本發(fā)明涉及一種精子頂體酶的活性評價方法，特別是一種基于電化學檢測精子頂體酶活性的方法及試劑盒，屬于生物檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

頂體酶活性可反映精子質(zhì)量，頂體酶活力不足可能導致不育，是評價(同意修改)精子功能和生育力強弱的重要指標，結(jié)合(同意修改)精液常規(guī)分析、精子形態(tài)染色等常規(guī)指標，能更全面反映精子質(zhì)量。

頂體酶的檢測早期多利用頂體酶抗體進行放射免疫法或熒光免疫法檢測，通過觀察精子頂體內(nèi)頂體酶的數(shù)量判斷精子受精能力。后來Kennedy等人首先報道了計算頂體酶水解底物效率的方法判斷精子頂體酶的活性，此方法首先將精子裂解，再將裂解液置于加入酶水解底物的檢測管中，通過觀察底物水解后的顯色深淺，計算吸光值檢測頂體酶的水解活力。此方法得出指標更能反應精子頂體酶的生理功能，現(xiàn)已成為標準檢測方法。

近年來又有學者根據(jù)精子頂體反應更深入的認識提出，精子頂體酶的活性應由發(fā)生頂體反應的精子判斷才更符合精子受精的實際生理過程。目前已有報道先進性誘導頂體反應，然后檢測發(fā)生頂體反應后釋放出的頂體酶的活性，以此標示整個精液樣本中精子群體的頂體酶活性。然而，目前的檢測方法需要借助復雜的儀器，檢測花費時間長。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種基于電化學檢測精子頂體酶活性的方法，其能實現(xiàn)對精子頂體酶快速、靈敏、實時檢測，從而克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種精子頂體酶活性檢測試劑盒。

為實現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：

一種基于電化學檢測精子頂體酶活性的方法，其特征在于包含：

提供精子頂體酶底物修飾的電極，

將所述電極分別于含有不同濃度精子頂體酶標準樣品中充分浸漬，并分別測試所述電極的阻抗，由此建立活性精子頂體酶濃度與電極阻抗的標準曲線；

以及，將所述電極分別于含有未知濃度精子頂體酶的待測樣品中充分浸漬，并測試所述電極的阻抗，再依據(jù)所述標準曲線而獲知所述待測試樣中精子頂體酶的濃度；

其中，所述標準樣品和待測樣品均以適于使精子頂體酶專一結(jié)合并水解所述精子頂體酶底物的緩沖液作為溶劑。

進一步的，所述基于電化學檢測精子頂體酶活性的方法還包括：以選定官能團修飾所述電極表面而形成復數(shù)個精子頂體酶底物的結(jié)合位點。

一種精子頂體酶活性檢測試劑盒，其包括：

精子頂體酶底物修飾的電極，

適于使精子頂體酶專一結(jié)合并水解所述精子頂體酶底物的緩沖液，

其中，當所述電極被浸于所述緩沖液中時，所述電極的阻抗變化幅度與所述緩沖液中精子頂體酶的濃度變化幅度呈正比。

進一步的，所述試劑盒還包括說明書，所述說明書記載的所述試劑盒的使用方法包括如下步驟：

將所述電極分別于含有不同濃度精子頂體酶標準樣品中充分浸漬，并分別測試所述電極的阻抗，由此建立活性精子頂體酶濃度與電極阻抗的標準曲線；

以及，將所述電極分別于含有未知濃度精子頂體酶的待測樣品中充分浸漬，并測試所述電極的阻抗，再依據(jù)所述標準曲線而獲知所述待測試樣中精子頂體酶的濃度；

其中，所述標準樣品和待測樣品均以所述緩沖液作為溶劑。

進一步的，所述精子頂體酶底物物理吸附或偶聯(lián)于所述電極表面。

進一步的，所述電極包括金電極。

進一步的，所述精子頂體酶底物包括ZP3蛋白。

在一實施方案之中，所述基于電化學檢測精子頂體酶活性的方法包括：

將具有潔凈表面的金電極于胱氨二鹽酸鹽溶液中充分浸漬后取出、干燥，再浸入含戊二醛和精子頂體酶底物的緩沖溶液，之后晾干，獲得精子頂體酶底物修飾的電極。

進一步的，所述緩沖液采用磷酸緩沖鹽溶液。

藉由本發(fā)明的試劑盒及檢測方法，能快速(3分鐘左右)、可靠、靈敏(檢測限可達0.001μM)且低成本的檢測精子頂體酶的活性。

附圖說明

圖1是本發(fā)明一典型實施方案之中在金電極表面修飾精子頂體酶底物的原理圖；

圖2是本發(fā)明一典型實施方案之中以精子頂體酶底物修飾的金電極檢測精子頂體酶的示意圖；

圖3是本發(fā)明一典型實施方案之中以精子頂體酶底物修飾的金電極檢測精子頂體酶的檢測結(jié)果曲線圖。

具體實施方式

如前所述，鑒于現(xiàn)有技術(shù)的諸多缺陷，本案發(fā)明人經(jīng)長期研究和大量實踐，非常驚奇的發(fā)現(xiàn)，當以電極，特別是金電極作為任一種精子頂體酶底物的載體時，其阻抗大小會被周圍環(huán)境的介電常數(shù)顯著影響，特別是，當存在有活性精子頂體酶(即使是非常少量的、濃度在nM級別)時，載于金電極上的精子頂體酶底物被活性精子頂體酶底物水解時，金電極的阻抗會相應發(fā)生非常劇烈的變化，基于這一意外發(fā)現(xiàn)，本案發(fā)明人得以提出本發(fā)明的技術(shù)方案，即提供了一種基于電化學檢測精子頂體酶活性的方法及試劑盒，并經(jīng)大量實驗驗證了其效果。

