本發(fā)明涉及中藥材活性成分雷公藤甲素的檢測，尤其涉及一種微波輔助提取/HPLC檢測雷公藤葉中雷公藤甲素的方法。

背景技術(shù)：

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)系衛(wèi)矛科雷公藤屬木質(zhì)藤本植物，又名菜蟲藥、黃藤根、斷腸草等，是雷公藤屬植物中的一種，在我國有廣泛分布。雷公藤甲素(Triptolide，TP)又稱雷公藤內(nèi)酯、雷公藤內(nèi)酯醇，是從雷公藤中分離出的一種活性最高的環(huán)氧化二萜單體，是雷公藤的主要有效成分之一，其相關(guān)效價(jià)比雷公藤總苷高100～200倍。雷公藤甲素是具有松香烷骨架的二萜，含有獨(dú)特的三環(huán)氧結(jié)構(gòu)和α,β-不飽和五元內(nèi)酯環(huán)(如下式所示)為白色晶體，分子式C₂₀H₂₄O₆，相對分子質(zhì)量為360.41。自1977年黎磊石院士首次證實(shí)雷公藤對腎小球腎炎有減少蛋白尿、消水腫的作用，并相繼發(fā)表了以雷公藤提取液TⅡ(相當(dāng)于目前的雷公藤多甙片)治療腎炎的臨床及實(shí)驗(yàn)研究報(bào)告，全國各地普遍開始將其用于腎臟疾病治療。近年來國內(nèi)外專家學(xué)者對其研究較多，它不但具有抗腫瘤生物活性，還能抗炎、免疫抑制、抗生育等，臨床上在癌癥、器官移植排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病、腎病綜合征等方面療效顯著，如申請?zhí)枮镃N200510019501.5(公開號為CN1762346A)的中國發(fā)明專利《雷公藤甲素在制備抗卵巢癌藥物中的應(yīng)用》、專利號為ZL201110093907.3(公開號為CN102327279A)《雷公藤甲素與忍冬苷配伍的藥物組合物及其制備和用途》等。

微波萃取技術(shù)又叫微波輔助提取(MAE),是利用微波能作為一種輔助手段，選擇性地使樣品中欲分析組分從樣品基體中滲出，實(shí)現(xiàn)與基體的分離。微波萃取的原理就是在 微波場中，利用不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)吸收微波能力的差異，使得基體物質(zhì)的某些區(qū)域或萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使被萃取物質(zhì)從基體或體系中分離，進(jìn)入到介電常數(shù)較小、微波吸收能力相對差的萃取劑中。將微波萃取與傳統(tǒng)的Soxhlet萃取、攪拌萃取、超聲波萃取或超臨界流體萃取等方法比較，它克服了傳統(tǒng)萃取方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)試劑、效率低、重現(xiàn)性差、對環(huán)境和操作人員造成危害的缺點(diǎn)，具有設(shè)備簡單、選擇性高、萃取效率高、重現(xiàn)性好、操作簡單、易于控溫、節(jié)省時(shí)間、節(jié)省試劑、污染輕等優(yōu)點(diǎn)。目前微波萃取已被廣泛應(yīng)用于很多領(lǐng)域，尤其在生物、醫(yī)藥、化工、食品等領(lǐng)域，微波萃取可用于生物樣品中農(nóng)藥殘留的研究、環(huán)境中有機(jī)污染物的研究、植物中有效成分的萃取等，在我國微波萃取廣泛被用于天然產(chǎn)物的提取，目前已應(yīng)用于多項(xiàng)中草藥的浸取生產(chǎn)線之中，如葛根、茶葉、銀杏等。

高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography\HPLC)又稱“高壓液相色譜”，高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對試樣的分析。申請?zhí)枮?00710069906.9(公開號為CN 101339168A)的中國發(fā)明專利《雷公藤藥材中雷公藤甲素的含量測定方法》，該發(fā)明利用三氯甲烷對雷公藤藥材粉末進(jìn)行萃取，然后利用高效液相色譜法進(jìn)行分析，雖然該方法能確保雷公藤制成品的優(yōu)質(zhì)原料，保證雷公藤制劑的用藥安全和療效，但雷公藤甲素的萃取率相對較低，萃取時(shí)間過長，使得其整體萃取效率不高，從而影響其檢測的效率和精度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)而提供一種萃取效率高、檢測快速且精度高的微波輔助提取/HPLC檢測雷公藤葉中雷公藤甲素的方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種微波輔助提取/HPLC檢測雷公藤葉中雷公藤甲素的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)樣品前處理：新鮮的雷公藤葉干制后粉碎，過15～20目篩得雷公藤葉粉末，將制得的雷公藤葉粉末置于容器中，按料液比1:6～8進(jìn)入石油醚，混合均勻后超聲脫脂50～60min，脫脂后干燥備用；

