本發(fā)明涉及一種水稻脆性的定量檢測方法，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

眾所周知，莖稈強度是植物機械強度的外在直接體現(xiàn)者，而莖稈性狀則是影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，也是篩選抗倒伏水稻品種的主要考察性狀。脆莖突變是指植物莖稈脆性增加，通常是根、莖、葉、莖節(jié)等器官呈現(xiàn)脆性增加、易折的表型，是植物中一類比較常見的突變類型，該突變在水稻、擬南芥、玉米和大麥等植物中均有報道過。與野生型相比，脆性突變體普遍具有纖維素含量降低、木質(zhì)素含量增加、細胞壁結(jié)構(gòu)組成改變等顯著特點，有利于選育“糧-飼”兼用稻，即既可以收獲糧食，又能將稻稈作為飼料資源用于畜牧養(yǎng)殖，還能減少稻稈焚燒造成的環(huán)境污染。

而近幾年來，隨著農(nóng)村經(jīng)濟的發(fā)展、技術(shù)進步以及農(nóng)民生活條件的改善，曾經(jīng)被農(nóng)民廣泛用作燃料、飼料和肥料的水稻秸稈失去了往日的利用優(yōu)勢，大量水稻秸稈被焚燒，這不僅造成嚴重的環(huán)境污染，還能直接燒死、燙死土壤中的有益微生物，影響農(nóng)作物對土壤養(yǎng)分的充分吸收，破壞土壤的結(jié)構(gòu)，造成耕地質(zhì)量的下降。目前，已有部分地區(qū)開展水稻秸稈還田試驗，但普通水稻秸稈柔韌，機械難以粉碎，機收后如果不加處理，秸稈長期不腐解，秸稈還田效果較差。另外一方面，現(xiàn)有水稻良種莖稈的細胞壁結(jié)構(gòu)非常致密、秸稈品質(zhì)差、營養(yǎng)成分含量低，而稻草的前處理操作復(fù)雜、成本高且效果不佳，限制了其在畜牧生產(chǎn)上的應(yīng)用，使得水稻秸稈被農(nóng)民朋友也將之看成一大障礙，與傳統(tǒng)水稻相比，脆莖水稻品種最主要特點是莖稈機械強度低，秸稈細胞壁厚度和纖維素含量下降，同時半纖維素、木質(zhì)素含量上升，營養(yǎng)價值提高，并且適口性好。因此，脆莖水稻品種不僅容易被粉碎，而且還可以作為動物飼料直接進行回收利用。中科院合肥物質(zhì)研究院對離子束誘變獲得的脆性突變體開展了田間生產(chǎn)試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有生長能力強、脆而抗倒的特點，秸稈易粉碎，適宜家畜飼用，并且產(chǎn)量增加5%左右。中國水稻研究所采用輻射誘變技術(shù)獲得1株水稻脆稈突變體fp1，培育出粗纖維含量比較低的常規(guī)水稻品系嫩稻1號，粗蛋白質(zhì)含量提高了60%，粗脂肪含量增加了一倍，可取代一定數(shù)量的玉米干粉用于育肥階段瘦弱豬的飼料混配。汪海峰等將脆莖水稻全株應(yīng)用到生長肥育豬口糧的試驗中，結(jié)果顯示脆莖水稻飼料降低了豬體內(nèi)的脂肪沉積，從而能提高胴體瘦肉率，使得胴體長度增加。福建農(nóng)林大學(xué)通過常規(guī)育種的方法，選育出稻谷產(chǎn)量較高、至成熟期莖葉仍能保持綠色、稻草蛋白質(zhì)含量顯著提高的谷稈兩用稻東南201、202，用于豬、魚等的飼養(yǎng)試驗，取得了極佳的效果。

