本發(fā)明涉及一種慶大霉素C1a的檢測方法。

背景技術：

現(xiàn)有慶大霉素C1a的HPLC柱前衍生化檢測方法，一般為美國藥典USP35-nf30版中對慶大霉素硫酸鹽的檢測方法。例如，準確量取10mL樣品到容量瓶中，加入5mL異丙醇和4mLOPA衍生化試劑混勻，再用異丙醇定容至25mL，充分混勻后密閉，60℃水浴15min后置于冰水中終止反應，12000rmp離心5分鐘后即可進行HPLC檢測。其中，所使用的OPA衍生化試劑配方：鄰苯二甲醛1g(0.0074mol)，溶于5ml甲醇中，加入巰基乙酸2ml(0.0288mol)，最后加0.4mol/L硼酸(45％氫氧化鈉調pH值10.4)95ml混勻，再用45％氫氧化鈉調pH 10.4，放冰箱避光保存。這一方法在工業(yè)生產中適用范圍有限，線性范圍窄，導致慶大霉素C1a濃度的檢測結果準確性非常差。而實際生產過程中，濃度較高且純度較低的慶大霉素C1a樣品是人們經(jīng)常要檢測的對象，因此，發(fā)展一種準確性較高、線性范圍廣的慶大霉素C1a樣品的衍生化試劑，是本領域亟待解決的問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是為了克服現(xiàn)有技術中慶大霉素C1a在檢測濃度時，線性范圍窄、適用范圍有限等缺陷，而提供了一種慶大霉素C1a的檢測方法。本發(fā)明的慶大霉素C1a的檢測方法操作簡單，在檢測生產樣品中慶大霉素C1a濃度時準確性較高、線性范圍廣。

本發(fā)明提供了一種慶大霉素C1a的檢測方法，其包括如下步驟：將含有慶大霉素C1a的待測樣品和衍生化試劑混合均勻并進行衍生化反應，然后進行液相色譜或液相色譜-質譜聯(lián)用方法檢測，即可；

其中，所述衍生化試劑包含溶劑、鄰苯二甲醛、巰基乙酸及緩沖溶液這幾種組分；所述衍生化試劑中鄰苯二甲醛與巰基乙酸的摩爾比為1:8～1:3.89；

如果單次檢測結果中所用衍生化試劑中鄰苯二甲醛的摩爾量與所述待測樣品中所測得的慶大霉素C1a的摩爾量的比值大于等于1.6，即為檢測結果；如果單次檢測結果中所用衍生化試劑中鄰苯二甲醛的摩爾量與所述待測樣品中所測得的慶大霉素C1a的摩爾量的比值小于1.6時，需提高單次檢測中所述鄰苯二甲醛與所述待測樣品中慶大霉素C1a的實際摩爾比，進行重新檢測，直至單次檢測結果中“所用衍生化試劑中鄰苯二甲醛的摩爾量與所述待測樣品中所測得的慶大霉素C1a的摩爾量的比值”大于等于1.6為止；

所述含有慶大霉素C1a的待測樣品為發(fā)酵產物中含有慶大霉素C1a的發(fā)酵液經(jīng)過純化預處理后所形成的待測樣品。

較佳地，所述慶大霉素C1a的檢測方法中，所述衍生化試劑中鄰苯二甲醛與巰基乙酸的摩爾比為1:6～1:3.89；更佳地為1:5～1:3.89。

所述提高單次檢測中所述鄰苯二甲醛與所述待測樣品中慶大霉素C1a的實際摩爾比的方法，較佳地為，在所述衍生化試劑各組分濃度、所述待測樣品各組分濃度均不變的條件下提高檢測體系中所述衍生化試劑與所述待測樣品的質量比；或者為，在所述衍生化試劑與所述待測樣品的質量比不變的條件下，對所述待測樣品進行稀釋和/或對所述衍生化試劑進行濃縮。

所述含有慶大霉素C1a的發(fā)酵液可為本領域各種常規(guī)代謝慶大霉素C1a的微生物培養(yǎng)發(fā)酵所得。較佳地，所述代謝慶大霉素C1a的微生物為絳紅小單孢菌(Micromonmspora purpurea)。所述的絳紅小單孢菌較佳地購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)保藏的菌株編號為CICC11015的絳紅小單孢菌。上述絳紅小單孢菌均可在上述保藏中心購買得到。

