本發(fā)明涉及酶活性測定，具體地說，涉及一種磷脂酶A₂的活性測定方法。

背景技術(shù)：

磷脂酶A₂(EC 3.1.1.4，phospholipase A₂，PLA₂)是一種可以水解磷脂分子中sn-2位酯鍵，得到溶血磷脂和脂肪酸的酶(王小強等.蝮蛇毒酸性磷脂酶A₂高含鈣量的晶體結(jié)構(gòu)研究[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報，1997，29(2):142-149)。磷脂酶A₂是一類分布廣泛的酶家族，存在于各種動物組織，尤其是蛇毒、蝎毒、蜂毒等動物毒液和哺乳動物的胰臟分泌液中(郝彩等.廣東眼鏡蛇毒磷脂酶A₂的分離純化及其酶活性質(zhì)[J].中國生物制品學(xué)雜志，2011，24(5):575-578)。參與膜磷脂的降解和代謝、信號傳導(dǎo)、宿主防御、血液凝固、細胞膜重建、二十二烷酸前體生成等(楊武等.分泌型磷脂酶A₂亞家族:結(jié)構(gòu)與功能[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2013，29(10):932-940)。

其中蛇毒中磷脂酶A₂還具有某些重要的毒性作用(如神經(jīng)毒性、出血毒性、肌肉毒性、心臟毒性等)及多種其他生物學(xué)功能(如殺菌、誘導(dǎo)細胞凋亡、阻止HIV進入宿主細胞、引起水腫等)。正因為磷脂酶A₂的多種毒性與生物學(xué)功能，檢定其活性非常重要。一方面，我們需要通過其活性推斷其可能帶來的生物學(xué)功能，另一方面，由于具有毒性作用，磷脂酶A₂作為樣品中的雜質(zhì)的檢定也尤為重要。

磷脂酶A₂活性測定比較常用的方法是利用自動電位滴定法，以新鮮蛋黃為底物，加入必需的鈣離子以及鈉離子和去垢劑如脫氧膽酸鈉、Triton X—100等，調(diào)pH8.0左右，通過滴定釋放出的脂肪酸，求出PLA₂活力。這種方法操作簡單，底物對PLA₂也較敏感，但由 于蛋黃中存在雜質(zhì)，所以多用在要求不太高的場合。還有測活時需將pH電極浸入底物中，這就要求每次測活底物不少于5ml，且pH不能太高或過低。

亦有研究用酚紅作為pH指示劑，通過比色法測活，這種方法適用于對樣品的大量測定，簡單迅速，所需底物也較少，但因指示劑對PLA₂的影響及PLA₂活力受pH制約等，準(zhǔn)確度還是不高(張翔等.蛇毒磷脂酶A₂:不同測活方法的評估[J].生命的化學(xué)，1994，14(2):41-42)。

用放射性標(biāo)記的人工合成底物(Dole V P and Meinertz H，Microdetermination of Long-chain Fatty Acids in Plasma and Tissues[J].J Biol Chem，1960，235:2595)，可以大大提高測活的靈敏度。因接觸到同位素操作上多有不便。

最近的由MATTHEW HOLZER等(Matthew Holzer and Stephen P.Mackessy.An aqueous endpoint assay of snake venom phospholipase A2[J].Toxicon，1996，34(10):1149-55)以4-硝基-3-辛酰氧基苯甲酸為底物，利用磷脂酶A₂在鈣離子的存在下能催化底物4-硝基-3-辛酰氧基苯甲酸水解，生成的含發(fā)色基團的產(chǎn)物4-硝基-3-羥基苯甲酸，通過測定其在單位時間內(nèi)產(chǎn)物生成的量評價反應(yīng)速率，從而反映磷脂酶A₂的活性。該方法不依賴于特殊儀器，如自動電位滴定儀、同位素檢測儀器；操作安全，不具有放射性；操作簡單；檢測周期短。