水稻脆性性狀的研究，對于糧食產(chǎn)量安全、分子育種及飼料新能源等應(yīng)用都意義重大。近年來，許多水稻脆性突變體材料的發(fā)現(xiàn)，目前報道的與水稻脆性性狀相關(guān)的基因主要有BC1-8、BC10-12、BC14-15等，大部分都已得到精細定位。其中BC7、BC11位于第1染色體，BC3、BC5、BC14位于第2染色體，BC1位于第3染色體，BC2、BCIO位于第5染色體，BC4位于第6染色體，BC8位于第7染色體，BC6、BC12、BC15位于第9染色體。脆莖突變基因的定位和克隆為研究水稻次生細胞壁形成的分子機理、結(jié)構(gòu)組成和植株機械強度的調(diào)控途徑等發(fā)揮了重要作用。研究者對大量水稻脆性性狀形成的分子機理、基因定位與克隆、脆性基因的遺傳分析等方面進行了深入研究，取得了一些顯著的進展。研究發(fā)現(xiàn)，脆莖突變水稻的莖稈及其他組織器官主要由于細胞壁脆性改變。植物細胞壁的結(jié)構(gòu)和成分與莖稈的機械強度直接相關(guān)，脆莖突變植物細胞壁厚度減小、纖維素含量降低是導(dǎo)致其脆性增加的最直接的原因。研究發(fā)現(xiàn)，脆莖突變體水稻的粗纖維含量顯著低于野生型水稻。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，脆莖突變體水稻的維管束內(nèi)纖維細胞細胞壁比野生型對照薄，表皮細胞外的硅質(zhì)也顯著減少；對比不同生長時期、不同組織器官的脆性，脆莖水稻在不同生長時期、不同組織器官其脆性均有顯著的存在。正是由于水稻脆性性狀具有廣闊的市場價值和生態(tài)價值，脆性性狀己引起研究者的重視，進行了一系列脆性基因功能與分子調(diào)控機理研究并取得了顯著的進展。水稻脆性性狀相關(guān)基因BC1、BC3、BC6、BC7、BCIO-12、BC14、BC15等的功能均已得到明確解析，分子機理研究表明水稻脆性基因大多數(shù)通過編碼各種代謝酶類，尤其是纖維素代謝酶類來發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的，但錯綜復(fù)雜的調(diào)控途徑還需深入解析。

然而，雖然水稻脆性性狀的研究，與糧食產(chǎn)量安全、稻米品質(zhì)改良、分子育種、開發(fā)飼料新能源等方面都意義重大，但迄今為止，還沒有出現(xiàn)大面積推廣的脆莖水稻品種，其主要原因還是水稻脆性基因是數(shù)量性狀遺傳控制的，各脆性突變體雖然表現(xiàn)顯著，但大都是單基因突變，單基因脆性突變體的表現(xiàn)型也各不相同。比如水稻脆性突變材料的飼用，雖然營養(yǎng)價值、牲畜適口性均提高，機械加工性能增強，抵抗反芻動物消化的硅質(zhì)層破碎效果得到改良，但是目前的各脆性突變體水稻秸稈還不能完全作為青儲飼料，也不能全部采用脆性水稻秸稈作為牲畜飼料。因此，雖然脆性水稻飼用的研究表明其巨大的產(chǎn)業(yè)潛值，但是還要繼續(xù)加大脆莖性狀的基因定位開發(fā)和數(shù)量性狀的聚合，進一步增強脆性水稻飼用性能、機械粉碎性能，才能真正發(fā)揮其廣闊的市場價值和生態(tài)價值。

雖然脆莖水稻的性狀很容易和其他常規(guī)水稻品種進行定性區(qū)別，只要用手掰折莖稈或葉片，就能直觀判斷，但是脆性程度卻無法定量統(tǒng)計，這給多基因脆性突變體的基因定位和脆性基因的多基因聚合育種過程中帶來了困擾。脆性數(shù)量基因聚合育種中尤其需要鑒別脆性水稻的表型差異度，以確定脆性基因聚合程度。脆性表型定量檢測方法的建立將給脆性基因聚合育種帶來極大的便利和輔助，同時也大大減少分子檢測勞動力和費用，節(jié)約成本。

利用本方法定量評價水稻脆性突變體的脆性表型，既可以解決脆性多基因突變體基因定位和脆性基因聚合育種中脆性表型差異度甄別方法的難題，又可以節(jié)約分子檢測的勞動力和成本，實現(xiàn)了水稻脆性表型的定量檢測。這一鑒定方法除了可以應(yīng)用于水稻脆性表型評價、脆性特種水稻育種外，亦可以應(yīng)用于脆性基因定位的表型鑒定和脆性基因遺傳規(guī)律研究等眾多領(lǐng)域。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對脆性水稻多基因突變體的基因定位和多基因聚合育種中數(shù)量性狀的甄別僅有常規(guī)的定性鑒定而缺乏定量檢測方法，提供一種水稻脆性的定量檢測方法，該定量檢測方法通過鑒別脆性材料與普通品種差異度的最顯著的檢測器官、部位和檢測時期，通過特定的前處理手段和檢測方法，最終通過具體的數(shù)值指標實現(xiàn)了對脆性水稻材料的表型差異度進行顯著而又準確的定量評價。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案解決的：

一種水稻脆性的定量檢測方法，其特征在于：通過選擇適當生育期的各脆性待檢測材料，進行預(yù)處理后，選擇特定的水稻器官和部位、采用特定的鑒定技術(shù)進行檢測，根據(jù)各脆性待檢測材料多重復(fù)的檢測均值作為量化評價該水稻脆性水平的數(shù)值指標。

