本發(fā)明提供醬油渣蛋白質(zhì)的定向降解方法，包括兩步酶解法和微生物雙菌分步發(fā)酵法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
發(fā)明的
背景技術(shù)：
醬油渣是釀造醬油后產(chǎn)生的廢渣，我國(guó)是醬油生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，而生產(chǎn)醬油會(huì)產(chǎn)生大量的廢渣(每公斤醬油約產(chǎn)生0.67公斤的醬油渣)。醬油渣一般呈深棕色，其干基粗蛋白質(zhì)含量約25％、粗脂肪約9.7％、粗纖維約13.5％、灰分約10.5％，此外還含有豐富的異黃酮。由此可見，醬油渣中仍然含有大量的可再利用成分。但醬油渣的含水量高，微生物易生長(zhǎng)繁殖，不易貯藏，若不進(jìn)行及時(shí)處理會(huì)造成環(huán)境污染。目前低鹽固態(tài)醬油渣小部分作為肥料或飼料低價(jià)出售，產(chǎn)品附加值較低。高鹽稀態(tài)醬油渣常浸泡后當(dāng)三淋油使用，利用后仍會(huì)產(chǎn)生大量殘余醬油渣。
如何將這一大宗“廢渣”變廢為寶，引起了大家的廣泛關(guān)注。目前對(duì)醬油渣的開發(fā)利用主要有兩種方案。其一是利用外加酶制劑或復(fù)合菌群發(fā)酵技術(shù)提高醬油原料利用率，減少醬油渣的生成，其二是利用醬油渣為原料通過后續(xù)工藝處理，拓展其應(yīng)用范圍，提高其附加值。如用醬油渣生產(chǎn)有機(jī)肥料和飼料，利用醬油渣提取保健因子、膳食纖維和油脂等。
蛋白質(zhì)原料利用率與醬油釀造過程中原料蛋白質(zhì)成分的降解并成為可溶性成分密切相關(guān)。釀造過程中蛋白質(zhì)的降解是在蛋白酶系的作用下完成的。提高酶活力、豐富酶系成為近半個(gè)世紀(jì)以來人們關(guān)注的重點(diǎn)。主要研究工作集中在菌株誘變提高蛋白酶活力、多種菌制曲、酶制劑應(yīng)用。研究外源性酶制劑對(duì)醬油渣進(jìn)行酶解處理的效果，相對(duì)應(yīng)的提高成曲中相同類型的酶活力，可以提高原料的利用率，并為實(shí)現(xiàn)醬油渣資源高效綜合利用的目標(biāo)奠定基礎(chǔ)。
醬油渣中含有豐富的蛋白質(zhì)，是很好的動(dòng)物蛋白質(zhì)飼料。同時(shí)醬渣中還含有豐富的異黃酮，研究表明異黃酮對(duì)禽畜及其產(chǎn)品具有重要營(yíng)養(yǎng)作用。目前將醬油渣開發(fā)為優(yōu)質(zhì)飼料大致是將醬油渣先行預(yù)處理再接種適宜的微生物，將培養(yǎng)料中的粗纖維降解轉(zhuǎn)化成小分子物質(zhì)、脂肪和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，從而提高醬渣的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和消化利用率。醬油渣微生物飼料化的研究工作主要集中在篩選和構(gòu)建合適的菌株，采用單菌種或混合菌種發(fā)酵方式，探索一步或多步發(fā)酵工藝對(duì)醬油渣進(jìn)行發(fā)酵。研究結(jié)果表明，固態(tài)發(fā)酵適合醬油渣的發(fā)酵克服了醬油渣水分含量過大等問題。醬油渣發(fā)酵后應(yīng)用顯著提高了飼用價(jià)值，在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用有良好的應(yīng)用前景。
但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)醬油渣蛋白質(zhì)的研究尚未受到足夠重視，因此對(duì)醬油渣蛋白質(zhì)不能做到針對(duì)性的有效利用。通過研究醬油渣蛋白質(zhì)的組成，開發(fā)醬油渣定向降解的方法，有助于醬油生產(chǎn)中原料利用率的提高 及醬油渣飼料化，一方面可以減少醬渣對(duì)環(huán)境的污染，另一方面實(shí)現(xiàn)變廢為寶，生產(chǎn)出具有品質(zhì)較好的飼料，實(shí)現(xiàn)資源的合理利用，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明所解決的問題
本發(fā)明以醬油渣為研究對(duì)象，通過研究醬油渣蛋白質(zhì)的組成，開發(fā)出醬油渣定向降解的方法，包括兩步酶解法和微生物雙菌分步發(fā)酵法。酶法降解醬油渣蛋白質(zhì)，為優(yōu)化醬油成曲中的酶系，提高醬油原料的利用率及減少醬油渣的產(chǎn)生量有重大意義；微生物雙菌分步發(fā)酵醬油渣，為醬油渣的飼料化應(yīng)用研究提供新的思路。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了醬油渣中的蛋白質(zhì)成分的分析方法及結(jié)果。
