本發(fā)明涉及藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及含中藥金雀根提取物藥物的質(zhì)量控制方法，所述的金雀根提取物作為抗骨質(zhì)疏松癥藥物；本方法中以金雀根中的三個(gè)代表性化學(xué)成分kobophenol A,(+)-α-viniferin及carasinol B為質(zhì)控指標(biāo)，用HPLC技術(shù)建立含金雀根提取物藥物的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨微觀結(jié)構(gòu)退化、脆性增加和易發(fā)生骨折為特征的一種全身性疾病。隨著人口老齡化的到來(lái)，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為嚴(yán)重的大眾健康問(wèn)題。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前全世界受到骨質(zhì)疏松癥困擾的中老年人約為2億人；僅中國(guó)就有超過(guò)5000萬(wàn)的骨質(zhì)疏松癥患者，在50歲以上的人口中，骨質(zhì)疏松癥患者達(dá)到50％。
目前，針對(duì)骨質(zhì)疏松癥的藥物主要有以下5類(lèi)：一、抑制骨吸收為主的骨吸收抑制劑，如雌激素、雙膦酸鹽和降鈣素等；第二類(lèi)是以促進(jìn)骨形成為主的骨形成促進(jìn)劑，如氟化物、甲狀旁腺激素等；第三類(lèi)是兼有抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成藥物，如依普黃酮、維生素K、鍶鹽等；第四類(lèi)是骨礦化作用藥物，如鈣劑和維生素D活化劑；第五類(lèi)是中藥制劑，如仙靈骨葆膠囊、強(qiáng)骨膠囊、續(xù)斷壯骨膠囊等。上述藥物中，中藥制劑因其毒副作用較小，價(jià)格相對(duì)便宜，而且往往具有多作用靶點(diǎn)的特點(diǎn)，因此受到越來(lái)越多的關(guān)注。本申請(qǐng)的前期研究工作證實(shí)，金雀根提取物可以明顯增加去卵巢大鼠的股骨骨密度、骨小梁面積及骨量，可以用于骨質(zhì)疏松癥的治療。然而，傳統(tǒng)中藥由于成分復(fù)雜，使其制劑存在一定的可控性、穩(wěn)定性的困擾，這也是中醫(yī)藥國(guó)際化的難題之一。
本申請(qǐng)的發(fā)明人基于長(zhǎng)期以來(lái)研究實(shí)踐，擬提供用于抗骨質(zhì)疏松的金雀根提取物的質(zhì)量控制方法，以保證金雀根提取物中有效成分的含量水平，從而保持其藥理作用的穩(wěn)定。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種含金雀根提取物藥物的質(zhì)量控制方法，以保證金雀根提取物中有效成分的含量水平，從而保持其藥理作用的穩(wěn)定。
本方法中采用HPLC技術(shù)，以式(Ⅰ)所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)式kobophenol A、(+)-α-viniferin及carasinol B為代表性成分指標(biāo)，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，當(dāng)金雀根提取物中該三種組分的質(zhì)量百分比之和不小于50％時(shí)，在口服劑量為2.2～8.8mg/kg/天時(shí)，即可科學(xué)、可靠、簡(jiǎn)便的控制含金雀根提取物藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而可獲得理想的抗骨質(zhì)疏松的藥物效果。
本發(fā)明對(duì)經(jīng)系統(tǒng)研究并鑒定獲得的金雀根提取物的69個(gè)化合物化學(xué)成分進(jìn)行體外生物活性研究，結(jié)果顯示，其中的化學(xué)成分kobophenol A、(+)-α-viniferin及carasinol B具有刺激成骨細(xì)胞，抑制破骨細(xì)胞的作用，是其活性成分；金雀根中的二苯乙烯類(lèi)化學(xué)成分發(fā)現(xiàn)有26種，是該植物中主要結(jié)構(gòu)類(lèi)型，kobophenol A、(+)-α-viniferin及carasinol B具有較大含量，且carasinol B為其專(zhuān)有成分；因此，本發(fā)明中選擇該三種成分作為質(zhì)控指標(biāo)，可以保證含金雀根提取物藥物中有效成分的含量水平，從而保持其藥理作用的穩(wěn)定。
具體而言，本發(fā)明的一種含金雀根提取物藥物的質(zhì)量控制方法，其特征在于，其包括，采用HPLC法，以式(Ⅰ)所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)式kobophenol A、(+)-α-viniferin及carasinol B為質(zhì)控指標(biāo)，用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，通過(guò)下述步驟：
設(shè)定色譜條件為：流動(dòng)相為甲醇-乙腈-pH緩沖液；本發(fā)明的實(shí)施例中，優(yōu)選流動(dòng)相配比為：甲醇-乙腈-pH緩沖液為19.5∶18.5∶62；柱溫30℃，流速1.0～1.5mL/min，進(jìn)樣量20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為250～350nm，本發(fā)明中，優(yōu)選284nm波長(zhǎng)；
制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：
分別制備不同濃度kobophenol A標(biāo)準(zhǔn)液，(+)-α-viniferin和carasinol B標(biāo)準(zhǔn)液，將各標(biāo)準(zhǔn)液在所述色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，得各濃度標(biāo)準(zhǔn)液樣品所對(duì)應(yīng)的峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，制作kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1所示)；
測(cè)定金雀根提取物有效成分的含量，
根據(jù)kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算其在金雀根提取物中的質(zhì)量百分比。
本發(fā)明中，當(dāng)金雀根提取物中所述三種組分的質(zhì)量百分比之和不小于50％時(shí)，在口服劑量為2.2～8.8mg/kg/天時(shí)，即為含金雀根提取物藥物的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而可獲得理想的抗骨質(zhì)疏松的藥物效果。
本發(fā)明中，采用儀器為：Agilent 1100高效液相色譜儀(美國(guó))；
本發(fā)明中，采用化學(xué)試劑為：甲醇、乙腈(色譜純)(購(gòu)自Dikma公司)；蒸餾水購(gòu)自Milli-Q系統(tǒng)(Millipore Corporation,美國(guó))；無(wú)水乙酸鈉、乙酸乙酯和乙醇(分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；冰醋酸(分析純)購(gòu)自上海試劑一廠；實(shí)驗(yàn)材料為：對(duì)照品kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B從金雀根中分離純化，HPLC純度均大于99％。