進一步的，本發(fā)明的一個方面所提供的一種試劑盒包括：

精子頂體酶底物修飾的電極，

以及，適于使活性精子頂體酶與所述精子頂體酶底物與專一結(jié)合并水解的緩沖液。

本發(fā)明中的電極，其主要作用是將底物被酶水解過程的生物或者化學信號轉(zhuǎn)變成電信號，應當能夠高效穩(wěn)定的固定精子頂體酶底物并且不影響精子頂體酶的活性，其他任何滿足該條件的材料都可以用來作為電極。

在一實施方案之中，所述電極優(yōu)選采用金電極，其具有較好的生物相容性好，作為電極材料能保證精子頂體酶底物以及精子頂體酶的活性。

在本發(fā)明的一實施方案之中，所述精子頂體酶底物可通過物理方式或化學反應修飾在金電極表面。

在一較為優(yōu)選的方案之中，可先以選定官能團對金電極表面進行修飾，以在金電極表面提供大量的可以與精子頂體酶蛋白結(jié)合的位點，繼而，精子頂體酶底物可以通過物理方式或與修飾在金電極表面的官能團反應(特別是偶聯(lián)反應)，尤其優(yōu)選通過后一種方式而固定在金電極的表面。

其中，用于將精子頂體酶底物修飾在金電極上的官能團可來源于任何合適的而不限于某 些特定的偶聯(lián)物質(zhì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員依據(jù)本說明應當能夠很容易的理解，凡是能修飾在金電極表面并能與精子頂體酶底物作用的官能團都是適用的。

較為優(yōu)選的，可以采用胱氨二鹽酸鹽，其優(yōu)點在于：a、其具有良好的生物相容性和水溶性，不會破壞精子頂體酶和精子頂體酶地物的活性；b、可以通過金硫酸鍵(Au-S)和金電極結(jié)合，并且可以提供大量的氨基。

本發(fā)明中所采用的精子頂體酶底物可以是能與精子頂體酶反應(例如水解)的任何合適種類，例如ZP3蛋白等，其主要特點是能與精子頂體酶專一結(jié)合，任意一種精子頂體酶底物都可以用來修飾所述電極。

本發(fā)明中所采用的緩沖液可以是PBS緩沖液等，其pH值優(yōu)選為7左右。

本發(fā)明的另一個方面提供的一種基于電化學檢測精子頂體酶活性的方法主要包括：提供精子頂體酶底物修飾的電極；繪制精子頂體酶濃度與電極阻抗的標準曲線；對含有精子頂體酶的樣品進行交流阻抗分析，得到其阻抗，根據(jù)所述標準曲線計算待測樣品中的精子頂體酶的濃度，實現(xiàn)對精子頂體酶快速、靈敏、實時檢測。

在本發(fā)明的一實施方案之中，該方法可以包含：

將所述電極分別于含有不同濃度精子頂體酶標準樣品中充分浸漬，并分別測試所述電極的阻抗，由此建立活性精子頂體酶濃度與電極阻抗的標準曲線；

以及，將所述電極分別于含有未知濃度精子頂體酶的待測樣品中充分浸漬，并測試所述電極的阻抗，再依據(jù)所述標準曲線而獲知所述待測試樣中精子頂體酶的濃度；

其中，所述標準樣品和待測樣品均以適于使精子頂體酶專一結(jié)合并水解所述精子頂體酶底物的緩沖液作為溶劑。

在一更為具體的實施方案之中，一種基于電化學檢測精子頂體酶活性的方法具體可以包括：

a.制備功能化的金電極；

b.通過化學或者物理方法將精子頂體酶高效固定在金電極上；

c.精子頂體酶底物修飾的金電極檢測頂體酶，包括：

建立工作曲線(標準曲線)，首先測定精子頂體酶底物修飾的金電極在磷酸緩沖鹽溶液中的阻抗G0，然后配制一系列濃度的精子頂體酶的溶液，精子頂體酶的濃度記為Cn，將精子頂體酶底物修飾的金電極在不同濃度的精子頂體酶溶液中浸泡30min以上，以保證精子頂體酶充分水解金電極上的精子頂體酶底物，再測定金電極的阻抗Gn，電極交流阻抗差值記為 ΔG＝Gn-G0，精子頂體酶的濃度Cn與ΔG成正比；

