本發(fā)明主要涉及生物檢測(cè)技術(shù)及醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)腸道病毒71型IgM抗體的試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：
腸道病毒EV71型感染是由人腸道病毒71型(EV71)引起的疾病的總稱，臨床上主要表現(xiàn)為手足口病，手足口病多在嬰幼兒中爆發(fā)流行，部分EV71感染患兒表現(xiàn)為皰疹性咽峽炎，重癥患者出現(xiàn)病毒性腦炎、病毒性腦脊髓膜炎、肺水腫、肺出血等。引起手足口病的病原，最常見的是柯薩奇病毒A16和腸道病毒71型；由腸道病毒71型感染引起的疾病發(fā)生重癥感染的比例較大，病死率也較高，重癥病例病死率可達(dá)10％-25％，因此病原學(xué)診斷意義重大。腸道病毒71型(EV71)基因組為含有大約7.5Kb的單股正鏈RNA，包括5'端非編碼區(qū)、3'端非編碼區(qū)和由Pl，P2，P3所組成的多蛋白，共編碼11種蛋白，其中4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白VPl,VP2,VP3,VP4,7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D。其中VP1,VP2,VP3暴露于病毒外殼的表面，為EV71主要的抗原變異位置；VP4包埋在病毒外殼的內(nèi)側(cè)與內(nèi)部的RNA結(jié)合，其功能類似病毒外殼的錨，用以穩(wěn)定病毒蛋白的結(jié)構(gòu)。非結(jié)構(gòu)蛋白2A為分裂初期先驅(qū)蛋白質(zhì)，也與終止宿主細(xì)胞合成其本身所需蛋白有關(guān)；3C則參與大部分的蛋白裂解反應(yīng)；3D為RNA聚合酶，在病毒RNA復(fù)制時(shí)主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄及復(fù)制反應(yīng)；2B，2C，3A，3B等四種蛋白則與病毒RNA的復(fù)制有關(guān)。腸道病毒EV71的臨床診斷主要依據(jù)三個(gè)方面:一是臨床表現(xiàn)，二是血清學(xué)證據(jù)，三是病原學(xué)證據(jù)。由于腸道病毒EV71型感染臨床表現(xiàn)多，因此腸道病毒EV71的血清學(xué)檢測(cè)和病原學(xué)檢測(cè)是目前最主要的依據(jù)。腸道病毒71型IgM抗體的檢測(cè)已經(jīng)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，基本上多采用膠體金法或酶聯(lián)免疫法，在成本，特異性等方面尚有諸多不足之處。蛋白質(zhì)芯片由于技術(shù)的先進(jìn)性已經(jīng)成為技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)，但是市場(chǎng)上為未見以蛋白質(zhì)芯片法為基礎(chǔ)的腸道病毒71型IgM抗體檢測(cè)試劑盒的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種準(zhǔn)確性好，特異性高的用于檢測(cè)腸道病毒71型IgM抗體的試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明人提供了4條多肽。令人驚奇的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，雖然所述4條多肽單獨(dú)檢測(cè)手足口病感染中的IgM抗體時(shí)的靈敏度均在35.2％～80.6％之間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)未達(dá)到作為檢測(cè)工具的要求，但是，在本發(fā)明以受試者來源的生物樣本是否對(duì)所述4條多肽中的至少一條或一條以上有響應(yīng)作為判定受試者是否已被瘧原蟲感染的指標(biāo)的情況下，可以以高達(dá)95.2％的靈敏度(假陽性率低至2.6％)檢測(cè)腸道病毒71型IgM抗體感染，進(jìn)而用于手足口病的輔助診斷。因此，本發(fā)明包括：1.一種用于檢測(cè)腸道病毒71型IgM抗體的試劑盒，其包括一個(gè)或多個(gè)固體載體，以及獨(dú)立地連接于所述一個(gè)或多個(gè)固體載體上的下述多肽集合1：SEQIDNO：1所示的多肽；SEQIDNO：2所示的多肽；SEQIDNO：3所示的多肽；和SEQIDNO：4所示的多肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其用于檢測(cè)腸道病毒71型抗體IgM。