿病患者出現(xiàn)糖尿病性腎病的可能性?！皺z測(cè)患有糖尿病的受試者患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)增加”是指預(yù)測(cè)所述患者中糖尿病性腎病的出現(xiàn)或發(fā)病或評(píng)估所述患者患有糖尿病性腎病的可能性。“檢測(cè)患有糖尿病的受試者患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)增加”還指確定所述患者是否可能患上糖尿病性腎病?！皽y(cè)量至少一種蛋白質(zhì)的水平”是指“測(cè)量至少一種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平”。該步驟可以使用本領(lǐng)域熟知的任何方法進(jìn)行。例如，一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平可以通過(guò)凝膠電泳，例如2D凝膠電泳來(lái)確定。電泳可以與質(zhì)譜，例如LC/MS-MS聯(lián)用。一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平也可以通過(guò)質(zhì)譜直接測(cè)定，例如靶向質(zhì)譜。一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平也可以通過(guò)免疫印跡測(cè)定法測(cè)定，例如蛋白質(zhì)印跡?？蛇x的，一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平可以通過(guò)ELISA、多路復(fù)用或抗體陣列等免疫測(cè)定法進(jìn)行測(cè)量。具體地，一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平可以如實(shí)施例1.5、1.10和1.11中所述進(jìn)行測(cè)量。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，可以在檢測(cè)糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)增加的方法的步驟a1)中測(cè)量幾種蛋白質(zhì)的水平。因此，該方法的步驟a1)可以包括：測(cè)量至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15種選自下組的蛋白質(zhì)的水平：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四連接素、CD59糖蛋白、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑、甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2或其亞型、抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、膠原蛋白α-1(I)鏈、α-烯醇酶、組蛋白H2B1-O型、谷氨酰胺酰基肽環(huán)轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)AMBP和鋅-α-2-糖蛋白，優(yōu)選地選自下組：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四連接素、CD59糖蛋白。各種蛋白質(zhì)的水平可以同時(shí)或依次地測(cè)量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括步驟(a2)：將步驟(a1)中測(cè)得的水平(一個(gè)或多個(gè))與至少一個(gè)預(yù)定值進(jìn)行比較，而步驟(b)包括：基于步驟(a2)的比較，確定受試者存在患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)增加。術(shù)語(yǔ)“預(yù)定值”優(yōu)選地是指在取自患有糖尿病且被確定為不具有患糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)的正常白蛋白尿受試者的生物樣本中測(cè)得的所述至少一種蛋白質(zhì)的平均水平。在本發(fā)明的上下文中，“正常白蛋白尿受試者”是指UAER或UACR如表1所示的受試者。在本發(fā)明的上下文中，如果在至少2年的監(jiān)測(cè)期之后，在受試者體內(nèi)沒(méi)有臨床發(fā)現(xiàn)糖尿病性腎病，則這樣的受試者“被確定為沒(méi)有患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)”?？蛇x的，被確定沒(méi)有患糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)的受試者是那些在體育鍛煉后保持正常白蛋白尿的正常白蛋白受試者，如O'Brien，Watts等人，1995(《糖尿病護(hù)理》，第18卷，第12期，1995年12月)所述。使用體育鍛煉來(lái)確定沒(méi)有患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)在以下情況下是特別有利的，即對(duì)照受試者在至少2年的時(shí)期內(nèi)難以(或不能)被監(jiān)測(cè)。在根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中測(cè)定了至少兩種蛋白質(zhì)的水平，從如上所述的所述至少兩種蛋白質(zhì)的水平獲得的虛擬標(biāo)志物的水平可與至少一個(gè)預(yù)定值進(jìn)行比較。例如，在專(zhuān)利申請(qǐng)US2013/0210661(Bio-RadInnovations&CNRS)和US2014004538(Bio-RadInnovations，CHRULille，UniversitédeLille2)中描述了用于組合至少兩種蛋白質(zhì)結(jié)果的虛擬標(biāo)志物的使用。預(yù)定值可以是閾值，例如中值或平均值，或者數(shù)值的范圍，例如置信區(qū)間。具體地，預(yù)定值可以對(duì)應(yīng)于已知沒(méi)有患糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)的一組糖尿病個(gè)體中蛋白質(zhì)的平均水平。預(yù)定值還可以對(duì)應(yīng)于已知沒(méi)有患糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)的一組糖尿病個(gè)體中最多觀察到的蛋白質(zhì)水平的數(shù)值范圍。預(yù)定值還可以對(duì)應(yīng)于在步驟a1)測(cè)量所述至少一種蛋白質(zhì)所用生物樣本的取樣時(shí)間之前取自所述受試者的生物樣本中測(cè)量的至少一種蛋白質(zhì)的水平。例如，預(yù)定值可以是在時(shí)間t0取自受試者的樣本中的所述至少一種蛋白質(zhì)的水平，而在步驟a1)中測(cè)定的蛋白質(zhì)水平是在時(shí)間tx取自同一受試者的生物樣本中測(cè)量的，其中t0和tx不同，并且tx在t0之后。tx和t0(A＝tx-t0)之間的時(shí)期A的數(shù)量級(jí)優(yōu)選為數(shù)月(優(yōu)選24個(gè)月，還優(yōu)選20個(gè)月，還優(yōu)選18個(gè)月，還優(yōu)選16個(gè)月，還優(yōu)選14個(gè)月，還優(yōu)選12個(gè)月，還優(yōu)選11個(gè)月，還優(yōu)選10個(gè)月，還優(yōu)選9個(gè)月，還優(yōu)選8個(gè)月，還優(yōu)選7個(gè)月，還優(yōu)選6個(gè)月，還優(yōu)選5個(gè)月，還優(yōu)選4個(gè)月，還優(yōu)選3個(gè)月，還優(yōu)選2個(gè)月，還優(yōu)選1個(gè)月)。更優(yōu)選地，A的數(shù)量級(jí)為數(shù)周(優(yōu)選6周，更優(yōu)選5周，還優(yōu)選4周，還優(yōu)選3周，還優(yōu)選2周，還優(yōu)選1周)。還優(yōu)選地，A的數(shù)量級(jí)為數(shù)天(優(yōu)選45天，更優(yōu)選30天，還優(yōu)選25天，還優(yōu)選20天，還優(yōu)選18天，還優(yōu)選15天，還優(yōu)選12天，還優(yōu)選10天，還優(yōu)選8天，還優(yōu)選6天，還優(yōu)選5天，還優(yōu)選4天，還優(yōu)選3天，還優(yōu)選2天，還優(yōu)選1天)。還優(yōu)選地，A的數(shù)量級(jí)為數(shù)小時(shí)(優(yōu)選72小時(shí)，更優(yōu)選60小時(shí)，還優(yōu)選48小時(shí)，還優(yōu)選36小時(shí)，還優(yōu)選24小時(shí)，還優(yōu)選18小時(shí)，還優(yōu)選12小時(shí)，還優(yōu)選10小時(shí)，還優(yōu)選8小時(shí)，還優(yōu)選6小時(shí)，還優(yōu)選4小時(shí)，還優(yōu)選3小時(shí)，還優(yōu)選2小時(shí)，還優(yōu)選1小時(shí))。