磷脂酶A₂催化底物水解反應(yīng)方程式，如下：

然而，在實際試驗中發(fā)現(xiàn)，MATTHEW HOLZER的方法存在以下缺陷：檢測限較高，只能達到100U/mL；試驗難度大，不易得到良好線性；加標(biāo)回收率只能達到50％左右；方法體系所需樣品及標(biāo)準(zhǔn)品體積較大，增加試驗成本。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種磷脂酶A₂的活性測定方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種磷脂酶A₂的活性測定方法，所述方法包括如下步驟：

1)向梯度稀釋的磷脂酶A₂標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品中分別加入pH8.0的緩沖溶液混勻；然后分別加入底物4-硝基-3-辛酰氧基苯甲酸進行水浴反應(yīng)，終止劑終止反應(yīng)后檢測吸光度值，利用吸光度值與濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

2)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測樣品的吸光度值計算待測樣品的磷脂酶A₂活性；

其中，所述緩沖溶液為含Tris-HCl、CaCl₂與NaCl的緩沖溶液，Tris-HCl：CaCl₂：NaCl的摩爾濃度范圍比為6.0～16.7:1:5.0～13.9。

本發(fā)明提供的活性檢測方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，其中的緩沖溶液摩爾濃度較大，緩沖能力增強，從而使得活性檢測過程中反應(yīng)體系pH相對比較穩(wěn)定，使得該方法線性更好、檢測范圍更寬。

進一步地，所述緩沖溶液為含180～300mM Tris-HCl、18～30mM CaCl₂、150～250mM NaCl的pH8.0的緩沖溶液。

作為優(yōu)選，所述緩沖溶液為含220mM Tris-HCl、18mM CaCl₂、200mM NaCl的pH8.0的緩沖溶液。

進一步地，所述水浴反應(yīng)的溫度為40～50℃，反應(yīng)時間為30～40min；進一步優(yōu)選地，所述方法中水浴溫度為43℃，反應(yīng)時間為30min。

發(fā)明人通過大量試驗研究發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的活性測定方法中磷脂酶A₂在常規(guī)酶反應(yīng)溫度37℃并不是其最適溫度，反應(yīng)20分鐘也不是最佳反應(yīng)時間。試驗中催化反應(yīng)在開始時很慢，經(jīng)過一段時間才突然上升，即存在延遲期。當(dāng)將反應(yīng)時間控制在30-40分鐘時，使測定時脫離催化反應(yīng)的延遲期，使得本發(fā)明方法的線性得以提高。同時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將反應(yīng)溫度控制在40～50℃時，避開了其他酶的最適反應(yīng)溫度，而抑制了其他酶的活性，本發(fā)明的準(zhǔn)確度也得到提高。

進一步地，所述終止劑為可溶于水且不使緩沖鹽析出的有機溶劑或Cr離子溶液；作為優(yōu)選，所述有機溶劑選自乙醇、乙腈或甲醇；更為優(yōu)選，所述有機溶劑為乙醇。

使用本發(fā)明可溶于水且不使緩沖鹽析出的有機溶劑作為終止劑，可迅速有效地終止反應(yīng)，使測得實驗的結(jié)果不會產(chǎn)生較大偏差。同時也可以及時進行下步操作，節(jié)省了操作時間。

進一步地，所述方法加入的緩沖溶液與磷脂酶A₂標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品的體積比均為1：1；

進一步地，加入的底物與緩沖溶液的體積比為1：5；

進一步地，加入的終止劑與緩沖溶液的體積比為1：1。

進一步地，所述底物濃度為7.5-15mM；優(yōu)選為9mM。

本發(fā)明方法加入的底物總量少，可降低檢測成本。在優(yōu)選的底物濃度范圍內(nèi)，測定時底物濃度足夠大，單位時間內(nèi)酶促反應(yīng)速率相對 穩(wěn)定，提高線性和準(zhǔn)確性。