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中，全部多肽獨(dú)立地連接于同一固體載體上。4.下述多肽集合1在制備用于檢測(cè)腸道病毒71型抗體IgM的試劑盒中的用途：SEQIDNO：1所示的多肽；SEQIDNO：2所示的多肽；SEQIDNO：3所示的多肽；和SEQIDNO：4所示的多肽。5.一種檢測(cè)受試者是否為腸道病毒71型感染患者的方法，該方法包括：使用權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的試劑盒檢測(cè)所述多肽集合1中的多肽對(duì)受試者來源的血液樣本中的腸道病毒71型抗體IgM是否有響應(yīng)；當(dāng)檢測(cè)到所述多肽集合1中的任一個(gè)或一個(gè)以上多肽對(duì)受試者來源的血液樣本中的腸道病毒71型抗體IgM有響應(yīng)時(shí)，判定該受試者為腸道病毒71型感染患者。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述血液樣本為全血、血漿或血清。7根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述受試者為具有手足口病臨床癥狀的受試者。發(fā)明的具體實(shí)施方式多肽集合本說明書中，多肽集合1是指位于第一檢測(cè)區(qū)的全部多肽，所述多肽集合1包含獨(dú)立的下述多肽：SEQIDNO：1所示的多肽序列為SLDFALSLLRRNIRQVQTDQ；SEQIDNO：2所示的多肽序列為APTGQNTQVSSHRLDTGKVP；SEQIDNO：3所示的序列為多肽AREKVEFLNNLKQLPLLENQ；和SEQIDNO：4所示的序列為多肽GHFTMLGVRDRLAVLPRHSQ；所述多肽可以適宜采用(1)化學(xué)合成方法、或(2)酶反應(yīng)合成方法等公知方法來獲得，其中化學(xué)合成更為簡(jiǎn)便。在化學(xué)合成本發(fā)明的多肽情況下，通過使用肽合成儀合成或者半合成該多肽來進(jìn)行。作為化學(xué)合成方法，可以列舉出例如肽固相合成法等。這樣合成的肽可以采用常規(guī)手段例如離子交換色譜、反相高效液體色譜、親和色譜等進(jìn)行純化。這樣的肽固相合成方法以及其后的肽純化都是本技術(shù)領(lǐng)域公知的。此外，在通過酶反應(yīng)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的情況下，可以采用例如國際公開小冊(cè)子WO2004/011653號(hào)所述的方法。即，可以這樣來生產(chǎn)：將一方的氨基酸或二肽的羧基末端被酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、與氨基酸處于游離狀態(tài)的氨基酸(例如羧基保護(hù)的氨基酸)在肽合成酶的存在下進(jìn)行反應(yīng)，生成的二肽或三肽。作為肽合成酶，可以列舉出：具有生成肽的能力的微生物的培養(yǎng)物、由該培養(yǎng)物分離的微生物菌體、或該微生物的菌體處理物、或該微生物來源的肽合成酶。特別是多肽的化學(xué)合成已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，可以通過委托專業(yè)的多肽合成公司來合成所述多肽。試劑盒本發(fā)明提供一種檢測(cè)試劑盒(本發(fā)明的試劑盒)，其包括一個(gè)或多個(gè)固體載體，以及獨(dú)立地連接于所述一個(gè)或多個(gè)固體載體上的下述多肽集合1：SEQIDNO：1所示的多肽；SEQIDNO：2所示的多肽；SEQIDNO：3所示的多肽；和SEQIDNO：4所示的多肽。本說明書中，靈敏度是指：用“金標(biāo)準(zhǔn)”方法確認(rèn)的陽性樣本中，被其他方法測(cè)定為陽性樣本的比例。假陽性率是指：用“金標(biāo)準(zhǔn)”方法確認(rèn)的陰性樣本中，被其他方法測(cè)定為陽性樣本的比例。本技術(shù)領(lǐng)域檢測(cè)人腸道病毒71型感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法是核酸檢測(cè)法、即PCR法。本說明書中，“檢測(cè)”可以是確診，也可以是為確診提供參考信息。