還優(yōu)選地，A為90分鐘，更優(yōu)選為60分鐘，還優(yōu)選為45分鐘，還優(yōu)選為30分鐘。優(yōu)選地，t0對(duì)應(yīng)于患者入院時(shí)的取樣時(shí)間。如技術(shù)人員所知，預(yù)定值取決于生物樣本類(lèi)型和用于測(cè)量生物樣本中蛋白質(zhì)水平的方法。因此，預(yù)定值優(yōu)選地通過(guò)使用與測(cè)量受試者的蛋白質(zhì)水平相同的測(cè)定技術(shù)來(lái)提供，以避免標(biāo)準(zhǔn)化中的任何誤差。具體地，本發(fā)明的方法還可以包括步驟a2)：確定步驟a1)測(cè)量的水平(一個(gè)或多個(gè))是否高于或低于如上所定義的至少一個(gè)預(yù)定值。在本發(fā)明的上下文中，蛋白質(zhì)的水平高于或低于預(yù)定值，優(yōu)選地是指在統(tǒng)計(jì)學(xué)觀點(diǎn)上一個(gè)水平顯著高于或低于所述預(yù)定值。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者體內(nèi)至少一種選自下組的蛋白質(zhì)的水平下降，即表示患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)增加：凝血酶原或其片段(具體地活化肽片段1)、四連接素、CD59糖蛋白、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑、Map19、LG3、谷氨酰胺?；沫h(huán)轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)AMBP、α-烯醇酶和組蛋白H2B1-O型。優(yōu)選地，至少一種選自下組的蛋白質(zhì)的水平比預(yù)定值低至少10％，即表示患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)增加：凝血酶原或其片段(具體地為活化肽片段1)、四連接素、CD59糖蛋白、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑、Map19、LG3、谷氨酰胺?；沫h(huán)轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)AMBP、α-烯醇酶和組蛋白H2B1-O型，或者根據(jù)越來(lái)越優(yōu)選的實(shí)施方案，比預(yù)定值低至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，表示患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)增加。更優(yōu)選地，如果在適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試中P值小于0.05，則與預(yù)定值相比，至少一種選自下組的蛋白質(zhì)的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低：凝血酶原或其片段(具體地活化肽片段1)、四連接素、CD59糖蛋白、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑、Map19、LG3、谷氨酰胺?；沫h(huán)轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)AMBP、α-烯醇酶和組蛋白H2B1-O型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者體內(nèi)至少一種選自下組的蛋白質(zhì)的水平增加，即表示患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)增加：血管生成抑制劑、碳酸酐酶1、膠原蛋白α-1(I)鏈、α-1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶-III和鋅-α-2-糖蛋白。優(yōu)選地，至少一種選自下組的蛋白質(zhì)的水平比預(yù)定值高至少10％，即表示患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)增加：血管生成抑制劑、碳酸酐酶1、膠原蛋白α-1(I)鏈、α-1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶-III和鋅-α-2-糖蛋白，或者根據(jù)越來(lái)越優(yōu)選的實(shí)施方案，比預(yù)定值高至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，表示患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)增加。更優(yōu)選地，如果在適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試中P值小于0.05，則與預(yù)定值相比，至少一種選自下組的蛋白質(zhì)的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加：血管生成抑制劑、碳酸酐酶1、膠原蛋白α-1(I)鏈、α-1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶-III和鋅-α-2-糖蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及一種預(yù)防患有糖尿病且是正常白蛋白尿的受試者患糖尿病性腎病的方法，所述方法包括以下步驟：(a1)測(cè)量取自受試者的生物樣本中至少一種選自下組的蛋白質(zhì)的水平：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四連接素、CD59糖蛋白、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑、甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2或其亞型，抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、膠原蛋白α-1(I)鏈、α-烯醇酶、組蛋白H2B1-O型、谷氨酰胺?；沫h(huán)轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)AMBP和鋅-α-2-糖蛋白，(a2)任選地，將步驟(a1)中測(cè)得的水平與至少一個(gè)預(yù)定值進(jìn)行比較，(b)由步驟(a1)測(cè)得的水平或步驟(a2)的比較，確定所述受試者患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)是否增加，以及(c)如果受試者在步驟(b)中已被確定為患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)增加，則對(duì)所述受試者施用針對(duì)糖尿病性腎病的預(yù)防性治療。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的一種預(yù)防糖尿病性腎病的方法，包括以下步驟：(a1)測(cè)量取自受試者的生物樣本中至少一種選自下組的蛋白質(zhì)的水平：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四連接素、CD59糖蛋白、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑、甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2或其亞型，以及(a2)任選地，將步驟(a1)中測(cè)得的水平與至少一個(gè)預(yù)定值進(jìn)行比較，(b)由步驟(a1)測(cè)得的水平或步驟(a2)的比較，確定所述受試者患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)是否增加，以及(c)如果受試者在步驟(b)中已被確定為患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)增加，則對(duì)所述受試者施用針對(duì)糖尿病性腎病的預(yù)防性治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的一種預(yù)防糖尿病性腎病的方法，包括以下步驟：(a1)測(cè)量取自受試者的生物樣本中至少一種選自下組的蛋白質(zhì)的水平：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四連接素、CD59糖蛋白、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑和甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2或其亞型，并測(cè)量取自受試者的生物樣本中至少一種選自下組的蛋白質(zhì)的水平：抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、膠原蛋白α-1(I)鏈、α-烯醇酶、組蛋白H2B1-O型、谷氨酰胺酰基肽環(huán)轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)AMBP和鋅-α-2-糖蛋白，以及(a2)任選地，將步驟(a1)中測(cè)得的各水平與至少一個(gè)預(yù)定值進(jìn)行比較，(b)由步驟(a1)測(cè)得的各水平或步驟(a2)的比較，確定所述受試者患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)是否增加，以及(c)如果受試者在步驟(b)中已被確定為患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)增加，則對(duì)所述受試者施用針對(duì)糖尿病性腎病的預(yù)防性治療。