對于待測的精子頂體酶溶液中精子頂體酶的濃度，可以通過金電極的阻抗，然后對照工作曲線即可推算出其濃度。

又，在本發(fā)明的一典型實施案例中，本發(fā)明的技術(shù)方案可通過如下方式實現(xiàn)：

(1)金電極修飾(請參閱圖1)：

將金電極用乙醇、二次蒸餾水超聲清洗后備用；

將金電極浸泡在濃度約10-50mL的(30-50mM)胱氨二鹽酸鹽溶液中于50-80℃超聲30-90min以上，之后在室溫下晾干；

將金電極浸泡在含有約5wt％戊二醛和10-30mg/mL的精子頂體酶底物PBS(濃度0.01M，pH值約7.4)溶液中孵育1-3h以上之后將金電極晾干；

(2)精子頂體酶底物修飾的金電極檢測頂體酶。首先建立一條工作曲線，測首先測定精子頂體酶底物修飾的金電極在磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH值約7.4)中的阻抗G0，然后配制一系列濃度的精子頂體酶的溶液，精子頂體酶的濃度記為Cn，將精子頂體酶底物修飾的金電極在不同濃度的精子頂體酶溶液中浸泡30min以上，以保證精子頂體酶充分水解金電極上的精子頂體酶底物(可參閱圖2)，再測定金電極的阻抗Gn，電極交流阻抗差值記為ΔG＝Gn-G0,精子頂體酶的濃度Cn與ΔG成正比。對于待測的精子頂體酶溶液中精子頂體酶的濃度，可以通過金電極的阻抗，然后對照工作曲線即可推算出其濃度。

此外，適合利用本發(fā)明的試劑盒和檢測方法進行檢測的精子頂體酶應當不限于人類的精子，而還可以是一般性哺乳動物如豬、狗、馬等動物的精子頂體酶。

以下結(jié)合若干較佳實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的解釋說明，但其中的實驗條件和設(shè)定參數(shù)不應視為對本發(fā)明基本技術(shù)方案的局限。并且本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。

實施例1：使用精子頂體酶底物修飾的金電極檢測人類精子頂體酶

1)金電極修飾：將金電極用乙醇、二次蒸餾水超聲清洗后備用，參閱圖1，將金電極浸泡在30mM的胱氨二鹽酸鹽溶液中在50℃條件下超聲30min，在室溫下晾干，再將金電極浸泡在含有5％戊二醛和10mg/mL的精子頂體酶底物PBS(0.01M，pH7.4)溶液中孵育1h后，將金電極晾干；

2)精子頂體酶底物修飾的金電極檢測頂體酶，其原理可參閱圖2。首先建立一條工作曲線(標準曲線圖)，測首先測定精子頂體酶底物修飾的金電極在磷酸緩沖鹽溶液(PBS pH 7.4) 中的阻抗G0(參閱圖3中的A)，然后配制一系列濃度的精子頂體酶的溶液，精子頂體酶的濃度記為Cn(參閱圖3中的B)，將精子頂體酶底物修飾的金電極在不同濃度的精子頂體酶溶液中浸泡30min，以保證精子頂體酶充分水解金電極上的精子頂體酶底物，再測定金電極的阻抗Gn，電極交流阻抗差值記為ΔG＝Gn-G0,精子頂體酶的濃度Cn與ΔG成正比。對于待測的精子頂體酶溶液中精子頂體酶的濃度，可以通過金電極的阻抗，然后對照工作曲線即可推算出其濃度。

3)參考所做標準曲線圖，測定樣品中精子頂體酶的濃度為0.5μM，檢測范圍為0.001μM～50μM。

實施例2：使用精子頂體酶底物修飾的金電極檢測豬精子的精子頂體酶

1)金電極修飾：將金電極用乙醇、二次蒸餾水超聲清洗后備用，將電極浸泡在10mL30mM的胱氨二鹽酸鹽溶液中在50℃條件下超聲30min，在室溫下晾干，再將金電極浸泡在含有5％戊二醛和10mg/mL的精子頂體酶底物PBS(0.01M，pH7.4)溶液中孵育1h后將金電極晾干；

2)精子頂體酶底物修飾的金電極檢測頂體酶，其原理可參閱圖2。首先建立一條工作曲線，測首先測定精子頂體酶底物修飾的金電極在磷酸緩沖鹽溶液(PBS pH 7.4)中的阻抗G0，然后配制一系列濃度的精子頂體酶的溶液，精子頂體酶的濃度記為Cn，將精子頂體酶底物修飾的金電極(圖2中的A)在不同濃度的精子頂體酶溶液中浸泡30min，以保證精子頂體酶充分水解金電極上的精子頂體酶底物(圖2中的B)，再測定金電極的阻抗Gn，電極交流阻抗差值記為ΔG＝Gn-G0，精子頂體酶的濃度Cn與ΔG成正比。對于待測的精子頂體酶溶液中精子頂體酶的濃度，可以通過金電極的阻抗，然后對照工作曲線即可推算出其濃度。

3)參考標準曲線圖，測定樣品中精子頂體酶的濃度為1μM，檢測范圍為0.001μM～50μM。

還需要說明的是，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解，以上所述本發(fā)明的具體實施方式，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護范圍的限定。任何根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思所作出的各種其他相應的改變與變形，均應包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。