本發(fā)明中，通過(guò)下述方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：
標(biāo)準(zhǔn)品kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B精密稱(chēng)重并用流動(dòng)相分別定容至容量瓶中，然后依次等倍稀釋?zhuān)胟obophenol A標(biāo)準(zhǔn)液，濃度依次為800、400、200、100、50、12.5μg/mL；(+)-α-viniferin和carasinol B標(biāo)準(zhǔn)液，濃度依次為320、160、80、40、20、10μg/mL。將各標(biāo)準(zhǔn)液在上述色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，得各濃度樣品所對(duì)應(yīng)的峰面積，然后以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)制作kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B的標(biāo) 準(zhǔn)曲線(如圖1所示)。
本發(fā)明中，通過(guò)精密度考察、準(zhǔn)確度考察及穩(wěn)定性考察證實(shí)了該方法的可靠性；
本發(fā)明中，對(duì)式(Ⅰ)所示結(jié)構(gòu)式的kobophenol A、(+)-α-viniferin及carasinol B進(jìn)行了試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示：
化學(xué)成分kobophenol A、(+)-α-viniferin及carasinol B在0.01μg/mL可分別刺激大鼠第二繼代成骨細(xì)胞增殖12.5％，11.8％和10％，是金雀根提取物中活性成分(培養(yǎng)成骨細(xì)胞以6×103/cm2密度接種于6孔塑料培養(yǎng)板，24h后加入待測(cè)樣品，于7％NCS-MEM(GIBCO)培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時(shí)，然后用MTT法測(cè)定)；而且從化學(xué)結(jié)構(gòu)的類(lèi)型而言，它們都屬于天然產(chǎn)物中一種較為特征的二苯乙烯類(lèi)成分，其分布具有一定的種屬特異性，尤其是化合物carasinol B，是金雀根中獨(dú)特的化學(xué)成分，至今尚未在其它天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明選擇這三個(gè)化學(xué)成分為指標(biāo)，既確保了金雀根提取物化學(xué)成分組成的相對(duì)恒定，并進(jìn)一步保證了其抗骨質(zhì)疏松作用的有效性。
本發(fā)明經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的分析方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確和可靠，測(cè)得的金雀根提取物中kobophenol A、(+)-α-viniferin及carasinol B為代表性成分，該三種組分的質(zhì)量百分比之和不小于50％時(shí)，可作為抗骨質(zhì)疏松金雀根提取物藥物的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明中，還可采用UPLC法、毛細(xì)管電泳法等類(lèi)似方法，以式(Ⅰ)所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)式kobophenol A、(+)-α-viniferin及carasinol B為質(zhì)控指標(biāo)，用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。
附圖說(shuō)明
圖1為kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但這些實(shí)施例絕非對(duì)本發(fā)明有任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說(shuō)明書(shū)的啟示下對(duì)本發(fā)明實(shí)施中所作的任何變動(dòng)都將 落在權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1
儀器：Agilent 1100高效液相色譜儀(美國(guó))；
化學(xué)試劑：甲醇、乙腈(色譜純)均來(lái)自Dikma公司；蒸餾水來(lái)自Milli-Q系統(tǒng)(Millipore Corporation,美國(guó))；無(wú)水乙酸鈉、乙酸乙酯和乙醇(分析純)來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；冰醋酸(分析純)來(lái)自上海試劑一廠；實(shí)驗(yàn)材料：對(duì)照品kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B從金雀根中分離純化，HPLC純度均大于99％；
色譜條件：ODS-2hypersil反相柱(5μm，150×4.6mm，Thermo Electron Corporation，美國(guó))；流動(dòng)相甲醇-乙腈-鄰苯二甲酸緩沖液(0.04M，pH 5.0)(19.5:18.5:62.0)；柱溫30℃；流速1.5mL/min；進(jìn)樣體積20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)284nm；
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：標(biāo)準(zhǔn)品kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B精密稱(chēng)重并用流動(dòng)相分別定容至容量瓶中，然后依次等倍稀釋?zhuān)胟obophenol A標(biāo)準(zhǔn)液，濃度依次為800、400、200、100、50、12.5μg/mL；(+)-α-viniferin和carasinol B標(biāo)準(zhǔn)液，濃度依次為320、160、80、40、20、10μg/mL；將各標(biāo)準(zhǔn)液在上述色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，得各濃度樣品所對(duì)應(yīng)的峰面積，然后以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)制作kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1所示)；經(jīng)精密度考察、準(zhǔn)確度考察及穩(wěn)定性考察證實(shí)所述方法的可靠性；
金雀根提取物有效成分的含量測(cè)定，根據(jù)kobophenol A、(+)-α-viniferin和carasinol B的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算其在金雀根提取物中的質(zhì)量百分比；確定金雀根提取物三者百分含量之和須不低于金雀根提取物50％時(shí)，為適宜作為抗骨質(zhì)疏松藥物。