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“針對(duì)糖尿病性腎病的預(yù)防性治療”主要是指用降低血壓的藥物，通過(guò)使用抗高血壓藥物例如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑或血管緊張素II受體阻斷劑(ARB)進(jìn)行的治療。用于體外鑒定糖尿病性腎病預(yù)測(cè)標(biāo)志物的方法本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于體外鑒定糖尿病性腎病預(yù)測(cè)標(biāo)志物的方法，所述方法包括以下步驟：(a)測(cè)量取自患有糖尿病的受試者的生物樣本中蛋白質(zhì)的水平，該受試者已經(jīng)被確定有患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)，所述生物樣本在所述受試者進(jìn)行如上面定義的體育鍛煉后取得；(b)測(cè)量取自患有糖尿病的受試者的生物樣本中蛋白質(zhì)的水平，該受試者已經(jīng)被確定沒(méi)有患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)，所述生物樣本在所述受試者進(jìn)行如上面定義的體育鍛煉后取得；(c)將步驟(b)確定的水平與步驟(a)確定的水平進(jìn)行比較，以及(d)如果在步驟(c)中進(jìn)行比較的各水平不同，則鑒定所述蛋白質(zhì)是糖尿病性腎病的預(yù)測(cè)標(biāo)志物。根據(jù)本發(fā)明的“體外鑒定標(biāo)志物的方法”可以是，例如體外篩選標(biāo)志物的方法。如本文所使用的，在取自受試者的生物樣本中檢測(cè)的“用于預(yù)測(cè)疾病的標(biāo)志物”是指一種生物分子，其表達(dá)水平指示所述疾病可能在所述受試者中出現(xiàn)、發(fā)病或進(jìn)展。優(yōu)選地，用于預(yù)測(cè)的標(biāo)志物是蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，用于預(yù)測(cè)疾病的標(biāo)志物是早期標(biāo)志物，即所述標(biāo)志物允許在未出現(xiàn)糖尿病性腎病的任何癥狀(包括微量白蛋白尿)的受試者體內(nèi)，盡早預(yù)測(cè)受試者患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)。優(yōu)選地，測(cè)量蛋白質(zhì)水平的步驟a)和b)可以如上文“用于體外檢測(cè)糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)增加的方法”部分所述進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的鑒定標(biāo)志物方法的步驟(a)和(b)中的生物樣本是在所述受試者進(jìn)行體育鍛煉之后從受試者取得的，如上所述。在本方法的步驟(a)中提到的受試者已經(jīng)確定為有患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)，并且本方法的步驟(b)中提到的受試者已被確定為沒(méi)有患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)?！按_定受試者是否有患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)，或者相對(duì)地沒(méi)有患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)”可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法進(jìn)行。優(yōu)選地，這可以通過(guò)使所述受試者進(jìn)行如上所述的體育鍛煉來(lái)進(jìn)行。具體地，如果受試者在如上面定義的體育鍛煉后呈現(xiàn)尿白蛋白水平增加、微量白蛋白尿或大量白蛋白尿，則可以確定受試者有患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)。相反，在如上面定義的體育鍛煉后未呈現(xiàn)尿白蛋白水平增加的受試者，即保持正常白蛋白的受試者可以被確定為沒(méi)有患糖尿病性腎病的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明的鑒定標(biāo)志物的方法的步驟c)包括：將步驟(b)中測(cè)定的水平與步驟(a)中測(cè)定的水平進(jìn)行比較，換句話說(shuō)，確定步驟(b)中測(cè)定的水平與步驟(a)中測(cè)定的水平是否是不同的。優(yōu)選地，如果它們之間的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性的，則在步驟(b)測(cè)定的水平和在步驟(a)測(cè)定的水平被認(rèn)為是不同的。根據(jù)適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試，例如統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異可以對(duì)應(yīng)于低于0.05的P值。如果在步驟(c)比較的各水平不同，優(yōu)選為顯著不同，則在生物樣本中進(jìn)行水平測(cè)量的蛋白質(zhì)被鑒定為用于預(yù)測(cè)糖尿病性腎病的標(biāo)志物。試劑盒本發(fā)明的另一個(gè)目的關(guān)于一種試劑盒，其在單獨(dú)的容器中或在同一容器中，包括用于檢測(cè)至少兩種選自下組的蛋白質(zhì)的工具：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四連接素、CD59糖蛋白、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑、甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2或其亞型、抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、膠原蛋白α-1(I)鏈、α-烯醇酶、組蛋白H2B1-O型、谷氨酰胺?；沫h(huán)轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)AMBP和鋅-α-2-糖蛋白。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“用于檢測(cè)至少一種蛋白質(zhì)的工具”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，能夠檢測(cè)一份生物樣本中(具體地尿樣本中)蛋白質(zhì)或肽的任何工具。例如，用于檢測(cè)至少一種蛋白質(zhì)的工具可以是一種或多種抗體，優(yōu)選為單克隆抗體。此類(lèi)工具，具體地用于檢測(cè)硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四連接素、CD59糖蛋白、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑、甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2或其亞型、抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、膠原蛋白α-1(I)、谷氨酰胺酰基肽環(huán)轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)AMBP、α-烯醇酶、組蛋白H2B1-O型和/或鋅-α-2-糖蛋白的抗體的非限制性實(shí)施例在表4中給出(參見(jiàn)實(shí)施例1.11)。例如，用于檢測(cè)CD59糖蛋白、甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2、α-1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶-III和碳酸酐酶1、谷氨酰胺?