較佳地，所述發(fā)酵液為放罐發(fā)酵液。

較佳地，所述純化預處理為：將所述發(fā)酵液進行酸化處理使慶大霉素C1a釋放出來，并固液分離后，濾液即為所述含有慶大霉素C1a的待測樣品。

較佳地，所述純化預處理還可包括如下步驟：在所述固液分離后，將所 述濾液用陽離子交換樹脂進行吸附，然后用堿水洗脫，洗脫液即為所述含有慶大霉素C1a的待測樣品。較佳地，所述陽離子交換樹脂為HZ-732陽離子交換樹脂。

較佳地，所述酸化處理為將所述發(fā)酵液用硫酸水溶液調pH至1.5～2.5(更佳地為1.5～2.0)。較佳地，所述酸化處理的過程還進行靜置。較佳地，所述靜置的時間為1～4小時。較佳地，所述硫酸水溶液中硫酸濃度為4～18M，例如9M。較佳地，所述固液分離為采用過板框進行固液分離或離心分離。較佳地，所述堿水為1mol/L～5mol/LNaOH水溶液。

較佳地，所述衍生化試劑是其各組分均勻混合后所形成的溶液。

較佳地，所述衍生化試劑中鄰苯二甲醛與所述衍生化試劑的質量體積比為0.01g/mL～0.08g/mL；更佳地為0.04g/mL～0.06g/mL。

所述溶劑可為本領域各種常規(guī)溶劑，較佳地為醇類溶劑、酯類溶劑和醚類溶劑中的一種或多種。較佳地，所述醇類溶劑為甲醇、乙醇和丙醇中的一種或多種。

所述溶劑的用量可為本領域常規(guī)用量，較佳地，所述溶劑與所述鄰苯二甲醛的體積質量比為1mL/g～10mL/g；更佳地為1.25mL/g～5mL/g。

所述緩沖溶液可為本領域各種常規(guī)緩沖溶液，較佳地為硼酸水溶液、硼砂水溶液和磷酸鹽水溶液中的一種或多種。較佳地，所述硼酸水溶液中硼酸的摩爾濃度為0.2mol/L～0.5mol/L；更佳地為0.4mol/L～0.45mol/L。較佳地，所述硼酸水溶液的pH為10～11；更佳地為10.4～11.0。較佳地，所述硼酸水溶液的pH是通過質量分數(shù)為40％～50％(更佳地為45％)或飽和的氫氧化鈉的水溶液和/或質量分數(shù)為40％～50％或飽和的氫氧化鉀(更佳地為45％)的水溶液進行調節(jié)。

較佳地，所述衍生化試劑的pH是通過質量分數(shù)為40％～50％(更佳地為45％)或飽和的氫氧化鈉的水溶液和/或質量分數(shù)為40％～50％或飽和的氫氧化鉀(更佳地為45％)的水溶液進行調節(jié)。

所述緩沖溶液的用量可為本領域各種常規(guī)用量，較佳地，所述溶劑與所 述緩沖溶液的體積比為1:12～1:20；更佳地為1:19～1:13。

較佳地，所述衍生化反應在進行前，還將反應體系與異丙醇混合均勻。較佳地，所述異丙醇與所述反應體系的體積比為1：1～1：2。較佳地，所述衍生化反應是在密閉條件下進行。較佳地，所述衍生化反應的溫度為40～60℃；更佳地為60～65℃。較佳地，所述衍生化反應的時間為10～20min；更佳地為15～17min。較佳地，所述衍生化反應在結束后，還包括后處理的操作。較佳地，所述后處理的操作為：采用將反應體系置于-10～0℃來終止反應，和/或，離心取上清液。較佳地，所述離心的轉速為12000rmp～14000rmp。較佳地，所述離心的時間為5～10min。