在本發(fā)明中，對(duì)固體載體沒有特殊限制，只要是作為固體或不溶性材料(例如是可以通過過濾、沉淀、磁性分離等從反應(yīng)混合物中分離的材料)的載體即可。構(gòu)成固體載體的材料包括但不限于：硅膠(聚二甲基硅氧烷，PDMS)、纖維素、特氟隆TM、硝基纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纖維、金、鉑、銀、銅、鐵、不銹鋼、鐵氧體、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹脂、多糖類、蛋白(白蛋白等)、碳或它們的組合等。固體載體的形狀包括但不要限于：珠子、磁珠、薄膜、微細(xì)管、濾膜、板、微量板、碳納米管、傳感器芯片等。正如本技術(shù)領(lǐng)域公知的那樣，薄膜或板等平坦的固體載體上可以設(shè)置凹坑、溝槽、濾膜底部等。磁珠可以具有約25nm～約1mm范圍的球體直徑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，磁珠具有約50nm～約10μm范圍的直徑。磁珠的尺寸可以根據(jù)特定的用途來進(jìn)行選擇。由Sepharose等高交聯(lián)球形瓊脂糖制成的珠子具有約24μm～約165μm范圍的直徑。優(yōu)選地，高交聯(lián)球形瓊脂糖珠具有約24μm～約44μm范圍的直徑。高交聯(lián)球形瓊脂糖珠的尺寸可以根據(jù)特定的用途來進(jìn)行選擇。具有疏水性表面的固體載體的例子包括可從Polysciences，Warrington，PA或Spherotech，Liberville，IL購買的制品等聚苯乙烯膠乳珠。二氧化硅(SiO2)-處理或二氧化硅(SiO2)基的固體載體的例子包括可從Polysciences，Warrington，PA購買的超常磁性二氧化硅珠等，其可以用于捕捉核酸(例如DNA)?；蛘?，還可以使用可從DynalBiotech購買的M-280等。具有親水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的細(xì)菌細(xì)胞、核酸以及其它成分。作為磁珠的例子，可以列舉出Polysciences，Warrington，PA銷售的珠子(名稱：Biomag(注冊(cè)商標(biāo))羧基)、或者BangsLaboratory，Inc.，F(xiàn)ishers，IN的名稱為MC02N/2928的珠子，或者可以使用DynalBiotech銷售的M-270等。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述固體載體是SJ改性硅膠，其是蘇州偲聚生物材料有限公司開發(fā)的一種硅橡膠材質(zhì)的微陣列固體支撐材料(iPDMS薄膜，參見中國專利CN101265329A)。這種材料是以生物學(xué)研究常用的PDMS為基礎(chǔ)，在其中加入特定的引發(fā)劑成分(使該材料可通過表面引發(fā)聚合反應(yīng)(SIP)實(shí)現(xiàn)表面功能化修飾)，再經(jīng)過聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poly(oligo(ethyleneglycol)methacrylate),pOEGMA)表面修飾獲得的。SJ改性硅膠具有優(yōu)秀的抗蛋白質(zhì)非特異性吸附(Nonspecificproteinadsorption,NPA)能力，可以將復(fù)雜蛋白免疫檢測(cè)中的非特異性蛋白質(zhì)吸附控制到接近“絕對(duì)0”水平(接近或低于儀器的檢測(cè)極限)，不僅可以免除封閉和多次清洗的麻煩，還可以通過使用更強(qiáng)的信號(hào)擴(kuò)增手段來提高蛋白質(zhì)微陣列的靈敏性。而且其硅橡膠的本質(zhì)賦予了該材料較強(qiáng)的機(jī)械性能和良好的可操作性。蘇州偲聚公司已經(jīng)成功地將SJ改性硅膠應(yīng)用于11個(gè)腫瘤標(biāo)志物組成的多指標(biāo)聯(lián)檢微陣列ELISA試劑盒，實(shí)現(xiàn)了高通量和高靈敏的檢測(cè)，證明了這種材料是一種優(yōu)秀的蛋白質(zhì)微陣列固體支撐材料。同時(shí)，這種材料還具有表面性質(zhì)可調(diào)的特性，可以通過控制修飾反應(yīng)時(shí)間在一定范圍內(nèi)調(diào)整其表面形貌。多肽與固體載體的連接可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多肽與固體載體的連接方法來進(jìn)行。