在本發(fā)明的實施例中，進一步地，所述待測樣品設(shè)置對照，對照中加入的緩沖溶液除不含CaCl₂外，其余成分、濃度和體積與待測樣品所加緩沖溶液一致。

進一步地，所述方法可用于檢測凝血因子X激活劑原液中的磷脂酶A₂活性。

進一步地，所述方法是在425nm下測吸光度值。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供了一種新的測定磷脂酶A₂活性的方法，相較于原有方法最主要的技術(shù)效果體現(xiàn)在：檢測范圍寬，為20-180U/mL；線性好，線性值R^2＞0.990，準(zhǔn)確性與精密度都得到顯著提高，具體改進體現(xiàn)在以下幾方面：

1、本發(fā)明中反應(yīng)體系緩沖能力增強，主要是由于加入的緩沖液中Tris-HCl摩爾濃度增大以及三種物質(zhì)摩爾濃度的特定比例，提高了反應(yīng)體系的緩沖能力，緩沖了反應(yīng)過程中產(chǎn)生大量辛酸，使反應(yīng)體系pH相對穩(wěn)定，使得該方法線性好，線性值R²>0.990、遠大于現(xiàn)有技術(shù)的線性值R²＝0.986，檢測范圍寬20-180U/mL，最低檢測限20U/mL，遠低于現(xiàn)有技術(shù)的檢測最低限100U/mL。

2、本發(fā)明的方法摸索了磷脂酶A₂反應(yīng)時的水浴溫度與反應(yīng)時間，發(fā)現(xiàn)將反應(yīng)溫度控制在40～50℃、反應(yīng)時間控制在30-40分鐘時，在活性測定時脫離催化反應(yīng)的延遲期，使得本發(fā)明方法的線性得以提高。同時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將反應(yīng)溫度控制在40～50℃時，與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的加標(biāo)回收率從50％左右可提高到80～110％，方法準(zhǔn)確性更高。

3、本發(fā)明方法采用可溶于水且不使緩沖鹽析出的有機溶劑作為終止劑，可完全終止反應(yīng)，在30分鐘內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定，RSD不超過2％，測得實驗的結(jié)果不會產(chǎn)生較大偏差；同時操作過程中不產(chǎn)生氣泡，便于操作。

4、提高底物濃度，使測定時底物濃度足夠大，單位時間內(nèi)酶促反應(yīng)速率相對穩(wěn)定，提高線性和準(zhǔn)確性。

5、緩沖體系的體積和底物的體積用量減少，便于操作，同時底物的總體用量減少，節(jié)約試驗成本。

本發(fā)明的實施例中還設(shè)置了樣品對照，減少粗毒和原液中含有的對底物有輕微水解作用的一些蛋白質(zhì)的影響，檢測結(jié)果更準(zhǔn)確，避免檢測結(jié)果相對實際值稍有偏高的現(xiàn)象。該方法可用于檢測凝血因子X激活劑原液中磷脂酶A₂的活性，從而看原液是否符合藥用要求。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖2為實施例2步驟3所述本發(fā)明方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖3為實施例2步驟3所述MATTHEW HOLZER方法的吸光度值與反應(yīng)濃度關(guān)系圖；

圖4為實施例2步驟3所述MATTHEW HOLZER方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖5為實施例2步驟4所述MATTHEW HOLZER方法的不同測試時間OD變化圖；

圖6為實施例3所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖7為實施例4所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

主要試劑：

4-硝基-3-辛酰氧基苯甲酸：(廠家：Enzo Life Sciences，貨號：BML-ST506-0250)

磷脂酶A₂標(biāo)準(zhǔn)品溶液：從Sigma購買，在Sigma官方網(wǎng)站上查詢本批次標(biāo)準(zhǔn)品的檢測報告，從中查得相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品活性。加超純水溶解，使得其活性為200U/ml。0.3ml/支分裝，保存在-80℃，有效期6個月。