較佳地，所述液相色譜或液相色譜-質譜聯(lián)用方法檢測中，所用色譜柱為C18色譜柱。所述C18色譜柱較佳地為納微(Nano-Micro)公司的型號為Unisil 5-120C18的C18色譜柱。較佳地，所述C18色譜柱的填料粒徑為5μm。較佳地，所述C18色譜柱的長度為250mm。較佳地，所述C18色譜柱的直徑為4.6mm。較佳地，所述液相色譜或液相色譜-質譜聯(lián)用方法檢測中，所用流動相為體積比為4:1:15的庚烷磺酸鈉水溶液、冰醋酸和甲醇的混合液；所述庚烷磺酸鈉水溶液中庚烷磺酸鈉的質量濃度為5g/L～10g/L。較佳地，所述液相色譜或液相色譜-質譜聯(lián)用方法檢測中，流動相的用量為1L～1.5L。較佳地，所述液相色譜或液相色譜-質譜聯(lián)用方法檢測中，流動相的流速為1.0mL/min～1.2mL/min。較佳地，所述液相色譜或液相色譜-質譜聯(lián)用方法檢測中，進樣量為5～20μL。較佳地，所述液相色譜或液相色譜-質譜聯(lián)用方法檢測中，柱溫為20～45℃。較佳地，所述液相色譜或液相色譜-質譜聯(lián)用方法檢測中，液相色譜檢測波長為330nm～335nm。

較佳地，所述液相色譜-質譜聯(lián)用方法檢測中，采用電噴霧離子化電離源。較佳地，所述電噴霧離子化電離源的噴霧電壓為4000～5000V。較佳地，所述液相色譜-質譜聯(lián)用方法檢測中，干燥器溫度為300～350℃。較佳地，所述液相色譜-質譜聯(lián)用方法檢測中，采用正離子掃描模式。

在符合本領域常識的基礎上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā) 明各較佳實例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進步效果在于：本發(fā)明的慶大霉素C1a的檢測方法在檢測慶大霉素C1a濃度時操作簡單、準確性較高、線性范圍廣。

附圖說明

圖1為參考實施例3中所得的曲線結果

圖2為對比實施例1中所得的曲線結果

圖3為實施例1中所得的曲線結果

圖4為實施例2中所得的曲線結果

具體實施方式

下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。

以下實施例中所用儀器：Agilent 1200型液相色譜儀，包括G1322A型在線脫氣機，G1311A型自動進樣器(美國安捷倫)；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海精密實驗設備有限公司；質譜：LCQ Fleet Ion Trap MSn Mass Spectrometer，Thermo Fisher Scientific。

以下實施例中所用試劑：甲醇、硫酸、硼酸、異丙醇、氫氧化鈉、鄰苯二甲醛(OPA)均為分析純，巰基乙酸、庚烷磺酸鈉為色譜純。

參考實施例1

標準品：精密稱取慶大霉素C1a標準品，溶解在蒸餾水中制成濃度為18mg/ml的溶液，4℃冰箱保存，臨用時進行稀釋。

樣品：放罐發(fā)酵液(對絳紅色小單孢菌Micromonmspora purpurea進行發(fā)酵的發(fā)酵罐發(fā)酵)用4mol/L～18mol/IL硫酸酸化1小時后過板框進行固液分離，濾液經(jīng)HZ-732離子交換樹脂吸附后，1mol/L～5mol/LNaOH水溶液 洗脫，洗脫液為待測樣品，該樣品中慶大霉素C1a的含量為2～15mg/mL，HPLC純度為40％～60％左右。

1、衍生化試劑配制方法：

鄰苯二甲醛1g(0.0074mol)，溶于5ml甲醇中，加入巰基乙酸2ml(0.0288mol)，最后加0.4mol/L硼酸(45％氫氧化鈉調pH值10.4)95ml混勻，再用45％氫氧化鈉調pH 10.4，放冰箱避光保存。

3、衍生化反應步驟：

準確量取10mL樣品到容量瓶中，加入5mL異丙醇和4mL衍生化試劑混勻，再用異丙醇定容至25mL，充分混勻后密閉，60℃水浴15min后置于冰水中終止反應，12000rmp離心5分鐘后即可進行HPLC-MS檢測。

4、HPLC檢測方法：

色譜條件：色譜柱Nano-Micro公司的型號為Unisil 5-120C18的色譜柱(5μm，4.6×250mm)；流動相庚烷磺酸鈉水溶液(5g/L，200ml)-冰醋酸(50ml)-甲醇(750ml)；流速1.2ml/min；柱溫40℃；進樣量20μl；檢測波長330nm。慶大霉素C1a出峰時間約為9～11min。