例如，對(duì)于蛋白質(zhì)/多肽與改性硅膠表面的連接而言，可以通過1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺[1-ethyl-3-(3-dimethylami-nopropyl)carbodiimide,EDC]和N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)的反應(yīng)將改性硅膠表面高分子鏈上的羧基(-COOH)基團(tuán)改為活化基團(tuán)，該活化基團(tuán)可與蛋白/多肽上所帶的氨基(-NH2)反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)將蛋白/多肽固定于固體載體表面。對(duì)于點(diǎn)樣時(shí)使用的點(diǎn)樣液中多肽的濃度沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依常規(guī)選擇，優(yōu)選為1μg～1000μg/mL，更優(yōu)選10μg～500μg/mL。此外，對(duì)于多肽在固體載體上分布的密度沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依常規(guī)選擇，優(yōu)選為1～100點(diǎn)/10mm2，更優(yōu)選5～50點(diǎn)/10mm2。在本說明書中，“獨(dú)立的”是指：該多肽在所述固體載體上形成一個(gè)點(diǎn)，該點(diǎn)中不包含對(duì)檢測(cè)有影響的量的其他多肽，優(yōu)選僅包含該多肽。本發(fā)明的試劑盒中的固體載體可以是一個(gè)，也可以是多個(gè)，優(yōu)選為兩個(gè)以上。該試劑盒還可以包括：1.配好的血清稀釋液或血清稀釋液組分溶液：血清稀釋液，例如有北京賽馳生物科技有限公司的樣本稀釋液(產(chǎn)品編號(hào)070021-S2)、鄭州博威嘉生物科技有限公司的加樣變色樣本稀釋液(產(chǎn)品編號(hào)bwj010103)等。該血清稀釋液用來稀釋血清，試劑盒檢測(cè)的血清要稀釋適當(dāng)倍數(shù)，例如2～200倍，優(yōu)選10～100倍。該試劑盒還可以包括：2.濃縮洗液：固體載體表面孵育血清及酶標(biāo)二抗后，需用洗液清洗掉固體載體表面未結(jié)合的抗體和酶標(biāo)二抗。濃縮洗液例如是1％的吐溫20水溶液，使用時(shí)需稀釋2～40倍、優(yōu)選5～20倍。該試劑盒還可以包括：3.酶標(biāo)二抗溶液：人腸道病毒71型感染者血清中的IgM與固體載體(例如SJ改性硅膠)上的多肽集合I中的多肽結(jié)合，酶標(biāo)二抗可與IgM結(jié)合，而酶標(biāo)二抗上的標(biāo)記物可與發(fā)光底物反應(yīng)，從而發(fā)出可檢測(cè)的光。酶標(biāo)二抗可以是例如辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgM。對(duì)酶標(biāo)二抗在酶標(biāo)二抗溶液中的濃度沒有特殊限制，可以是例1ng～1000ng/mL。該試劑盒還可以包括：4.發(fā)光液組分溶液：發(fā)光液可與酶標(biāo)二抗上標(biāo)記的辣根過氧化物酶反應(yīng)，使得反應(yīng)發(fā)出儀器可檢測(cè)到的化學(xué)光。發(fā)光液由兩種溶液混合而成，分別是A液—過氧化氫溶液，及B液—發(fā)光氨溶液。發(fā)光氨(魯米諾)只有用氧化劑處理過才會(huì)發(fā)光。通常使用雙氧水和一種氫氧化物堿的混合水溶液作為激發(fā)劑。在辣根過氧化物酶催化下，雙氧水分解為氧氣和水：2H2O2→O2+2H2O魯米諾與氫氧化物反應(yīng)時(shí)生成了一個(gè)雙負(fù)離子，它可被過氧化氫分解出的氧氣氧化，產(chǎn)物為一個(gè)有機(jī)過氧化物。該過氧化物很不穩(wěn)定，立即分解出氮?dú)猓杉ぐl(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸。激發(fā)態(tài)至基態(tài)轉(zhuǎn)化中，釋放的能量以光子的形式存在，波長(zhǎng)位于可見光的藍(lán)光部分。發(fā)光液組分溶液的例子例如ThermoSeientific公司的ELISAFemtoMaximumSensitivitySubstrate，貨號(hào)37074。該試劑盒還可以包括：5.一個(gè)或者兩個(gè)以上的生物孵育反應(yīng)器，根據(jù)需求可以采用例如雙面的生物孵育反應(yīng)器，中國專利ZL201120177686.3或者ZL201110142518.5；或者單面的生物孵育反應(yīng)器ZL201220430886.x。