(2)微波提取：按料液比1:6～14將提取溶劑放入上述雷公藤葉粉末中，在微波溫度60～70℃、微波功率500～900w條件下微波提取5～25min，提取次數(shù)為1～3次；

(3)檢測：采用HPLC進(jìn)行檢測，HPLC的色譜條件為：色譜柱為Kromasil ODS-C18(4.6mm×250mm)，流動(dòng)相為乙腈-水，檢測波長為218nm，柱溫為室溫,流速為0.5～0.7mL/min，進(jìn)樣量為20μL。

作為優(yōu)選，所述雷公藤粉末與提取溶劑的料液比為1:8。

作為優(yōu)選，所述提取溶劑為甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、氯仿中的至少一種。

進(jìn)一步，所述提取溶劑為甲醇。

作為優(yōu)選，所述微波溫度70℃、微波功率600w條件下微波提取20min，提取次數(shù)為1次。

作為優(yōu)選，所述步驟(3)中流動(dòng)相中乙腈-水的體積比為4:6，所述流速為0.7mL/min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明利用微波輔助提取來提取雷公藤葉中雷公藤甲素，與現(xiàn)有的提取方法相比，具有不破壞樣品基體，升溫快溫度、時(shí)間、壓力可控，受溶劑親和力的影響小、可供選擇的溶劑種類多等優(yōu)點(diǎn)，使得對雷公藤甲素的提取效率較高，應(yīng)用HPLC對提取液中的雷公藤甲素進(jìn)行檢測，該方法簡便、快捷、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，適合于雷公藤葉中雷公藤甲素的含量測定。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1的1-2中雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖2為實(shí)施例1的1-2中雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC譜圖；

圖3為實(shí)施例2的2-1中不同提取溶劑對雷公藤甲素萃取效果的影響；

圖4為實(shí)施例2的2-1中以甲醇為提取溶劑時(shí)所得的雷公藤甲素HPLC譜圖；

圖5為實(shí)施例2的2-2中不同微波功率對雷公藤甲素萃取率的影響；

圖6為實(shí)施例2的2-2中微波功率600w時(shí)所得的雷公藤甲素HPLC譜圖；

圖7為實(shí)施例2的2-3中料液比對雷公藤甲素萃取率的影響；

圖8為實(shí)施例2的2-3中料液比1:8時(shí)所得的雷公藤甲素HPLC譜圖；

圖9為實(shí)施例2的2-4中提取時(shí)間對雷公藤甲素提取率的影響；

圖10實(shí)施例2的2-4中提取時(shí)間20min時(shí)所得的雷公藤甲素HPLC譜圖；

圖11為實(shí)施例2的2-5中提取次數(shù)對雷公藤甲素萃取率的影響；

圖12為對比例中三種提取方法所得雷公藤甲素含量圖；

圖13為對比例中回流提取所得的雷公藤甲素HPLC譜圖；

圖14為對比例中超聲提取所得的雷公藤甲素HPLC譜圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖實(shí)施例對發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實(shí)施例1：檢測條件

1-1、HPLC色譜條件

HPLC色譜條件為：色譜柱：Kromasil ODS-C18(4.6mm×250mm)，流動(dòng)相：乙腈-水(4:6)，檢測波長：218nm，柱溫：室溫，流速：0.7mL·min^-1，進(jìn)樣量：20μL。

1-2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥檢所)10mg，用甲醇(AR)定容在10ml的容量瓶中，再分別配制成濃度分別為：0.001mg/mL、0.002mg/mL、0.003mg/mL、0.004mg/mL、0.005mg/mL的5份雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)溶液。用HPLC測上述5份雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，雷公藤甲素濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其對應(yīng)所測得的峰面積如表1所示；雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積的線性關(guān)系如下圖1所示，即回歸方程為y＝22126x+0.784，R²＝0.9993；雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC譜圖如圖2所示。