；沫h(huán)轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)AMBP、組蛋白H2B1-O型和鋅-α-2-糖蛋白的工具可以分別是由SigmaTM以標(biāo)號(hào)HPA026494、SAB1401534、HPA001292、HPA001816、HPA006558、HPA008406、HPA001497、HPA043013和HPA012582提供的抗體，用于檢測(cè)四連接素、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑和硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白的工具可以分別是由R&DSystemsTM以標(biāo)號(hào)AF5170、AF1266和AF2364提供的抗體，以及用于檢測(cè)凝血酶原、膠原蛋白α-1(I)鏈和α-烯醇酶的工具可以分別是由SantaCruzBiotechnologyTM以標(biāo)號(hào)sc-33769、sc-28657和sc-15343提供的抗體。本發(fā)明的試劑盒還可以包括與酶或熒光染料偶聯(lián)的一種或多種二抗。可選的，其還可包括酶、代謝物和比色或熒光底物的相關(guān)組合。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒包括用于檢測(cè)如“生物標(biāo)志物”部分中定義的各種生物標(biāo)志物的組合的工具。例如，試劑盒可以包括用于檢測(cè)至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15種選自下組的蛋白質(zhì)的工具：硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白或其片段、碳酸酐酶1、凝血酶原或其片段、四連接素、CD59糖蛋白、血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑、甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶2或其亞型、抗凝血酶-III、α-1-抗胰蛋白酶、膠原蛋白α-1(I)鏈、α-烯醇酶、組蛋白H2B1-O型、谷氨酰胺?；沫h(huán)轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)AMBP和鋅-α-2-糖蛋白。本發(fā)明的試劑盒還可以包括適于實(shí)施某些允許檢測(cè)一種或多種蛋白質(zhì)的技術(shù)的其他成分，例如(作為非限制性實(shí)施例)免疫印跡技術(shù)、免疫染色技術(shù)、ELISA技術(shù)、多路復(fù)用技術(shù)、定量質(zhì)譜或抗體陣列。附圖說(shuō)明圖1：糖尿病患者的四組尿樣本的定義。圖2：通過(guò)分散樹(shù)方法進(jìn)行的一系列2D-GE實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量評(píng)估。圖3：對(duì)有患糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)的患者(G4)和“對(duì)照”患者(G2)的天然尿樣本中的生物標(biāo)志物分析后獲得的蛋白質(zhì)印跡信號(hào)的定量。圖4：對(duì)健康受試者和患有腎病的糖尿病患者的尿樣本中的生物標(biāo)志物分析后獲得的蛋白質(zhì)印跡信號(hào)的定量。圖5：針對(duì)G1對(duì)G3和G2對(duì)G4之間比較的CA1+CD59組合(mROC方法)的ROC曲線。實(shí)施例實(shí)施例1：材料與方法1.1.患者招募在蒙彼利埃的拉佩羅尼醫(yī)院從AMTIM的患者中招募具有良好血糖控制(都配備有胰島素泵)的二十六名1型糖尿病患者。入選標(biāo)準(zhǔn)如下：1型糖尿病患者，平均糖尿病持續(xù)時(shí)間大于5年，無(wú)MA(定義為白蛋白/肌酐比(ACR)<30毫克/克)。所有患者都給出書(shū)面知情同意書(shū)以參與研究。這項(xiàng)研究得到了監(jiān)管當(dāng)局的批準(zhǔn)(地中海保護(hù)人權(quán)委員會(huì)的批準(zhǔn)，N°2006-A00162-49)。1.2.鍛煉測(cè)試與尿樣本采集患者被指引到法國(guó)蒙彼利埃拉佩羅尼醫(yī)院代謝探索單位(CERAMM)臨床生理學(xué)中心服務(wù)處。當(dāng)他們到達(dá)時(shí)(主要在上午)，在鍛煉測(cè)試前1小時(shí)開(kāi)始，每20分鐘令患者飲用200毫升的水。在即將開(kāi)始測(cè)試之前收集每名患者的早晨清潔中段尿樣本。然后，所有參與者在腳踏車(chē)測(cè)力計(jì)上進(jìn)行鍛煉測(cè)試。為了個(gè)性化體育測(cè)試期間鍛煉強(qiáng)度的增量，從理論最大有氧功率(Wmax)，即對(duì)應(yīng)于理論最大氧消耗(VO2max)的功率開(kāi)始計(jì)算每一步的工作量。因此，受試者接受具有相同相對(duì)增量工作量的測(cè)試，并在其Wmax的相同百分比下進(jìn)行比較。測(cè)試包括在20％、40％、60％和80％的Wmax下六分鐘穩(wěn)態(tài)工作量。在24分鐘的鍛煉結(jié)束時(shí)，所有患者休息1小時(shí)并喝水。在該休息階段之后，收集每名患者的尿樣本。將所有尿樣本收集在含有1mM原釩酸鈉、10mM氟化鈉、20mM甘油2-磷酸二鈉(密蘇里州圣路易斯市SigmaAldrich公司)和蛋白酶抑制劑(法國(guó)梅蘭RocheDiagnostics公司)的無(wú)菌杯中，-80℃儲(chǔ)存，直至使用。尿樣本的收集以可重現(xiàn)的方式、在同一時(shí)期進(jìn)行。1.3.研究設(shè)計(jì)在鍛煉測(cè)試前后測(cè)定所有樣本尿白蛋白/肌酐比(UACR)。根據(jù)鍛煉測(cè)試后收集的樣本中的UACR，將患者分為兩個(gè)隊(duì)列：1)由14名患者組成的對(duì)照隊(duì)列，這些患者在鍛煉測(cè)試后其尿微量白蛋白尿(MA-)保持陰性(UACR<30毫克/克)，以及2)由12名患者組成的被認(rèn)為有患DN風(fēng)險(xiǎn)的隊(duì)列，這些患者在鍛煉測(cè)試后變?yōu)槲⒘堪椎鞍啄?MA+)陽(yáng)性(30<UACR<300毫克/克)?；颊叩呐R床特征如表2所示。表2：1型糖尿病患者的臨床特征。數(shù)值被表示為平均值±S.D。(a)與對(duì)照隊(duì)列相比P<0.05；(b)與鍛煉測(cè)試后的同一隊(duì)列相比P<0.05。因此，定義了4個(gè)不同組的尿樣本(圖1)：-在鍛煉測(cè)試之前，G1組對(duì)應(yīng)于從對(duì)照隊(duì)列收集的樣本，而G3組對(duì)應(yīng)于從有風(fēng)險(xiǎn)隊(duì)列收集的樣本；-在鍛煉測(cè)試之后，G2組對(duì)應(yīng)于從對(duì)照隊(duì)列收集的樣本，而G4組對(duì)應(yīng)于從有風(fēng)險(xiǎn)隊(duì)列收集的樣本。1.4.尿樣本制備在4℃下將尿液在11000×g下離心30分鐘，并將上清液在4℃下用18MΩ.cm的水透析48小時(shí)。然后，使用5000Da截止離心管(馬薩諸塞州貝德福德Millipore公司)在4℃下將樣本濃縮至約初始體積的1/40。將濃縮的尿液凍干，然后在室溫下在旋轉(zhuǎn)輪上的含有8M(摩爾)尿素、2M硫代尿素、4％w/vCHAPS、65mMDTE、40mM三羥甲基氨基甲烷和蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中溶解2小時(shí)。使用RCDC蛋白測(cè)定試劑盒(加利福尼亞州赫拉克勒斯Bio-Rad公司)估計(jì)蛋白質(zhì)的量。1.5.2D-GE具有非線性固定的pH3-10梯度的18厘米長(zhǎng)預(yù)制IPG條，在含有8M尿素、2M硫代尿素、4％w/vCHAPS、65mMDTE、0.0025％v/v溴酚藍(lán)和1％v/vIPG緩沖液(3-10)的溶液中與170微克蛋白質(zhì)樣本再水合過(guò)夜。在EttanTMIPGphorTM等電聚焦系統(tǒng)上在20℃下進(jìn)行等電聚焦至總量為50kVh。第一維度運(yùn)行后，蛋白質(zhì)被還原(6M尿素、50mMTris-HCl，pH8.8，30％v/v甘油、2％w/vSDS、0.001v/v溴酚藍(lán)和65mMDTT)并在含有135mM碘乙酰胺代替DTT的相同緩沖液中烷基化10分鐘。然后，在自制的12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上使用ISO-DALT電泳單元在120伏的恒定電壓下在10℃下在第二維中過(guò)夜分離蛋白質(zhì)。凝膠用SyproRuby熒光染料(加利福尼亞州赫拉克勒斯Bio-Rad公司)染色。1.6.圖像分析使用Typhoon9200TM掃描儀(瑞典烏普薩拉市GEHealthcare公司)以50微米的分辨率單獨(dú)地對(duì)凝膠圖像進(jìn)行數(shù)字化，其中光電倍增管(PTM)電壓針對(duì)最大范圍而沒(méi)有信號(hào)飽和進(jìn)行調(diào)節(jié)。使用ProgenesisSameSpot軟件v3.0(英國(guó)達(dá)勒姆NonlinearDynamics公司)分析凝膠圖像。