該試劑盒還可以包括：6.其他用于檢測(cè)人腸道病毒71型感染的檢測(cè)分子(例如多肽、蛋白質(zhì)、核酸等)。該試劑盒還可以包括：7.使用說明書。該試劑盒還可以包括：8.連接于所述一個(gè)或多個(gè)固體載體、或其他獨(dú)立的固體載體上的陽性質(zhì)控點(diǎn)(可采用例如是人IgM作為陽性質(zhì)控點(diǎn))和/或陰性質(zhì)控點(diǎn)(例如磷酸緩沖液，簡(jiǎn)稱PB)。檢測(cè)方法在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種檢測(cè)受試者是否為人腸道病毒71型感染的方法(本發(fā)明的檢測(cè)方法)，該方法包括：使用上述本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)所述多肽集合I中的多肽對(duì)受試者來源的血液樣本中的腸道病毒71型抗體IgM是否有響應(yīng)；當(dāng)檢測(cè)到所述多肽集合1中的任一個(gè)或一個(gè)以上多肽對(duì)受試者來源的血液樣本中的腸道病毒71型抗體IgM有響應(yīng)時(shí)，判定該受試者為腸道病毒71型感染患者，從而用于手足口病的輔助診斷。在本說明書中，“響應(yīng)”是指：信噪比(SNR)大于或等于2，其中，信噪比＝(多肽點(diǎn)信號(hào)值-陰性對(duì)照點(diǎn)信號(hào)值)/陰性對(duì)照點(diǎn)信號(hào)值。本說明書中，對(duì)本發(fā)明的試劑盒的陽性反應(yīng)是指：受試者來源的血液樣本滿足上述判據(jù)；否則為陰性反應(yīng)。所述血液樣本可以為全血、血漿或血清。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述受試者可以為具有手足口病臨床癥狀的受試者。在本發(fā)明中，手足口病臨床癥狀具體表現(xiàn)為發(fā)熱和手、足、口腔等部位有皮疹或皰疹。實(shí)施例1.多肽的制備與確認(rèn)實(shí)施例中使用的多肽由吉爾生化(上海)有限公司合成，并通過質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行了確認(rèn)。其中，SEQIDNO：1(SLDFALSLLRRNIRQVQTDQ)，分子量為2373；SEQIDNO：2(APTGQNTQVSSHRLDTGKVP)，分子量為2093；SEQIDNO：3(AREKVEFLNNLKQLPLLENQ)，分子量為2396；SEQIDNO：4(GHFTMLGVRDRLAVLPRHSQ)，分子量為2289。2.試劑盒的制備檢測(cè)芯片是以SJ改性硅膠(iPDMS薄膜)為固體支撐材料，在其上通過點(diǎn)樣固定多肽溶液制備而成。SJ改性硅膠是在傳統(tǒng)的聚二甲基硅氧烷材料中加入帶烯烴末端的、表面引發(fā)聚合反應(yīng)的引發(fā)劑，并通過熱交聯(lián)(硅氫鍵鍵合)固定到聚二甲基硅氧烷的三維結(jié)構(gòu)中，得到一種新的材料即SJ改性硅膠。其制作過程參見國際專利公開WO2014/044184。制好的SJ改性硅膠薄膜可保存在4℃冰箱中。采用PersonalArrayerTM16個(gè)人點(diǎn)樣儀在改性硅膠上制備多肽微陣列(即檢測(cè)芯片)，過程為：1)預(yù)處理將SJ改性硅膠薄片(15×15mm2)浸泡在活化液中，30min后取出用去離子水淋洗3次，用氮?dú)獯蹈?，馬上用于點(diǎn)樣。2)點(diǎn)樣將點(diǎn)樣液稀釋好并轉(zhuǎn)移到384孔板相應(yīng)的微孔中，將帶樣本的384孔板置于點(diǎn)樣儀基臺(tái)上，同時(shí)將預(yù)處理的改性硅膠薄片置于點(diǎn)樣儀的基臺(tái)上，馬上進(jìn)行點(diǎn)樣。點(diǎn)樣環(huán)境條件為室溫(25℃)，濕度設(shè)定為50％。將下述多肽在SJ改性硅膠薄片上點(diǎn)成微陣列，多肽集合I中每個(gè)多肽點(diǎn)樣一個(gè)點(diǎn)，另外點(diǎn)樣一個(gè)人IgM點(diǎn)作為陽性質(zhì)控點(diǎn)以及一個(gè)PB點(diǎn)作為陰性質(zhì)控點(diǎn)。制成的多肽微陣列上每個(gè)點(diǎn)的點(diǎn)樣量約為0.6nL，樣點(diǎn)半徑為200μm。