醬油渣蛋白質(zhì)的特征在于：通過有機(jī)溶劑提取、離液鹽處理、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，顯示醬油渣主要是幾種蛋白質(zhì)的混合物，主要包括大豆和小麥的細(xì)胞壁蛋白、糖蛋白、種子蛋白、抗熱蛋白及球蛋白經(jīng)微生物酶解后的片段。
本發(fā)明還提供了醬油渣蛋白質(zhì)定向降解的方法。
本發(fā)明之醬油渣蛋白質(zhì)定向降解的方法之一，先用纖維素酶作用醬油渣，最佳作用條件為酶反應(yīng)pH值為5.0，作用溫度為55℃，作用時(shí)間為1h，酶的添加量80U/g；接著用堿性蛋白酶的作用醬油渣，最佳作用條件為酶反應(yīng)pH值為8.0，作用溫度為65℃，作用時(shí)間為2h，酶的添加量2000U/g。醬油渣蛋白質(zhì)經(jīng)兩步酶解后蛋白質(zhì)利用率為62.45％。
本發(fā)明之醬油渣蛋白質(zhì)定向降解的方法之二，先采用香菇菌菌絲接種于醬油渣上，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為7d；接著接入米曲霉孢子進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為24h。所得產(chǎn)品風(fēng)味較好，蛋白質(zhì)的利用率為48.6％，加上菌體蛋白的含量12.1％，綜合利用率為60.7％。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
1.本發(fā)明中的醬油渣蛋白質(zhì)的組成，基本反映了醬油渣中蛋白質(zhì)的實(shí)際情況，對(duì)醬油渣的有效利用有重要的參考價(jià)值。
2.本發(fā)明根據(jù)醬油渣蛋白質(zhì)的組成，定向進(jìn)行醬油渣的降解，蛋白質(zhì)利用率高，效果明顯。
3.本發(fā)明選用的酶制劑合理，且均已工業(yè)化生產(chǎn)，實(shí)際操作簡(jiǎn)單，對(duì)醬油渣進(jìn)一步有效利用有重大意義，且芽孢桿菌在醬油釀造的微生物群系中占有很大比例，枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的選用，有助于醬油成曲蛋白酶的優(yōu)化，提高原料利用率，減少醬油渣的生成量。
4.本發(fā)明選用的香菇菌絲體，其發(fā)酵產(chǎn)物有較好的提高免疫力的功效；米曲霉為飼料中可以添加的益生菌，米曲霉發(fā)酵可以很好的提取香菇菌絲中的風(fēng)味物質(zhì)，有助于產(chǎn)品適口性的提高。接種不需要調(diào)節(jié)水分與pH值，工業(yè)化生產(chǎn)簡(jiǎn)單易行，成本較低。
具體實(shí)施方式
實(shí)施實(shí)例1
醬油渣中蛋白質(zhì)成分的分析
醬油渣中的蛋白質(zhì)成分進(jìn)行了分離鑒定，為找到更好的利用醬油渣，特別是其中蛋白質(zhì)成分的方法，對(duì)其中的蛋白質(zhì)來源和結(jié)構(gòu)特征等相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行全面和深入的研究尤為重要。實(shí)驗(yàn)中采用液氮研磨，有機(jī)溶劑洗滌，離液鹽提取的方法，對(duì)醬油渣的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分離；用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS-MS)技術(shù)對(duì)醬油渣蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定分析。
醬油渣蛋白質(zhì)的提取
稱取新鮮醬油渣，加入液氮磨碎，重復(fù)研磨至組織完全破碎。
將磨碎的醬油渣放于凍存管中，加入-20℃預(yù)冷的甲醇(添加蛋白酶抑制劑)，輕輕搖動(dòng)并離心以除去雜質(zhì)并沉淀蛋白質(zhì)，用吸管小心的移除上清液，重復(fù)該步驟，直至離心上清液由黃色變?yōu)闊o色。用紙巾吸干沉淀上的甲醇。
將甲醇提取后的沉淀加入適量-20℃預(yù)冷的丙酮(添加蛋白酶抑制劑)，輕輕搖動(dòng)輕搖動(dòng)并離心以沉淀蛋白質(zhì)，用吸管小心的移除上清液，重復(fù)該步驟3次，于室溫放置1h使丙酮揮干，并稱重。
每mg重量的沉淀加入4ul的高序列離液鹽(有些鹽，很容易破壞水、大分子或者生命系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，這些鹽就叫做離液鹽，而離液序列就是這種破壞結(jié)構(gòu)能力的高低)，于室溫(15-30℃)放置30min，離心上清液即為提取的蛋白質(zhì)。
醬油渣蛋白質(zhì)的鑒定分析