凝膠被扭曲以對(duì)準(zhǔn)圖像，且可自動(dòng)檢測(cè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。該軟件基于遞歸凝膠匹配的概念，這意味著匹配集合的每個(gè)凝膠在匹配過(guò)程中作為“參考凝膠”被遞歸地使用一次。在每種情況下嚴(yán)格評(píng)價(jià)自動(dòng)匹配的質(zhì)量，并且如果需要，手動(dòng)進(jìn)行校正。1.7.數(shù)據(jù)質(zhì)量分析使用Phylopuce方法(Copois，Bibeau等人，2007)來(lái)估計(jì)2D-GE實(shí)驗(yàn)的均勻性，以便確定最終質(zhì)量差的那些。簡(jiǎn)言之，每個(gè)凝膠由維度n的表達(dá)載體表示(n是點(diǎn)的數(shù)目)。計(jì)算載體之間的歐幾里德距離(表示所有實(shí)驗(yàn)和它們的歸一化點(diǎn)強(qiáng)度)。使用所得到的距離矩陣，利用“Kitsch算法”構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。為了可視化所獲得的樹(shù)，使用“Drawtree算法”，其給出無(wú)根樹(shù)的圖形表示。這種基于二維凝膠之間距離的分類(lèi)方法建立了凝膠之間的總體均勻性，并且最終精確定位樣本的實(shí)驗(yàn)偏差或特定行為。1.8.統(tǒng)計(jì)分析所有統(tǒng)計(jì)值用“R/Bioconductor”統(tǒng)計(jì)開(kāi)源軟件(Gentleman，Carey等人，2004)計(jì)算。使用以下不同的統(tǒng)計(jì)測(cè)試分析組間蛋白質(zhì)點(diǎn)的差異強(qiáng)度水平：Wilcoxon測(cè)試(Multtest程序包)、Welch測(cè)試(Multtest程序包)、VarMixt方法(VarMixt程序包)和SAM方法(siggenes程序包)。對(duì)于多種測(cè)試方法來(lái)說(shuō)，重要的是調(diào)整各個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的P值以控制假發(fā)現(xiàn)率(FDR)。Benjamini和Hochberg方法(Benjamini1995)被應(yīng)用于所有統(tǒng)計(jì)測(cè)試，并且小于0.05的經(jīng)調(diào)整P值被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。還使用ROC程序包計(jì)算AUC(曲線下面積)ROC(受試者工作特征)，并且大于0.75的AUCROC值被認(rèn)為是顯著的。對(duì)于帶有所用一個(gè)統(tǒng)計(jì)測(cè)試的兩個(gè)患者組之間的每個(gè)顯著差異點(diǎn)，根據(jù)表3將一個(gè)值分配給該點(diǎn)。因此，所有點(diǎn)具有0.5至5的所有統(tǒng)計(jì)測(cè)試的總分。只有那些分?jǐn)?shù)大于或等于2的點(diǎn)被包括在差異分析中。表3：分配給每個(gè)統(tǒng)計(jì)測(cè)試的值和點(diǎn)的總分1.9.膠內(nèi)酶解使用Propic機(jī)器人(馬薩諸塞州韋爾斯利Perkin-Elmer公司)從凝膠切除點(diǎn)。使用MultiprobeII機(jī)器人(馬薩諸塞州韋爾斯利Perkin-Elmer公司)自動(dòng)進(jìn)行所有后續(xù)步驟。首先用300微升水洗滌點(diǎn)，然后用300微升的25mMNH4HCO3洗滌。在25mMNH4HCO3中300微升50％乙腈的存在下進(jìn)行兩次脫色。然后將凝膠片用300微升100％CH3CN脫水兩次，最后在37℃下干燥1小時(shí)。將8微升胰蛋白酶溶液(美國(guó)麥迪遜普洛麥格公司，測(cè)序級(jí)改性胰蛋白酶)在25mMNH4HCO3中以0.0125微克/微升的濃度加入每個(gè)點(diǎn)，樣本首先在冰上保持15分鐘，然后保持在室溫。在37℃下消化過(guò)夜，并通過(guò)加入2微升的2％甲酸停止消化。將消化物在超聲波浴中超聲處理10分鐘，并將上清液轉(zhuǎn)移到HPLC聚丙烯管中。1.10.質(zhì)譜使用與納米HPLC芯片-立方體系統(tǒng)(美國(guó)圣克拉拉安捷倫科技公司)連接的高容量離子阱質(zhì)譜儀(EsquireHCT；德國(guó)不來(lái)梅布魯克·道爾頓公司)分析蛋白質(zhì)消化物。芯片包含前柱和柱(Zorbax300SB-C18；美國(guó)圣克拉拉安捷倫科技公司)。首先將樣本以4微升/分鐘的流速使用0.1％甲酸加載到4毫米富集盒上。預(yù)濃縮后，使用0.1％甲酸中3％至80％乙腈的15分鐘線性梯度，以0.3微升/分鐘的流速在柱(直徑75微米，長(zhǎng)度43毫米)上分離肽，并進(jìn)行洗脫進(jìn)入質(zhì)譜儀。以正離子模式的1.8-2.1千伏的毛細(xì)管電壓與在250℃下4.5升/分鐘的干氣流速一起使用。在310m/z(質(zhì)荷比)至1800m/z范圍內(nèi)測(cè)量第一次全掃描質(zhì)譜，隨后以較高分辨率進(jìn)行第二次掃描，以精確測(cè)量前一次掃描中三種主要離子的質(zhì)量。最后，進(jìn)行第三次掃描以獲得所選離子的碰撞誘導(dǎo)的MS/MS光譜。使用數(shù)據(jù)分析軟件(德國(guó)不來(lái)梅布魯克·道爾頓公司)分析MS/MS原始數(shù)據(jù)以產(chǎn)生峰值列表。使用Mascot搜索引擎(v.2.2.04；英國(guó)倫敦基質(zhì)科學(xué)公司)并使用以下參數(shù)在本地查詢NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBInr，版本20101018)：分類(lèi)為智人，酶為胰蛋白酶，允許1個(gè)漏掉的裂解，固定修飾為半胱氨酸的脲甲基化，可變修飾為甲硫氨酸的氧化，在MS和MS/MS中質(zhì)量精度均為0.6Da。在這些條件下，得分高于40的個(gè)體離子表示同一性或廣泛同源性(p<0.05)，而蛋白質(zhì)一旦顯示超過(guò)該閾值的至少一個(gè)肽，就進(jìn)行驗(yàn)證。1.11.通過(guò)蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證對(duì)于蛋白質(zhì)印跡，使用SE260迷你垂直電泳裝置(瑞典烏普薩拉GE醫(yī)療公司)，利用SDS-PAGE在160伏下，將取自G1，G2，G3和G4組(每組n＝4)的各30微克尿樣分解約2小時(shí)。然后，蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，利用0.1％PBS-Tween中的5％(w/v)脫脂乳在4℃下過(guò)夜限制非特異性結(jié)合。然后用合適的初級(jí)抗體(表4)將膜在室溫下孵育2小時(shí)。洗滌后，用偶聯(lián)有辣根過(guò)氧化物酶的合適二級(jí)抗體抗全分子IgG(表4)將膜在室溫下進(jìn)一步孵育1小時(shí)。通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)(瑞典烏普薩拉GE醫(yī)療公司)使用放射自顯影檢測(cè)反應(yīng)性蛋白條。表4：用于蛋白質(zhì)印跡的初級(jí)抗體和二次抗體的列表實(shí)施例2：糖尿病患者的臨床特征和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)質(zhì)量基于鍛煉測(cè)試后微量白蛋白尿的出現(xiàn)預(yù)示10年后持續(xù)性MA會(huì)發(fā)病的假設(shè)(O'Brien、Watts等人，1995)，發(fā)明人使用受控的鍛煉測(cè)試在兩個(gè)隊(duì)列中對(duì)1型糖尿病患者進(jìn)行分類(lèi)：對(duì)照患者隊(duì)列(14名在鍛煉后保持MA陰性)和有患DN風(fēng)險(xiǎn)的患者隊(duì)列(12名在鍛煉后變?yōu)镸A呈陽(yáng)性的患者)。對(duì)于每個(gè)隊(duì)列，在鍛煉測(cè)試(圖1)之前(G1和G3)和之后(G2和G4)收集尿樣本。兩個(gè)1型糖尿病患者隊(duì)列的臨床特征：表2中描述了對(duì)照隊(duì)列和有患DN風(fēng)險(xiǎn)的隊(duì)列。在年齡、糖尿病持續(xù)時(shí)間、鍛煉測(cè)試前的收縮壓和舒張壓、肌氨酸尿和HbA1c方面在兩個(gè)隊(duì)列的患者中并未觀察到顯著的差異。與糖尿病對(duì)照者相比，有患DN風(fēng)險(xiǎn)的糖尿病患者在鍛煉測(cè)試后有更高水平的白蛋白尿和UACR。兩個(gè)隊(duì)列鍛煉后的平均收縮壓水平都顯著高于鍛煉前的平均收縮壓水平。每個(gè)尿樣本的蛋白質(zhì)譜通過(guò)2D-GE進(jìn)行研究。在圖像分析之后，在每個(gè)凝膠上顯示768個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，并測(cè)定了蛋白質(zhì)點(diǎn)的相對(duì)豐度。還評(píng)估了實(shí)驗(yàn)間重現(xiàn)性(平均CV＝19％)。