所述的適當生育期的各脆性待檢測材料為水稻抽穗期的脆性待檢測材料，其具體獲取方法為：

2.1）水稻單株第一穗穗尖露出葉鞘1cm記為該單株抽穗，待該脆性待檢測材料大田抽穗單株的比例為30%-60%時，選擇抽穗單株比例與大田長勢相近的健壯植株，從根部整株挖取，洗凈根部泥土，晾干后冷藏于-20℃冰箱中，不同抽穗期的水稻材料依次取材，分類標記冷藏；

2.2）待抽穗期最遲的脆性待檢測材料取材冷藏一天后，同時取出各份材料，室溫自然解凍，去除每株第一穗穗尖露出葉鞘長度不足1cm的分蘗，即為水稻抽穗期的脆性待檢測材料。

所述的預(yù)處理方法為：剝除包裹水稻莖稈的稻葉，獲得裸露的水稻莖稈。

所述的特定的水稻器官為剝?nèi)~后裸露的水稻莖稈；所述的特定的部位為莖稈根基部以上第一節(jié)間中間位置。

所述的特定的鑒定技術(shù)為：采用穿刺儀器在各脆性待檢測材料的莖稈上進行同位置穿刺，并記錄每次穿刺刺穿瞬間的壓強值。

所述的穿刺儀器采用杭州托普儀器有限公司生產(chǎn)的YYD-1A型便攜式植物抗倒伏測定儀。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。

一種水稻脆性的定量檢測方法，該定量檢測鑒定方法的步驟如下：

（1）選擇水稻抽穗期的脆性待檢測材料，具體獲取方法為：1.1）水稻單株第一穗穗尖露出葉鞘1cm記為該單株抽穗，待該脆性待檢測材料大田抽穗單株的比例為30%-60%時，選擇抽穗單株比例與大田長勢相近的健壯植株，從根部整株挖取，洗凈根部泥土，晾干后冷藏于-20℃冰箱中，不同抽穗期的水稻材料依次取材，分類標記冷藏；1.2）待抽穗期最遲的脆性待檢測材料取材冷藏一天后，同時取出各份材料，室溫自然解凍，去除每株第一穗穗尖露出葉鞘長度不足1cm的分蘗，即為水稻抽穗期的脆性待檢測材料。（2）剝除包裹水稻莖稈的稻葉，獲得裸露的水稻莖稈。（3）采用杭州托普儀器有限公司生產(chǎn)的YYD-1A型便攜式植物抗倒伏測定儀，在各脆性待檢測材料的剝?nèi)~后裸露的水稻莖稈的根基部以上第一節(jié)間中間位置莖稈上進行同位置穿刺，并記錄每次穿刺刺穿瞬間的壓強值。（4）取各脆性待檢測材料多重復(fù)穿刺實驗的壓強值的平均值作為量化評價該水稻脆性水平的數(shù)值指標。

該定量檢測方法通過鑒別脆性材料與普通品種差異度的最顯著的檢測器官、部位和檢測時期，通過特定的前處理手段和檢測方法，最終通過具體的數(shù)值指標實現(xiàn)了對脆性水稻材料的表型差異度進行顯著而又準確的定量評價。

下面通過具體實施例來進一步說明本發(fā)明提供的水稻脆性的定量檢測方法。

實施例一新鮮冷藏的抽穗期脆莖突變體材料與常規(guī)水稻品種穿刺實驗與壓折實驗的對比

分別取新鮮冷藏的抽穗期脆莖突變體材料與常規(guī)水稻品種鎮(zhèn)稻88、連粳7號，分別進行了剝?nèi)~穿刺、非剝?nèi)~穿刺與壓折實驗，實驗儀器采用浙江托普儀器公司的YYD-1A型植物抗倒伏儀測量數(shù)據(jù)。實驗方法和結(jié)果分別如下：

穿刺實驗：分別取新鮮冷藏的抽穗期脆莖突變體材料與常規(guī)水稻品種鎮(zhèn)稻88、連粳7號進行非剝?nèi)~穿刺實驗、剝?nèi)~穿刺實驗，穿刺的具體位置限定為莖稈上鄰近根基部的第一莖間中間位置，選擇10根不同分蘗的新鮮莖稈進行同位置穿刺，記錄每次穿刺時該脆莖突變體材料刺穿瞬間的壓強值，單位為kPa；