丙烯酰胺與雙丙烯酰胺比例為30∶1，濃縮膠和分離膠的濃度分別為4％和10％，樣品進(jìn)樣前95℃加熱5min，樣品進(jìn)樣量15μL。電泳結(jié)束后凝膠在0.25％的考馬斯亮蘭溶液(R-250)中染色，在7％的乙酸溶液(甲醇∶乙酸∶水＝227∶37∶236(V∶V∶V))中脫色。最后電泳圖使用JEDA掃描設(shè)備進(jìn)行掃描。
將SDS-PADE電泳后的三條主要帶白帶切下，放于去離子水中，并用胰蛋白酶降解后，進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS-MS)技術(shù)進(jìn)行鑒定和氨基酸特征分析。結(jié)果顯示醬油渣主要是11S球蛋白的酸性亞基(A1a，A2，A1b，A4)及堿性亞基(B2，B1a，B1b，B3，B4).這說明醬油發(fā)酵過程中蛋白酶活力不足或者酶與底物沒有充分接觸。
實(shí)施實(shí)例2
酶對(duì)醬油渣蛋白質(zhì)的降解作用
根據(jù)醬油渣中蛋白質(zhì)的組成情況，我們采用選擇纖維素酶和堿性蛋白酶對(duì)醬油渣蛋白質(zhì)分解的實(shí)驗(yàn)，其中纖維素酶選取了多種常用的纖維素酶和蛋白酶，其中來源于木霉的纖維素酶1作用效果最好，來源于枯草芽孢桿菌的堿性蛋白酶作用效果最好。
影響酶作用效果的主要因素為作用溫度、作用時(shí)間、反應(yīng)pH值、酶的添加量，因此，對(duì)這四個(gè)因素進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以找到酶制劑的最佳作用條件；選擇L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果知，堿性蛋白酶的最佳作用條件為酶反應(yīng)pH值為8.0，作用溫度為65℃，作用時(shí)間為2h，酶的添加量6000U/g。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)可知，優(yōu)化后的蛋白質(zhì)利用率為35.63％，比未優(yōu)化前提高了10.03％；選擇L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，先用纖維素酶作用，然后用堿性蛋白酶測(cè)得蛋白質(zhì)利用率，正交試驗(yàn)結(jié)果分析可見纖維素酶的最佳作用條件為酶反應(yīng)pH值為5.0，作用溫度為55℃，作用時(shí)間為1h，酶的添加量80U/g。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)可知，優(yōu)化后的蛋白質(zhì)利用率為62.45％，比未優(yōu)化前提高了22.17％。
實(shí)施實(shí)例3
微生物對(duì)醬油渣蛋白質(zhì)的降解作用分析
醬油渣蛋白質(zhì)降解菌株的初步篩選
選用了杏鮑菇、金針菇、平菇(農(nóng)平1號(hào))、平菇(特白平菇)、香菇、木耳、猴頭菇、銀耳菌、雞腿菇、飼料發(fā)酵菌、青貯飼料菌、米根霉3.010、毛霉3.2778、少孢根霉、霉豆渣菌株、腐乳毛霉、東北霉菌-源自米曲、東北霉菌-源自豆芽，及木霉40316、40144、41226、13049、40932、米曲霉3.042，以醬渣為底物，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，提取可溶性蛋白后測(cè)定殘余物質(zhì)的全氮含量，來評(píng)價(jià)微生物對(duì)醬油渣蛋白的利用情況，結(jié)果見表1，這些真菌在醬渣上均有生長(zhǎng)較好，說明這些菌的分泌的酶類能進(jìn)一步的將醬渣分解，其中木霉13049對(duì)醬渣的利用率最高，蕈菌類香菇對(duì)醬渣的利用率較高，香菇菌絲在生長(zhǎng)的同時(shí)，改善了醬渣的風(fēng)味，有利于醬油渣飼料化的開發(fā)。
表1微生物對(duì)醬油蛋白質(zhì)的利用情況
醬油渣蛋白質(zhì)降解菌株的組合發(fā)酵優(yōu)化
通過優(yōu)選第一步發(fā)酵結(jié)果，采用香菇與米曲霉組合培養(yǎng)，通過優(yōu)化發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度等因素，得到最優(yōu)的醬油渣蛋白質(zhì)降解方案，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香菇菌菌絲接種于醬油渣上，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為7d；接著接入米曲霉孢子進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為24h。所得產(chǎn)品風(fēng)味較好，蛋白質(zhì)的利用率為48.6％，加上菌體蛋白的含量12.1％，綜合利用率為60.7％。