為了評(píng)估2D-GE數(shù)據(jù)的全局質(zhì)量，使用Phylopuce方法來(lái)分析實(shí)驗(yàn)的分散度。這允許以無(wú)根樹(shù)的形式(圖2)圖形地表示該系列實(shí)驗(yàn)。理想地，穿過(guò)樹(shù)的所有分支的一個(gè)圓將反映2D凝膠的完美同質(zhì)性。對(duì)Phylopuce的第一個(gè)結(jié)果的分析顯示，一些凝膠遠(yuǎn)離剩余的其他凝膠(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)探索這些遠(yuǎn)距離凝膠的圖像，我們注意到由于帶有扭曲的蛋白質(zhì)不良遷移和/或蛋白質(zhì)條紋的存在而引起的低質(zhì)量。對(duì)應(yīng)于這些凝膠的樣本在2D凝膠中再次遷移，產(chǎn)生了質(zhì)量令人滿意的2D凝膠。圖2中得到的無(wú)根樹(shù)顯示了可接受的凝膠分散度。然而，其中三個(gè)行為略有不同，可能是由于這些樣本的特定固有性質(zhì)而不是實(shí)驗(yàn)問(wèn)題，因?yàn)檫@些凝膠的檢查顯示它們不存在明顯的缺陷。決定在進(jìn)一步的差異分析中使用所有凝膠。實(shí)施例3：蛋白質(zhì)表達(dá)的比較分析從兩個(gè)隊(duì)列的所有患者在鍛煉測(cè)試之前和之后收集尿樣本：對(duì)照組(鍛煉測(cè)試前后均為MA陰性)和風(fēng)險(xiǎn)組(測(cè)試前為MA陰性，鍛煉測(cè)試后為MA陽(yáng)性)，產(chǎn)生四組尿液，如上所述。每組尿樣本(G1-G4)與特別關(guān)注的蛋白質(zhì)組匹配(表5)，其可以通過(guò)差異分析揭示。因此，G1組(在鍛煉測(cè)試之前收集的對(duì)照糖尿病患者的尿樣本)的蛋白質(zhì)組圖譜包含對(duì)照1型糖尿病患者之間共享的所有蛋白質(zhì)。G2組(鍛煉測(cè)試后收集的對(duì)照糖尿病患者的尿樣本)的蛋白質(zhì)組圖譜反映了對(duì)照患者體育鍛煉影響下尿液排泄增加或減少的所有蛋白質(zhì)。通過(guò)將鍛煉測(cè)試前收集的對(duì)照患者的尿樣本(G1組)與鍛煉后收集的相同患者的尿樣本(G2組)的蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行比較，即G1G2比較，揭示了一組被稱(chēng)為“對(duì)照患者的鍛煉蛋白質(zhì)組”的蛋白。G3組(在鍛煉測(cè)試之前收集的有風(fēng)險(xiǎn)糖尿病患者的尿樣本)可以包括通過(guò)沒(méi)有任何身體活動(dòng)揭示出的用于早期診斷DN的候選生物標(biāo)志物。這些生物標(biāo)志物可以通過(guò)比較來(lái)自對(duì)照患者(G1組)和來(lái)自有風(fēng)險(xiǎn)患者(G3組)的鍛煉測(cè)試之前收集的尿樣本的蛋白質(zhì)圖譜，即G1G3比較來(lái)鑒定。G4組(在鍛煉測(cè)試后收集的有患DN風(fēng)險(xiǎn)的糖尿病患者的尿樣本)反映在鍛煉測(cè)試之前沒(méi)有差異但在鍛煉測(cè)試后優(yōu)差異的生物標(biāo)志物。通過(guò)比較鍛煉測(cè)試后從對(duì)照患者(G2組)和有風(fēng)險(xiǎn)患者(G4組)收集的尿樣本的蛋白質(zhì)圖譜，即G2G4比較，揭示這些生物標(biāo)志物。G2G4與G1G3比較的交集反映了DN早期診斷的候選生物標(biāo)志物，其在鍛煉前后有差異。此外，由于在鍛煉測(cè)試后收集，G4組反映了“風(fēng)險(xiǎn)患者的鍛煉蛋白質(zhì)組”。通過(guò)比較從鍛煉測(cè)試前的風(fēng)險(xiǎn)患者(G3組)收集的尿樣本與鍛煉后相同患者(G4組)收集的尿樣本的蛋白質(zhì)圖譜，即G3G4比較，突出顯示該蛋白質(zhì)組。表5：每組尿樣本(G1-G4)和它們之間的比較反映特定蛋白質(zhì)組并顯示DN的生物標(biāo)志物進(jìn)行G1G3，G2G4，G1G2和G3G4四個(gè)比較以選擇蛋白質(zhì)表達(dá)中潛在的信息差異。施加幾個(gè)嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)以選擇用于進(jìn)一步分析的蛋白質(zhì)點(diǎn)。首先，如果對(duì)于每個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(代表7個(gè)統(tǒng)計(jì)測(cè)試的貢獻(xiàn))計(jì)算的總分?jǐn)?shù)大于或等于2，則認(rèn)為蛋白質(zhì)表達(dá)的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(參見(jiàn)材料與方法部分中的統(tǒng)計(jì)分析)。第二，差異蛋白質(zhì)點(diǎn)應(yīng)當(dāng)存在于來(lái)自一組與另一組相比至少50％的凝膠中。第三，消除了對(duì)應(yīng)于白蛋白的蛋白質(zhì)點(diǎn)(在G2G4和G3G4比較中)。這些分析導(dǎo)致總共177個(gè)顯示不同強(qiáng)度的蛋白質(zhì)點(diǎn)。這些蛋白質(zhì)點(diǎn)源自如下的不同比較：通過(guò)比較對(duì)照隊(duì)列與有風(fēng)險(xiǎn)隊(duì)列來(lái)檢測(cè)早期DN生物標(biāo)志物：-在鍛煉測(cè)試之前，即G1G3比較：14個(gè)點(diǎn)，包括G3中8個(gè)上調(diào)點(diǎn)和6個(gè)下調(diào)點(diǎn)-鍛煉測(cè)試后，即G2G4比較：156個(gè)點(diǎn)，包括G4中104個(gè)上調(diào)點(diǎn)和52個(gè)下調(diào)點(diǎn)。通過(guò)比較來(lái)自同一隊(duì)列在鍛煉測(cè)試前后的樣本，鑒定對(duì)照和有風(fēng)險(xiǎn)的糖尿病患者的鍛煉蛋白質(zhì)組：-在對(duì)照隊(duì)列中，即G1G2比較：5個(gè)點(diǎn)，包括G2中2個(gè)上調(diào)點(diǎn)和3個(gè)下調(diào)點(diǎn)-在有風(fēng)險(xiǎn)隊(duì)列中，即G3G4比較：101個(gè)點(diǎn)，包括G4中72個(gè)上調(diào)點(diǎn)和29個(gè)下調(diào)點(diǎn)?？傊瑢?duì)照隊(duì)列與有風(fēng)險(xiǎn)隊(duì)列組之間在鍛煉測(cè)試之后(G2G4比較)的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的數(shù)目，高于鍛煉測(cè)試之前(G1G3比較)的，表明鍛煉對(duì)有患DN風(fēng)險(xiǎn)的糖尿病患者的蛋白質(zhì)尿排泄有不同的影響。G1G3比較顯示正常白蛋白尿患者之間不進(jìn)行鍛煉測(cè)試的早期候選生物標(biāo)志物DN。只有三個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在G1G3比較中呈特異性，其他的在G2G4、G3G4和G1G2比較中也有發(fā)現(xiàn)。對(duì)照患者的鍛煉蛋白質(zhì)組較小(G1G2比較)，只有5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)差異表達(dá)。相反，有風(fēng)險(xiǎn)患者的鍛煉蛋白質(zhì)組較大，101個(gè)差異點(diǎn)被表達(dá)(G3G4比較)。在不同比較之間存在重疊的一些點(diǎn)。引起更多注意的四組差異點(diǎn)是：-在G1G3和G2G4比較之間共享的12個(gè)點(diǎn)集合。因此，這些點(diǎn)在對(duì)照患者和有風(fēng)險(xiǎn)患者隊(duì)列之間在鍛煉之前和之后差異表達(dá)；-對(duì)于G2G4比較來(lái)說(shuō)特定的一組58個(gè)點(diǎn)；它們?cè)阱憻挏y(cè)試后在對(duì)照患者和有風(fēng)險(xiǎn)患者之間差異表達(dá)；-對(duì)于G3G4比較來(lái)說(shuō)特定的一組38個(gè)點(diǎn)；它們?cè)阱憻挏y(cè)試前后有風(fēng)險(xiǎn)患者鍛煉采集的尿樣本之間差異表達(dá)。這些點(diǎn)組在其不同比較中的統(tǒng)計(jì)AUCROC值的圖表顯示大多數(shù)點(diǎn)具有大于0.75的AUC。有趣的是，兩個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)對(duì)G1G3比較來(lái)說(shuō)是特異性的，因?yàn)閮蓚€(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)對(duì)G1G2比較來(lái)說(shuō)特異性的。在G1G3、G2G4和G3G4比較之間共享的另外兩個(gè)點(diǎn)。作為該組80個(gè)點(diǎn)的這些點(diǎn)是候選生物標(biāo)志物以及有風(fēng)險(xiǎn)患者的鍛煉蛋白質(zhì)組的一部分，這解釋了它們的潛在診斷利益。實(shí)施例4：差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定在所有比較中顯著差異的大多數(shù)點(diǎn)是從凝膠中提取的，用胰蛋白酶消化，并準(zhǔn)備用于質(zhì)譜(MS)分析。