壓折實驗：分別取新鮮冷藏的抽穗期的新鮮的脆莖突變體材料與常規(guī)水稻品種鎮(zhèn)稻88、連粳7號，選擇鄰近根基部的第一莖節(jié)起向上15cm長的莖段，將該莖段的兩端在一定高度架空，植物抗倒伏測定儀從莖段中間從上而下緩緩壓折，記錄折斷瞬間的受力值，單位為N；選擇10根不同分蘗的新鮮冷藏莖稈進行10次重復(fù)壓折實驗。

從壓折實驗可知，脆莖材料壓折瞬間受力為64.2N，而常規(guī)主栽品種鎮(zhèn)稻88、連粳7號壓折瞬間受力為79.0N和81.7N，這表明脆莖突變體材料抗壓能力要比對照品種鎮(zhèn)稻88、連粳7號略低，這反映了脆莖材料比常規(guī)品種抗倒伏能力有所下降，但是下降不是非常明顯，常規(guī)品種連粳7號抗倒伏能力高于鎮(zhèn)稻88。

分別取新鮮冷藏的抽穗期材料進行穿刺實驗，結(jié)果可知，脆莖材料未剝?nèi)~刺穿瞬間壓強值為122.9kPa，而常規(guī)主栽品種鎮(zhèn)稻88、連粳7號刺穿瞬間壓強值分別為166.5 kPa和169.6 kPa，表明脆莖突變體材料莖稈的硬度比對照品種鎮(zhèn)稻88、連粳7號顯著降低。計算壓折實驗和未剝?nèi)~穿刺實驗中脆莖材料和常規(guī)品種測量數(shù)值差異度，壓折實驗中，脆莖/鎮(zhèn)稻88=64.2/79.0=0.81，脆莖/連粳7號=64.2/81.7=0.79；而莖稈未剝?nèi)~穿刺實驗中，脆莖/鎮(zhèn)稻88=122.9/166.5=0.74，脆莖/連粳7號=122.9/169.6=0.72。由此可以發(fā)現(xiàn)，采用未剝?nèi)~穿刺實驗進行測量，脆莖材料與常規(guī)品種間的對比更加顯著，更有利于脆莖突變體材料定量檢測。

通過進一步的剝?nèi)~穿刺實驗發(fā)現(xiàn)，剝離莖稈外包稻葉后對莖稈的穿刺，脆莖/鎮(zhèn)稻88=61.3/105.9=0.58，脆莖/連粳7號=61.3/109.5=0.56，剝?nèi)~穿刺實驗中脆莖材料與常規(guī)品種間的對比更加顯著，所以采用剝?nèi)~穿刺實驗更有利于脆莖突變體材料的定量檢測。

另外分析剝?nèi)~穿刺與未剝?nèi)~穿刺的標準差發(fā)現(xiàn)，剝?nèi)~穿刺的標準差較未剝?nèi)~穿刺的標準差顯著降低，表明脆莖與常規(guī)品種莖稈的硬度比較穩(wěn)定，所以采用剝?nèi)~穿刺實驗更有利于脆莖突變體材料定量檢測。

實施例二新鮮冷藏的抽穗期脆莖突變體材料與常規(guī)水稻品種劍葉穿刺與剝?nèi)~莖稈穿刺的對比

分別取新鮮冷藏的抽穗期脆莖突變體材料與常規(guī)水稻品種鎮(zhèn)稻88、連粳7號，分別進行了同位置劍葉穿刺和剝?nèi)~莖稈穿刺實驗，實驗方案參照實施例一種的穿刺實驗方案，實驗結(jié)果如下表2所示。

計算劍葉穿刺和剝?nèi)~穿刺實驗中脆莖材料和常規(guī)品種測量數(shù)值差異度的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用劍葉穿刺，脆莖材料/鎮(zhèn)稻88=11.5/14.0=0.82，脆莖/連粳7號=11.5/14.7=0.78；而剝?nèi)~穿刺，脆莖/鎮(zhèn)稻88=0.53，脆莖/連粳7號=0.51，所以采用剝?nèi)~穿刺實驗比劍葉穿刺更有利于脆莖突變體材料的定量檢測。

實施例三不同時期新鮮冷藏的脆莖突變體材料與常規(guī)水稻品種剝?nèi)~莖稈穿刺的對比

分別取新鮮冷藏的分蘗期、抽穗期、完熟期的脆莖突變體材料與常規(guī)水稻品種鎮(zhèn)稻88、連粳7號進行同位置剝?nèi)~莖稈穿刺實驗，實驗方案參照實施例一，實驗結(jié)果如下表3所示。