表1 雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品濃度及相應(yīng)測得的峰面積

實(shí)施例2：樣品萃取

樣品前處理：新鮮的雷公藤葉干制后粉碎，過20目篩得雷公藤葉粉末，將制得的雷公藤葉粉末置于1000mL的圓底燒瓶中，按料液比1:6～8進(jìn)入石油醚，混合均勻后超聲脫脂50～60min，脫脂后的雷公藤葉粉末樣品，攤開晾干備用；

微波提?。簩⒁欢康奶崛∪軇┓湃肷鲜隼坠偃~粉末中，在一定微波溫度、微波功率條件下微波提取。

應(yīng)用HPLC對提取液進(jìn)行檢測，由于雷公藤標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y＝22126x+0.784，R2＝0.9993，x：雷公藤甲素濃度，y：峰面積。所以可得雷公藤甲素的含量＝[(峰面積-0.784)*100/22126]*粗提物得量；純度＝(峰面積-0.784)*100/22126。

2-1、提取溶劑的選擇

分別準(zhǔn)確稱取5g雷公藤葉粉末樣品加到4個(gè)干凈的三頸瓶中，各三頸瓶中分別加入甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、氯仿作為提取溶劑，其他提取條件為：微波溫度70℃、功率700w、料液比1:8、提取時(shí)間5min。將提取液進(jìn)行抽慮得濾液，再將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮得粗提物，算得量，選出最佳溶劑。

提取溶劑為甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、氯仿時(shí)的粗提物得量分別為：0.6931g、0.4040g、0.0899g、0.0492g。用HPLC檢測4種溶劑所對應(yīng)的峰面積、含量、純度如表2所示，不同溶劑提取的雷公藤甲素含量如圖3所示。

表2 不同溶劑所得雷公藤甲素的峰面積和含量

由表2和圖3可知，當(dāng)用甲醇做溶劑時(shí)，提取的的雷公藤甲素含量最高，提取效果 最好，故選擇甲醇作為提取溶劑，甲醇作為提取溶劑對應(yīng)的雷公藤甲素HPLC譜圖如圖4所示。

2-2、提取功率的選擇

分別準(zhǔn)確稱取5g脫脂后的雷公藤葉粉末加到5個(gè)干凈的三頸瓶中，提取功率分別為500w、600w、700w、800w、900w，其他提取條件為：甲醇為提取溶劑，在微波溫度70℃、料液比1:8、提取時(shí)間5min。將提取液進(jìn)行抽慮得濾液，再將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮得粗提物，算得量，選出最佳功率。

功率為500w、600w、700w、800w、900w時(shí)的粗提物得量分別為：0.6612g、0.6840g、0.6406g、0.6519g、0.6294g。用HPLC檢測5種功率所對應(yīng)的峰面積、含量、純度如表3所示，不同功率提取的雷公藤甲素含量如圖5所示。

表3 不同功率所得雷公藤甲素的峰面積和含量、純度

由圖5表可知，隨著微波提取功率的逐漸增加，雷公藤甲素的提取量先增加后降低，當(dāng)功率為600w時(shí)雷公藤甲素含量最高，提取效果最好，故最佳提取功率為600w，提取功率所對應(yīng)的雷公藤甲素HPLC譜圖如圖6所示。

2-3、料液比的選擇

分別準(zhǔn)確稱取5g脫脂后的雷公藤葉粉末加到5個(gè)干凈的三頸瓶中，料液比分別為1:6、1:8、1:10、1:12、1:14，其他提取條件為：以甲醇為提取溶劑，在微波溫度70℃、功率600w、提取時(shí)間5min。將提取液進(jìn)行抽慮得濾液，再將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮得粗提物，算得量，選出最佳料液比。

料液比為1:6、1:8、1:10、1:12、1:14時(shí)的粗提物得量分別為：0.6198g、0.6690g、0.6481g、0.6037g、0.6119g。用HPLC檢測5種料液比所對應(yīng)的峰面積、含量、純度如表4所示，不同料液比提取的雷公藤甲素含量如圖7所示。