這里，試劑盒的改性硅膠薄片上點(diǎn)樣的多肽集合1具體如下：SEQIDNO：1所示的多肽；SEQIDNO：2所示的多肽；SEQIDNO：3所示的多肽；和SEQIDNO：4所示的多肽；3)化學(xué)固定剛制好的多肽微陣列要放在恒溫恒濕箱(26℃,60％濕度)中固定至少6h。化學(xué)固定過程參見國際專利公開WO2014/044184。首先通過點(diǎn)樣儀將包含有捕獲多肽分子的緩沖液點(diǎn)在改性硅膠薄膜上，接著緩沖液開始蒸發(fā)，捕獲多肽分子與SJ改性硅膠表面親密接觸并相互作用，通過化學(xué)結(jié)合，改性硅膠表面的ploy(OEGMA)高分子的末端-COOH與多肽分子的-—NH2形成穩(wěn)定共價(jià)鍵，進(jìn)而將有化學(xué)活性的多肽分子固定在SJ改性硅膠表面。4)裝配固定6h的多肽微陣列必須在兩天內(nèi)裝配好。首先通過背膠將SJ改性硅膠薄片貼在專門的反應(yīng)柱上，蓋上反應(yīng)腔體。生物孵育反應(yīng)器可以根據(jù)需求采用雙面生物孵育反應(yīng)器，即，一個(gè)反應(yīng)器由兩個(gè)反應(yīng)柱和一個(gè)反應(yīng)腔體組成，或者單面生物孵育反應(yīng)器，即，一個(gè)反應(yīng)器由一個(gè)反應(yīng)柱和一個(gè)反應(yīng)腔體組成。5)保存裝配好的多肽微陣列，需要抽真空密封，保存在4℃的冰箱中，備用。3.用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)檢驗(yàn)步驟檢驗(yàn)步驟1)平衡試劑溫度：將所有試劑平衡至室溫。2)洗液的配制：將濃縮洗液用純化水或蒸餾水按1:9稀釋，例如：450mL純化水或蒸餾水中加入50mL濃縮洗液，充分混勻。未使用完的洗液放在2～8℃保存,可保存3個(gè)月。3)樣品的稀釋：將待測(cè)樣品用血清稀釋液按1:100稀釋(如：2μL血清加入到198μL血清稀釋液，充分混勻)。一次樣品檢測(cè)需要稀釋后的樣品200μL。4)潤(rùn)濕芯片：取出檢測(cè)所需的生物芯片孵育反應(yīng)器。加入1mL洗液，浸潤(rùn)芯片表面3分鐘。棄去浸泡芯片的洗液。5)加樣：在本實(shí)施例中，以單面生物孵育反應(yīng)器加樣，使用移液槍將稀釋好的待測(cè)樣品通過加液通氣孔(兩個(gè)中任意一個(gè))加入單面生物孵育反應(yīng)器中，每個(gè)單面生物孵育反應(yīng)器加200μL，用密封貼封閉加液通氣孔(兩個(gè))。6)樣品孵育：將加完樣的單面生物孵育反應(yīng)器置于水平搖床上150rpm，室溫孵育30分鐘。7)清洗：將反應(yīng)柱從單面生物孵育反應(yīng)器的反應(yīng)腔體中取出，棄去反應(yīng)器內(nèi)液體，反復(fù)沖洗反應(yīng)柱頂部芯片表面和反應(yīng)腔體內(nèi)部3次(每次約用12mL洗液，沖洗1-2分鐘)。8)酶標(biāo)抗體孵育：將反應(yīng)柱與反應(yīng)腔體重新組合，卡緊。揭去密封貼，每個(gè)單面生物孵育反應(yīng)器加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgM溶液200μL。重新用密封貼封閉加液通氣孔。置于搖床上150rpm，室溫孵育30分鐘。9)再清洗：棄去反應(yīng)腔體，用洗液仔細(xì)清洗芯片表面3次。10)加入發(fā)光液：每個(gè)芯片表面分別加入30μL發(fā)光液，使發(fā)光液能均勻的鋪于芯片表面11)芯片成像：將加入了發(fā)光液的芯片用化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行曝光1分鐘成像。作為化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)時(shí)，沒有特殊限制，使用例如天能5500型微陣列成像儀、偲捷牌TN5500型微陣列成像儀或偲捷牌CLEAR4000型微陣列成像儀等均可。結(jié)果判定：對(duì)于每一份血清，分別統(tǒng)計(jì)試劑盒中的每一條多肽是否有響應(yīng)(即，信噪比(SNR)大于等于2)，并根據(jù)上述“檢測(cè)方法”部分中所描述的判據(jù)進(jìn)行判定。即，當(dāng)檢測(cè)到所述多肽集合1中的多肽中的任一個(gè)或一個(gè)以上對(duì)受試者來源的血液樣本中的腸道病毒71型抗體IgM有響應(yīng)，判定該受試者為腸道病毒71型感染患者，即手足口病感染患者。其中，信噪比＝(多肽點(diǎn)信號(hào)值-陰性對(duì)照點(diǎn)信號(hào)值)/陰性對(duì)照點(diǎn)信號(hào)值。