本發(fā)明以對比文件MATTHEW HOLZER方法為對比試驗。

實施例1 磷脂酶A₂活性測定

1、標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品制備

1.1各稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品配制

磷脂酶A₂標(biāo)準(zhǔn)品溶液加超純水溶解，使得其活性為200U/ml。0.3ml/支分裝，保存在-80℃。

參照下表加入水與磷脂酶A₂標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制備各稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品使各標(biāo)準(zhǔn)品活性分別為0、20、60、100、140、180U/mL，分別對應(yīng)為A0-A5。

1.2待測樣品制備

粗毒：購買的圓斑蝰蛇粗毒用水配制為10mg/ml的溶液后，稀釋60、70與100倍高中低3個濃度。

凝血因子X激活劑(RVV-X)原液：按照《廣西圓斑蝰蛇毒凝血因子X激活劑的分離純化及其止血作用的研究》中所述方法制備凝血因子X激活劑原液。利用3K超濾管超濾置換樣品溶劑為水(4000g離心60min，加水補充溶劑，重復(fù)3次)，調(diào)整蛋白濃度為1mg/mL左右。

2、測定待測樣品活性

2.1分別向每支已加入含100μL 220mM Tris-HCl，18mM CaCl₂，200mM NaCl的pH8.0緩沖溶液的EP管中加入上述制備好的各稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品及各稀釋度待測樣品，每個標(biāo)準(zhǔn)品或樣品重復(fù)三次，混勻后離心，再向其中加入20μL 9mM底物4-硝基-3-辛酰氧基苯甲酸，渦旋混勻5s離心，放置43℃水浴30min。將反應(yīng)管迅速放置在冰水混合物上 迅速降溫，混勻離心?？焖偌尤?00μL冰冷乙醇，渦旋混勻5s，終止反應(yīng)。

2.2從各EP管中取200μL加入96孔板中，迅速在425nm下測試吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測樣品的吸光度值計算待測樣品的磷脂酶A₂活性。

3、待測樣品對照

上述步驟3測定待測樣品的同時，每個待測樣品管檢測設(shè)置待測樣品對照管，待測樣品對照管中加入含100μL 220mM Tris-HCl，200mM NaCl的pH8.0緩沖溶液，而后分別加入100μL高中低濃度粗毒樣品和原液樣品。

4、檢測結(jié)果

按照上述方法，標(biāo)準(zhǔn)品在425nm下測定得到以下結(jié)果：

表1 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品在425nm下吸光度值

A0孔作為空白扣除其OD，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點OD，將吸光度值與濃度做線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，其R²＝0.998。從標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，本實施例活性檢測方法的線性在20～180U/ml范圍內(nèi)。

樣品管及樣品對照管OD值如下所示：

表2 待測樣品管與待測樣品對照管OD值結(jié)果

樣品管測試結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算出磷脂酶A₂活性，得到結(jié)果如下：

表3 未設(shè)待測樣品對照組的樣品活性結(jié)果

由上表可知，測定的低濃度粗毒、原液的磷脂酶A₂活性分別為137.960、94.029U/mL，高中濃度粗毒測定結(jié)果超過180U/ml。對于較高濃度待測樣品需再次稀釋，使酶活性結(jié)果在20～180U/ml檢測范圍內(nèi)。

待測樣品管測試結(jié)果減去對應(yīng)的待測樣品對照結(jié)果，再帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算出磷脂酶A₂活性，得到以下結(jié)果：

表4 設(shè)待測樣品對照組的樣品測定結(jié)果

由結(jié)果可知，測定的高中低濃度粗毒的磷脂酶A₂活性分別為168.68、123.806、63.858U/mL。原液測定結(jié)果未超過20U/mL標(biāo)準(zhǔn)品點，即活性不超過20U/mL。

本實施例中，不設(shè)置待測樣品對照與設(shè)置待測樣品對照對標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制沒有影響，均可檢測出待測樣品的活性。