這些點(diǎn)通過(guò)NanoLC-MS/MS鑒定。被鑒定蛋白質(zhì)的總數(shù)為73。所有這些蛋白質(zhì)存在于由本發(fā)明人構(gòu)建的DUP數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://www.sysdiag.cnrs.fr//index.php？page＝dup)，并且其含有在19個(gè)出版物(版本20110210)中的人正常尿的蛋白質(zhì)組分析中描述的超過(guò)3000種非冗余尿蛋白。從統(tǒng)計(jì)和功能分析，選擇38個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，其對(duì)應(yīng)于通過(guò)質(zhì)譜法鑒定的24種不同蛋白質(zhì)。這24種蛋白質(zhì)在2D-GE上的表達(dá)水平(上調(diào)或下調(diào))和分子量總結(jié)在表6中。所有蛋白質(zhì)在有風(fēng)險(xiǎn)患者(G4組)和對(duì)照患者(G2組)鍛煉后的尿液中差異表達(dá)。碳酸酐酶-1(CA1)、血漿蛋白酶C1抑制劑(SERPING1)、谷氨酰胺?；沫h(huán)轉(zhuǎn)移酶(QPCT)、蛋白質(zhì)AMBP、鋅-α-2-糖蛋白(AZGP1)和CD59糖蛋白(CD59)在鍛煉前的尿液(G1G3比較)中也是差異表達(dá)。內(nèi)皮蛋白質(zhì)C受體(EPCR)是在有風(fēng)險(xiǎn)患者(G3組)和對(duì)照患者(G1組)的鍛煉前的尿液中差異表達(dá)的唯一蛋白質(zhì)(表6)。表6：對(duì)照患者和有風(fēng)險(xiǎn)患者在2D-GE比較中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。從對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)片段或全長(zhǎng)并且在一個(gè)或多個(gè)比較中是差異性的一個(gè)或幾個(gè)點(diǎn)中鑒定各蛋白質(zhì)。實(shí)施例6：通過(guò)在經(jīng)處理、濃縮的尿液上進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白質(zhì)組分析的確認(rèn)為了驗(yàn)證通過(guò)2D-GE方法獲得的結(jié)果并驗(yàn)證從LC-MS/MS分析的結(jié)果推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)特性，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析19個(gè)潛在DN標(biāo)志物的表達(dá)水平。與G2組相比，蛋白C抑制劑(SerpinA5)、CD59糖蛋白(CD59)、四連接素(CLEC3B)在G4組減少，證實(shí)了蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)。具有70kDa分子量的凝血酶原或凝血因子II(F2)通過(guò)蛋白水解裂解被活化，使得形成活化肽片段1和2(F1.2)(31kDa)和活性凝血酶(F2a)(37kDa)。F1.2是體內(nèi)凝血酶生成指數(shù)，隨著每個(gè)凝血酶分子的生成而釋放一個(gè)分子的F1.2。使用的抗體針對(duì)靠近F1.2的N末端映射的氨基酸。與G2相比，G4組中70kDa的凝血酶原增加，與在相同比較中降低的31kDa的裂解的F1.2不同。這表明G4組中活性凝血酶減少。G4組中的α-1-抗胰蛋白酶(SerpinA1)、抗凝血酶-III(SerpinC1)，碳酸酐酶(CA1)和膠原蛋白α-1(I)鏈(COL1A1)的蛋白豐度比G2相高。已經(jīng)被鑒定為G1和G3組之間有差異的CA1未被蛋白質(zhì)印跡證實(shí)，因?yàn)槠鋬H在G3組4個(gè)樣本的2個(gè)中被發(fā)現(xiàn)。MASP2和HSPG2后來(lái)被驗(yàn)證。與G2相比，G4組中約20kDa的MASP2片段減少。HSPG2被裂解成2條鏈：血管生成抑制劑和LG3肽。G4組中的血管生成抑制劑高于G2組，與G3組相比，G4組中LG3肽減少。實(shí)施例7：通過(guò)在天然尿液上進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白質(zhì)組分析進(jìn)行確認(rèn)在2D-GE上的蛋白質(zhì)組學(xué)研究之后，10個(gè)生物標(biāo)志物分析(Western-Blot)在經(jīng)濃縮、處理的尿液上進(jìn)行驗(yàn)證。本發(fā)明人研究了天然尿樣本中這些生物標(biāo)志物的存在(即沒(méi)有經(jīng)過(guò)先前處理和未濃縮的尿樣本)。首先，分析20微升的每個(gè)尿樣本(樣本的總蛋白濃度是可變的(47.86至450.89微克/毫升))。在關(guān)注的10種生物標(biāo)志物中，在天然尿液的蛋白質(zhì)印跡中僅檢測(cè)到蛋白質(zhì)HSPG2(硫酸乙酰肝素蛋白多糖2)、Col1A1(膠原蛋白，I型，α1)、SerpinC1和F2(凝血酶原)。在相同樣本上進(jìn)行這四種生物標(biāo)志物的相對(duì)定量。將相同量的總蛋白(1.6微克)加載到SDS-PAGE凝膠上。獲得與在經(jīng)處理尿液中觀察到的相同差異(圖3)。與“對(duì)照”患者(G2)相比(圖3)，四種蛋白質(zhì)在有患糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)的患者(G4)中過(guò)表達(dá)。實(shí)施例8：通過(guò)在取自健康受試者和患有糖尿病性腎病的患者的尿樣本上進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)來(lái)確認(rèn)蛋白質(zhì)組分析這十種生物標(biāo)志物被選擇為腎病特異性而不是糖尿病特異性。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，對(duì)兩個(gè)其他受試者群體進(jìn)行十個(gè)生物標(biāo)志物的分析驗(yàn)證：i)像“對(duì)照”隊(duì)列(G1，G2)一樣表現(xiàn)的健康受試者，和ii)像“有風(fēng)險(xiǎn)”隊(duì)列(G3，G4)一樣表現(xiàn)的患有腎病的糖尿病患者。對(duì)取自這些不同組的患者的尿液進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。蛋白質(zhì)CD59、CLEC3B、SerpinA5和MASP2在有患腎病風(fēng)險(xiǎn)的糖尿病患者和患有腎病的糖尿病患者(微量白蛋白尿和大白蛋白尿患者)的尿液中低表達(dá)(圖4)。此外，在患有腎病的糖尿病患者的尿液中未檢測(cè)到蛋白質(zhì)MASP2(圖4)。對(duì)于某些生物標(biāo)志物，對(duì)于同組的患者獲得的信號(hào)不是同質(zhì)的。實(shí)際上，關(guān)于蛋白質(zhì)SerpinA5和MASP2，一名健康受試者(在兩種情況下不同)似乎具有比其他被研究的健康受試者更低量的被分析生物標(biāo)志物。蛋白質(zhì)HSPG2和F2在有患糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)的糖尿病患者和患有腎病的糖尿病患者的尿液中過(guò)表達(dá)(圖4)。從一名患有腎病的糖尿病患者獲得的信號(hào)低于相同組的其他患者。在另外兩隊(duì)列患者中驗(yàn)證了六種生物標(biāo)志物：CD59、CLEC3B、SerpinA5、MASP2、HSPG2和F2。蛋白質(zhì)表達(dá)的變化在健康受試者與“對(duì)照”隊(duì)列的患者之間，以及在“有風(fēng)險(xiǎn)”隊(duì)列的患者和患有腎病的糖尿病患者之間是可比的，表明這六種生物標(biāo)志物對(duì)腎病具有特異性而對(duì)糖尿病無(wú)特異性。實(shí)施例9：?jiǎn)我粯?biāo)志物或兩種標(biāo)志物組合的診斷性能使用受試者工作特征(ROC)分析來(lái)評(píng)估根據(jù)本發(fā)明的選定蛋白質(zhì)在體育鍛煉前的對(duì)照患者和有患糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)患者(G1與G3)之間的2D-GE比較中的診斷性能(表7)。ROC曲線是對(duì)于各種數(shù)值測(cè)試的靈敏性(Se)和特異性(Sp)之間的倒數(shù)關(guān)系的圖形可視化。標(biāo)志物AUCROC閾值Sp(％)Se(％)VPP(％)VPN(％)CI95％CA10.8751093379583.391.784.690.9[0.713；1.000]CD590.792-13807754391.775.090.078.6[0.583；1.000]AMBP0.771-1436514191.766.788.973.3[0.567；0.975]QPCT0.764-558961283.375.081.876.9[0.560；0.968]表7：G1與G3比較中單個(gè)標(biāo)志物的診斷性能的實(shí)施例。