多肽點(diǎn)信號(hào)值是指成像儀配套軟件讀取的多肽點(diǎn)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值，陰性對(duì)照點(diǎn)信號(hào)值是指成像儀配套軟件讀取的陰性對(duì)照點(diǎn)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值。實(shí)施例對(duì)收集到臨床血清240份，采用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)結(jié)果與采用傳統(tǒng)金標(biāo)準(zhǔn)法-核酸檢測(cè)法(采用Takara的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所示。表1本發(fā)明的試劑盒與采用Takara的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的比準(zhǔn)確率＝(118+113)/240×100％＝96.3％靈敏度＝118/124×100％＝95.2％特異性＝113/116×100％＝97.4％假陽性＝3/116×100％＝2.6％以上結(jié)果表明，本發(fā)明用于檢測(cè)手腸道病毒71型感染具有良好的準(zhǔn)確性，靈敏度和特異性，適用于腸道病毒71型感染的病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室輔助檢測(cè)，且操作簡(jiǎn)單，適合各級(jí)醫(yī)療和疾控部門使用。作為對(duì)比，對(duì)于上述4條多肽中的任一條，按照國際專利公開WO2014/044184實(shí)施例部分的標(biāo)題4的描述制備了檢測(cè)器件，使用上述240份血清樣本，按照國際專利公開WO2014/044184實(shí)施例部分標(biāo)題3的描述進(jìn)行了檢測(cè)，在SNR＝2的情況下，結(jié)果顯示上述4條多肽單獨(dú)檢測(cè)手足口病感染中的IgM抗體時(shí)的靈敏度均在35.2％～80.6％之間，(見表2)不能滿足作為檢測(cè)試劑盒的要求。表24條多肽在240份血清中的靈敏度結(jié)果單位:％序列號(hào)1234腸道病毒71型檢出率80.635.267.575.1以上，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但并不是對(duì)本發(fā)明技術(shù)范圍的限定。通過本說明書的記載，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易的對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修飾/改變，這些包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。序列表<110>中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所<120>用于檢測(cè)腸道病毒71型IgM抗體的試劑盒及檢測(cè)方法<130>SJ-EV-1224-1<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>腸道病毒71型抗原性多肽<400>1SerLeuAspPheAlaLeuSerLeuLeuArgArgAsnIleArgGlnVal151015GlnThrAspGln20<210>2<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>腸道病毒71型抗原性多肽<400>2AlaProThrGlyGlnAsnThrGlnValSerSerHisArgLeuAspThr151015GlyLysValPro20<210>3<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>腸道病毒71型抗原性多肽<400>3AlaArgGluLysValGluPheLeuAsnAsnLeuLysGlnLeuProLeu151015LeuGluAsnGln20<210>4<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>腸道病毒71型抗原性多肽<400>4GlyHisPheThrMetLeuGlyValArgAspArgLeuAlaValLeuPro151015ArgHisSerGln20