通過新鮮冷藏的不同時期脆莖突變體材料與常規(guī)水稻品種剝?nèi)~莖稈穿刺對比實驗發(fā)現(xiàn)，分蘗期脆莖材料與常規(guī)品種的剝?nèi)~莖稈穿刺對比分別為39.8/61.6=0.65和39.8/62.3=0.64；抽穗期脆莖材料與常規(guī)品種的剝?nèi)~莖稈穿刺對比分別為0.53、0.51；完熟期脆莖材料與常規(guī)品種的剝?nèi)~莖稈穿刺對比分別為66.9/109.0=0.61和66.9/111.1=0.60。由此可以看出，抽穗期材料進行穿刺實驗，脆莖材料與常規(guī)品種間的對比更加顯著，更有利于脆莖突變體材料的定量檢測。

實施例四新鮮冷藏的完熟期不同節(jié)間脆莖突變體材料與常規(guī)水稻品種烘干后剝?nèi)~莖稈穿刺的對比

分別取新鮮冷藏的完熟期脆莖突變體材料與常規(guī)水稻品種鎮(zhèn)稻88、連粳7號的第一節(jié)間、第二節(jié)間、第三節(jié)間烘干后進行剝?nèi)~莖稈穿刺實驗，穿刺的具體位置限定為莖稈上鄰近根基部的第一莖節(jié)、第二莖節(jié)、第三莖節(jié)的中間位置，實驗儀器采用浙江托普儀器公司的YYD-1A型植物抗倒伏儀測量數(shù)據(jù)，記錄每次穿刺時該脆莖突變體材料刺穿瞬間的壓強值，單位為kPa；實驗結(jié)果如下表4所示。

由表4計算得知，不同節(jié)間脆莖突變體與常規(guī)品種的對比分別為：第一節(jié)間66.0/93.4=0.71，66.0/94.4=0.70；第二節(jié)間62.5/82.9=0.75，62.5/84.1=0.74；第三節(jié)間61.5/79.2=0.78，61.5/82.5=0.75。對比發(fā)現(xiàn)，采用第一節(jié)間進行剝?nèi)~測量，比采用更上部位剝?nèi)~測量，脆莖突變體與常規(guī)品種的對比略高，而又由于采用第一節(jié)間檢測的數(shù)值標準差相對后二者小，表明根基部第一節(jié)間莖稈硬度比較穩(wěn)定，更有利于脆莖突變體材料的定量檢測。

實施例五烘干處理與新鮮冷藏脆莖突變體材料與常規(guī)品種剝?nèi)~莖稈穿刺的對比

如表3中完熟期新鮮稻稈脆莖突變體材料與常規(guī)水稻品種剝?nèi)~莖稈穿刺中，脆莖材料與常規(guī)水稻品種剝?nèi)~莖稈穿刺對比分別為0.61和0.60；而如上表4烘干處理完熟期稻稈脆莖突變體材料與常規(guī)水稻品種剝?nèi)~莖稈穿刺中，脆莖材料與常規(guī)水稻品種剝?nèi)~莖稈穿刺對比分別為0.71和0.70。由此可以發(fā)現(xiàn)，采用新鮮材料進行穿刺實驗，脆莖材料與常規(guī)品種間的對比更加顯著，更有利于脆莖突變體材料的定量檢測。

由以上五個實施例可知，本發(fā)明所提供的水稻脆性的定量檢測方法能夠?qū)Υ嘈运镜谋硇筒町惗冗M行顯著而又準確的定量評價。

本發(fā)明通過選取抽穗期新鮮冷藏的脆莖突變體材料并剝除包裹莖稈的稻葉進行穿刺試驗，穿刺的部位限定后莖稈上鄰近根基部的第一莖節(jié)中間位置，在不同分蘗的新鮮冷藏莖稈上進行同位置穿刺并記錄每次穿刺時刺穿瞬間的壓強值，取上述壓強值的平均值作為量化評價該水稻脆性水平的數(shù)值指標；該鑒定方法用于評價水稻脆性表型，既可以解決脆性多基因突變體基因定位和脆性基因聚合育種中脆性表型差異度甄別方法的難題，又可以節(jié)約分子檢測的勞動力和成本，實現(xiàn)了水稻脆性表型的定量檢測；這一鑒定方法除了可以應(yīng)用于水稻脆性表型評價、脆性特種水稻育種外，亦可以應(yīng)用于脆性基因定位的表型鑒定和脆性基因遺傳規(guī)律研究等眾多領(lǐng)域。

以上實施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍，凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想，在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動，均落入本發(fā)明保護范圍之內(nèi)；本發(fā)明未涉及的技術(shù)均可通過現(xiàn)有技術(shù)加以實現(xiàn)。