磷脂酶A₂是一種鈣離子依賴型酶，在缺乏鈣離子的溶液中不具有水解活性，而凝血因子X激活劑在無Ca²⁺的情況下就具有蛋白水解的活性(Takeya,H..Coagulation factor Xactivating enzyme from Russell’s viper venom(RVV-X).A novel metalloproteinase with disintegrin(platelet aggregation inhibitor)-like and C-typelectin-like domains.J.Biol.Chem.267(1992)14109-14117)。此外，我們也通過實驗表明，缺乏鈣離子的溶液隨著溶液中凝血因子X激活劑含量增加，測試的OD值上升，證明凝血因子X激活劑對底物有輕微的水解作用。

因為粗毒和原液中存在凝血因子X激活劑，凝血因子X激活劑對底物有輕微水解作用，使得不設(shè)置待測樣品對照組的結(jié)果值偏大。本實施例中設(shè)置待測樣品對照組消除了待測樣品中凝血因子十激活劑對底物的水解作用導(dǎo)致的結(jié)果值偏高的影響，結(jié)果更準(zhǔn)確。同時，設(shè)置待測樣品對照組還可用于檢測凝血因子X激活劑原液中磷脂酶A₂的活性。

實施例2 方法驗證

1、準(zhǔn)確性

由三位分析人員同時對活性為50、90、130U/ml的三個待測樣品進行檢測(按照設(shè)置對照組方法)，每人每個樣品檢測3天。共9次重復(fù)實驗計算回收率評價方法準(zhǔn)確性。

表5 準(zhǔn)確性(加標(biāo)回收率)考察結(jié)果

由表5結(jié)果可知，本發(fā)明方法在低中高濃度時測試結(jié)果均有較好的準(zhǔn)確性，加標(biāo)回收率在83-108％之間。

對比試驗MATTHEW HOLZER方法的加標(biāo)回收率為50％左右。

2、精密度

2.1重復(fù)性

一名實驗員測定低中高濃度(50、90、130U/ml)待測樣品(按 照設(shè)置對照組方法)，共重復(fù)6次的實驗結(jié)果，計算RSD，用于評價方法的重復(fù)性。

表6 重復(fù)性考察結(jié)果

由表6結(jié)果可知，方法具有良好的重復(fù)性，RSD小于10％。

2.2中間精密度

三名實驗員在不同日期測定低中高濃度(50、90、130U/ml)待測樣品(按照設(shè)置對照組方法)，每人重復(fù)3次，共9次實驗結(jié)果，計算RSD，用于評價方法的中間精密度。

表7 中間精密度考察結(jié)果

由表7結(jié)果可知，方法中間精密度良好，RSD小于10％。

綜上結(jié)果，本發(fā)明的低中高濃度待測樣品RSD均小于10％。與《生物制品質(zhì)量控制分析方法驗證技術(shù)一般原則》中酶活性檢測方法的精密度要求小于20％相比，本發(fā)明具有很好的精密度。

3、線性與范圍

由圖2結(jié)果可知，本方法磷脂酶A₂活性在20-180U/mL之間時線性良好，R²＝0.998>0.990。

對比試驗MATTHEW HOLZER方法的吸光度值與反應(yīng)濃度關(guān)系圖(圖3)及其標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)顯示，對比試驗檢測線較高，大于100U/mL，剔除250U/mL點后，線性系數(shù)R²＝0.986<0.99。

4、終止反應(yīng)后30分鐘內(nèi)測試結(jié)果

按照實施例1操作(設(shè)置待測樣品對照)，反應(yīng)終止后，不同時間檢測結(jié)果如表8：

表8 終止反應(yīng)后30分鐘內(nèi)測試磷脂酶A₂活性結(jié)果

由結(jié)果可知，本發(fā)明的檢測方法在反應(yīng)終止30min內(nèi)測試，不同時間測試的結(jié)果RSD不超過2％。

對比試驗MATTHEW HOLZER方法在不同的測試時間內(nèi)測定吸光度值，各個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品測試吸光度值一直在上升(圖5)。對比試驗的終止液Triton X-100沒有完全終止反應(yīng)，甚至有文獻中提到去污劑對其活力有促進作用(王志清等.廣西產(chǎn)眼鏡蛇毒酸性磷脂酶A₂的分離純化及性質(zhì)研究[J].蛇志.1999,11(4):12-17)。該方法水浴20min并沒有脫離延遲期。且表面活性劑Triton X-100的加入會使體系產(chǎn)生大量氣泡影響實驗操作。