AUCROC：ROC曲線下面積；閾值：表示為2D-GE相對(duì)強(qiáng)度，由Youden指數(shù)選擇；Se：靈敏性；Sp：特異性；PPV：陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(測(cè)量被正確診斷的陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果的受試者的比例)；NPV：陰性預(yù)測(cè)值(測(cè)量被正確診斷的陰性測(cè)試結(jié)果的受試者的比例)；CI95％：95％置信區(qū)間。當(dāng)比較體育鍛煉前對(duì)照患者與有患糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)的患者時(shí)，mROC方法的多變量分析顯著改善了AUC。例如關(guān)聯(lián)CA1至CD59、CA1至AMBP、CA1至QPCT、CD59至QPCT、CD59至AMPBP等的標(biāo)志物組合，如表8所報(bào)告的較高的敏感性和特異性，具有患糖尿病性腎病較高風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)值。結(jié)合兩個(gè)標(biāo)志物的統(tǒng)計(jì)分析產(chǎn)生了一系列決策規(guī)則；如表9和圖5所示，計(jì)算每個(gè)組合的新的虛擬標(biāo)志物(Z)?；趦蓚€(gè)標(biāo)志物的組合，虛擬標(biāo)志物將來(lái)自多變量條件的標(biāo)志物轉(zhuǎn)換為單變量設(shè)置，利用p-值<0.01顯著地區(qū)分體育鍛煉之前的對(duì)照患者與有患糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)的患者。標(biāo)志物組合AUCROC閾值Sp(％)Se(％)VPP(％)VPN(％)CI95％CA1+CD590.882-0.225683.383.383.383.3[0.738；1.000]CA1+AMBP0.9310.9028100.075.0100.080.0[0.835；1.000]CA1+QPCT0.917-0.462975.0100.080.0100.0[0.807；1.000]CD59+QPCT0.847-3.507583.375.081.876.9[0.691；1.000]CD59+AMBP0.833-2.737666.7100.075.0100.0[0.663；1.000]表8：G1與G3比較中兩種標(biāo)志物組合的診斷性能(mROC方法)的實(shí)施例。AUCROC：ROC曲線下面積；閾值：表示為2D-GE相對(duì)強(qiáng)度，由Youden指數(shù)選擇；Se：靈敏性；Sp：特異性；PPV：陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(測(cè)量被正確診斷的陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果的受試者的比例)；NPV：陰性預(yù)測(cè)值(測(cè)量被正確診斷的陰性測(cè)試結(jié)果的受試者的比例)；CI95％：95％置信區(qū)間。標(biāo)志物組合Z＝a1x[標(biāo)志物1]+a2x[標(biāo)志物2]CA1+CD59Z＝+(1,56361513356411e-07)x[CA1]-(1,01677256583679e-08)x[CD59]CA1+AMBPZ＝+(1,35230449215072e-07)x[CA1]-(4,18637841481153e-08)x[AMBP]CA1+QPCTZ＝+(1,24848530852367e-07)x[CA1]-(9,75979899375066e-07)x[QPCT]CD59+QPCTZ＝-(1,36301781949143e-08)x[CD59]-(1,14127754739464e-06)x[QPCT]CD59+AMBPZ＝-(1,0745556660865e-08)x[CD59]-(3,39944153133327e-08)x[AMBP]表9：用于兩種標(biāo)志物組合(mROC方法)的ROC曲線的AUC最大化的a1和a2系數(shù)的實(shí)施例。使用受試者工作特征(ROC)分析來(lái)評(píng)估根據(jù)本發(fā)明的選定蛋白質(zhì)在體育鍛煉后的對(duì)照患者和有患糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)患者(G2與G4)之間的2D-GE比較中的診斷性能(表10)。ROC曲線是對(duì)于各種數(shù)值測(cè)試的靈敏性(Se)和特異性(Sp)之間的倒數(shù)關(guān)系的圖形可視化。表10：G2與G4比較中單個(gè)標(biāo)志物的診斷性能的實(shí)施例。AUCROC：ROC曲線下面積；閾值：表示為2D-GE相對(duì)強(qiáng)度，由Youden指數(shù)選擇；Se：靈敏性；Sp：特異性；PPV：陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(測(cè)量被正確診斷的陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果的受試者的比例)；NPV：陰性預(yù)測(cè)值(測(cè)量被正確診斷的陰性測(cè)試結(jié)果的受試者的比例)；CI95％：95％置信區(qū)間。當(dāng)比較體育鍛煉后對(duì)照患者與有患糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)的患者時(shí)，mROC方法的多變量分析顯著改善了AUC。例如關(guān)聯(lián)CLE3B至ENO1、SERPINA5至AZGP1,SERPINA5至SERPINA1,CLEC3B至CD59的標(biāo)志物組合，如表11所報(bào)告的較高的敏感性和特異性，具有患糖尿病性腎病較高風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)值。結(jié)合兩個(gè)標(biāo)志物的統(tǒng)計(jì)分析產(chǎn)生了一系列決策規(guī)則；如表12和圖5所示，計(jì)算每個(gè)組合的新的虛擬標(biāo)志物(Z)?；趦蓚€(gè)標(biāo)志物的組合，虛擬標(biāo)志物將來(lái)自多變量條件的標(biāo)志物轉(zhuǎn)換為單變量設(shè)置，利用p-值<0.001顯著地區(qū)別體育鍛煉之后的對(duì)照患者與有患糖尿病性腎病風(fēng)險(xiǎn)的患者。表11：G2與G4比較中兩種標(biāo)志物組合的診斷性能(mROC方法)的實(shí)施例。AUCROC：ROC曲線下面積；閾值：表示為2D-GE相對(duì)強(qiáng)度，由Youden指數(shù)選擇；Se：靈敏性；Sp：特異性；PPV：陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(測(cè)量被正確診斷的陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果的受試者的比例)；NPV：陰性預(yù)測(cè)值(測(cè)量被正確診斷的陰性測(cè)試結(jié)果的受試者的比例)；CI95％：95％置信區(qū)間。表12：兩種標(biāo)志物組合的決策規(guī)則(mROC方法)的實(shí)施例。實(shí)施例10：討論為了在尿樣本中搜索早期DN生物標(biāo)志物候選物，進(jìn)行了2D-GE分析，其是一種用于分析對(duì)照患者和有風(fēng)險(xiǎn)患者的尿蛋白質(zhì)組之間的差異的精確的半定量比較方法，。在鍛煉測(cè)試前后，分別觀察到差異表達(dá)的14個(gè)和156個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。通過(guò)比較每個(gè)隊(duì)列中的鍛煉前和鍛煉后測(cè)試尿樣本(分別為G1G2和G3G4之間的比較)獲得對(duì)照患者和有風(fēng)險(xiǎn)的糖尿病患者的鍛煉蛋白質(zhì)組。在鍛煉后，有風(fēng)險(xiǎn)患者(101個(gè)不同點(diǎn))排泄的尿蛋白比對(duì)照患者(5個(gè)差異點(diǎn))排泄的尿蛋白存在更大的變異性。在被鑒定為潛在DN標(biāo)志物的蛋白質(zhì)中，10種通過(guò)蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證。G2G4比較中的許多差異點(diǎn)具有等于5的統(tǒng)計(jì)學(xué)總分，這意味著它們?cè)诘鞍踪|(zhì)表達(dá)中的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上非常顯著(在7個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試中)。因此這些蛋白質(zhì)具有潛在的臨床診斷價(jià)值。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3