這里衍生化試劑配制方法及衍生化反應步驟可參考美國藥典USP35-nf30版3326頁左欄第3～5段中對慶大霉素硫酸鹽的檢測方法。

參考實施例2(精密度試驗)

將參考實施例1中濃度為18mg/ml的標準品溶液用蒸餾水稀釋成濃度為1.155mg/ml的標準品溶液；然后按照參考實施例1中衍生化試劑配制方法配制衍生化試劑，并按照參考實施例1中衍生化反應步驟、HPLC檢測方法進行衍生化及檢測。重復進樣5次，計算RSD，結果見表1。

表1

從表1可見，按照參考實施例1中的衍生化試劑的配制方法、衍生化反應步驟、HPLC檢測方法進行衍生化及檢測，精密度較高。

參考實施例3(標準品曲線繪制)

精密吸取慶大霉素C1a標準品溶液，分別稀釋成不同濃度的溶液，按照參考實施例1中的衍生化試劑的配制方法、衍生化反應步驟、HPLC檢測方法進行衍生化及檢測。以結果中慶大霉素C1a峰面積為縱坐標(Y)，慶大霉素C1a濃度為橫坐標(X)，進行線性回歸，得回歸方程：y＝0.6672x+13.146R²＝0.9997。該結果表明，采用該方法對慶大霉素C1a進行HPLC檢測，在慶大霉素C1a濃度為0.1～18mg/mL范圍內呈良好的線性關系，線性回歸結果如圖1所示。

對比實施例1(樣品曲線繪制)

精密吸取參考實施例1中待測樣品溶液，分別稀釋成不同濃度的溶液，按照參考實施例1中的衍生化試劑的配制方法、衍生化反應步驟、HPLC檢測方法進行衍生化及檢測。以結果中慶大霉素C1a峰面積為縱坐標(Y)，慶大霉素C1a濃度為橫坐標(X)，進行線性回歸，線性回歸結果如圖2所示。從圖2可見，采用該方法對慶大霉素C1a樣品2進行HPLC檢測，在慶大霉素C1a濃度為大于2mg/mL時，線性關系較差。

其中，X軸上濃度值小于等于2mg/mL時，其濃度數(shù)值為按照參考實施例3中標準品曲線上其峰面積所對應的濃度數(shù)值；而X軸上濃度數(shù)值大于2mg/mL時，以其相對于濃度為2mg/mL的進樣液的濃縮倍數(shù)來計算其濃度值。

實施例1(待測樣品稀釋后測慶大霉素C1a濃度)

精密吸取參考實施例1中待測樣品溶液，分別稀釋成不同倍數(shù)的溶液，倍數(shù)如：1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、4、6、8、10倍不等。按照參考實施例1中的衍生化試劑的配制方法、衍生化反應步驟、HPLC檢測方法進行衍生化及檢測，檢測所得峰面積按照參考實施例3中標準品曲線找到所對應的濃度數(shù)值，將該濃度數(shù)值乘以該進樣液所對應于待測樣品的稀釋倍數(shù)，即可得 待測樣品的濃度。

以稀釋倍數(shù)為X軸，檢測所得待測樣品濃度為Y軸，做曲線，結果見圖3。從圖3可見，在對待測樣品進行1.8～10倍稀釋時，檢測結果較為準確，且這部分點所對應的曲線的R²＝0.1767。

從圖3中可知，待測樣品濃度為14.6mg/mL，將進行1.8～10倍稀釋，即進樣液濃度為低于8.1mg/mL時，檢測結果較為準確。

實施例2(增加衍生化試劑用量后測慶大霉素C1a濃度)

將待測樣品按照參考實施例1中的衍生化試劑的配制方法、衍生化反應步驟、HPLC檢測方法進行衍生化及檢測，且其中的衍生化反應步驟中的衍生化試劑的用量增加到原來的1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍，保持反應體系總體積不變。檢測所得峰面積按照參考實施例3中標準品曲線找到所對應的濃度數(shù)值，即為待測樣品的濃度。

以衍生化試劑的用量為X軸，以所檢測得到的待測樣品濃度為Y軸，做曲線，結果見圖4。從圖4可見，當將參考實施例1中的衍生化反應步驟中的衍生化試劑的用量提高至1.5～3倍時，檢測結果較為準確，且這部分點所對應的曲線的R²＝0.4219。