實施例3：改變緩沖溶液的磷脂酶A₂活性測定

操作同實施例1步驟1-3中設(shè)置待測樣品對照組的步驟，數(shù)據(jù)處理方法同實施例1步驟4檢測結(jié)果中的方法處理，區(qū)別在于：

所述標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品管中緩沖溶液為180mM Tris-HCl、30mM CaCl₂、250mM NaCl、pH8.0的緩沖溶液，所述待測樣品對照管中緩沖溶液為180mM Tris-HCl、250mM NaCl、pH8.0的緩沖溶液，底物濃度為7.5mM，水浴溫度為40攝氏度，反應(yīng)時間為30分鐘，所述有機溶劑為乙腈。

得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示，其R²＝0.997。從標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，本實施例活性檢測方法的線性在20～180U/ml范圍內(nèi)。

表9中的OD值為待測樣品管測試結(jié)果減去對應(yīng)的待測樣品對照結(jié)果后的平均值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算磷脂酶A₂活性，得到檢測結(jié)果如下：

表9 設(shè)置對照組后的樣品測定結(jié)果

由結(jié)果可知，測定的高中低濃度粗毒的磷脂酶A₂活性分別為195.00、148.65、90.53U/mL。原液測定結(jié)果未超過20U/mL標(biāo)準(zhǔn)品點，即活性不超過20U/mL。

同理，對實施例2中的方法進行方法學(xué)驗證，操作方式參照實施例2：

1)準(zhǔn)確性：測得的加標(biāo)回收率在80-110％之間，說明實施例3中的方法有較好的準(zhǔn)確度；

2)精密度：重復(fù)性及精密度測定的RSD均小于10％，說明實施例3中的方法重復(fù)性和精密度良好。

實施例4 改變緩沖溶液及反應(yīng)條件的磷脂酶A₂活性測定

操作同實施例1步驟1-3中設(shè)置待測樣品對照組的步驟，數(shù)據(jù)處理方法同實施例1步驟4檢測結(jié)果中的方法處理，區(qū)別在于：

所述標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品管中緩沖溶液為300mM Tris-HCl、18mM CaCl₂、150mM NaCl、pH8.0的緩沖溶液；所述待測樣品對照管中緩沖溶液為300mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH8.0的緩沖溶液，底物濃度為15mM，水浴溫度為50攝氏度，反應(yīng)時間為40分鐘，所述有機溶劑為Cr離子溶液。

得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示，其R²＝0.995。從標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，本實施例活性檢測方法的線性在20～180U/ml范圍內(nèi)。

表10中的OD值為待測樣品管測試結(jié)果減去對應(yīng)的待測樣品對照結(jié)果后的平均值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算磷脂酶A₂活性，得到檢測結(jié)果如下：

表10 設(shè)置對照組后的樣品測定結(jié)果

由結(jié)果可知，測定的高中低濃度粗毒的磷脂酶A₂活性分別為165.62、121.814、65.522U/mL。原液測定結(jié)果未超過20U/mL標(biāo)準(zhǔn)品點，即活性不超過20U/mL。

同理，對實施例2中的方法進行方法學(xué)驗證，操作方式參照實施例2：

1)準(zhǔn)確性：測得的加標(biāo)回收率在80-110％之間，說明實施例4中的方法有較好的準(zhǔn)確度；

2)精密度：重復(fù)性及精密度測定的RSD均小于10％，說明實施例4中的方法重復(fù)性和精密度良好。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳 盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。