表4 不同料液比所得雷公藤甲素的峰面積和含量、純度

由圖7和表4可知，當(dāng)料液比為1:8時(shí)雷公藤甲素含量最高，提取效果最好，故最佳料液比為1:8，不一定所加的溶劑越多提取就越好，最佳料液比所對應(yīng)的雷公藤甲素HPLC譜圖如圖8所示。

2-4、提取時(shí)間的選擇

分別準(zhǔn)確稱取5g脫脂后的雷公藤葉粉末加到5個(gè)干凈的三頸瓶中，提取時(shí)間為分別5min、10min、15min、20min、25min，其他提取條件為：甲醇為提取溶劑，在微波溫度70℃、功率600w、料液比1:8。將提取液進(jìn)行抽慮得濾液，再將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮得粗提物，算得量選出最佳提取時(shí)間。

提取時(shí)間為5min、10min、15min、20min、25min時(shí)的粗提物得量分別為：0.6790g、0.7186g、0.6992g、0.6908g、0.6893g。用HPLC檢測5種提取時(shí)間所對應(yīng)的峰面積、含量、純度如表5所示；不同時(shí)間提取的雷公藤甲素含量如圖9所示；

表5 不同提取時(shí)間所得雷公藤甲素的峰面積和含量、純度

由表5和圖9可知，當(dāng)提取時(shí)間為20min時(shí)雷公藤甲素含量最高，提取效果最好。故最佳提取時(shí)間為20min，最佳提取時(shí)間所對應(yīng)的雷公藤甲素面積如圖10所示。

2-5、提取次數(shù)的選擇

分別準(zhǔn)確稱取5g脫脂后的雷公藤葉粉末加到3個(gè)干凈的三頸瓶中，提取條件為：甲醇為提取溶劑，在微波溫度70℃、功率600w、料液比1:8、提取時(shí)間10min的，對提取次數(shù)進(jìn)行研究，提取次數(shù)分別為：1次、2次、3次。將提取液進(jìn)行抽慮得濾液，再將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮得粗提物，算得量。

提取第1次、第2次、第3次的粗提物得量為：0.7211g、0.1510g、0.0800g。用HPLC檢測回流提取法、超聲提取法所對應(yīng)的峰面積、含量、純度如表6所示，比較圖如圖11所示。

表6 三次提取所得雷公藤甲素的峰面積和含量、純度

由表6和圖11可知，當(dāng)提取1次時(shí)得到雷公藤甲素含量為0.1430mg，而當(dāng)提取第二次時(shí)只多提取出0.0194mg，不到第一次的14％，第三次更少，只有0.0043mg，所以本實(shí)施例中的提取次數(shù)為1次。

對比例：微波輔助萃取法與常規(guī)提取方法對比

回流提取法：

準(zhǔn)確稱取5g雷公藤葉粉末樣品加到干凈的三頸瓶中，在料液比1:8的條件下，以甲醇為提取溶劑，進(jìn)行回流提取120min。將提取液進(jìn)行抽慮得濾液，再將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮得粗提物，算得量。

超聲提取法：

準(zhǔn)確稱取5g雷公藤葉粉末樣品到干凈的三頸瓶中，在料液比1:8、超聲功率250w的條件下，以甲醇為提取溶劑，進(jìn)行超聲提取60min。將提取液進(jìn)行抽慮得濾液，再將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮得粗提物，算得量。

回流提取的粗提物得量為：0.7826g；超聲提取法的粗提物得量為0.6318g。用HPLC檢測回流提取法、超聲提取法所對應(yīng)的峰面積、含量、純度，并與相同條件下微波輔助萃取法所對應(yīng)的峰面積、含量、純度作比較，數(shù)據(jù)如表8所示，比較圖如圖12所示；回流提取所對應(yīng)的雷公藤甲素HPLC譜圖如圖13所示；超聲提取所對應(yīng)的雷公藤甲素HPLC譜圖如圖14所示。

表7 三種提取方法所得雷公藤甲素的峰面積和含量、純度

從表7可知，回流提取法提取出的雷公藤甲素含量較低，微波輔助萃取法略高于超聲提取法，但超聲提取需耗時(shí)60min，微波萃取的3倍，因此可見微波輔助萃取法比回流提取法和超聲提取法更為適合本實(shí)驗(yàn)，也可看出微波輔助萃取具有升溫快，萃取時(shí)間短，萃取效率高，溫度、時(shí)間、壓力可控等優(yōu)點(diǎn)。